Abstract
Stroke Forschung hat viele Rückschläge bei der Übersetzung neuroprotektive Therapien in die klinische Praxis ausgehalten. Im Gegensatz dazu die reale Therapie (tPA Thrombolyse) selten produziert Vorteile in mechanischen Verschluss-basierten experimentellen Modellen, die präklinische Schlaganfallforschung dominieren. Diese Spaltung zwischen der Bank und Nacht schlägt vor, die Notwendigkeit, die tPA-responsive Modelle in präklinische Schlaganfallforschung beschäftigen. Zu diesem Zweck ist ein einfacher und tPA-reaktiven thrombotischer Schlaganfall-Modell erfunden und hier beschrieben. Dieses Modell besteht aus transienten Okklusion der einseitigen Arteria carotis communis und die Lieferung von 7,5% Sauerstoff über eine Gesichtsmaske in erwachsenen Mäusen für 30 min, während die Tier rektale Temperatur bei 37,5 ± 0,5 ° C. Obwohl reversible Ligation des einseitigen Karotis oder Hypoxie jeweils drückt zerebralen Blutfluß nur vorübergehend, die Kombination beider Beleidigungen verursacht dauerhafte Reperfusion Defiziten, Fibrin und die Blutplättchenablagerung und große Infarct in der A. cerebri media versorgten Gebiet. Wichtig ist, dass Schwanzvenen-Injektion von rekombinantem tPA bei 0,5, 1, oder 4 Stunden nach der THI (10 mg / kg) bereitgestellt zeitabhängige Verringerung der Sterblichkeit und die Infarktgröße. Diese neue Hub-Modell ist einfach und kann in Laboren standardisiert auf experimentellen Ergebnissen zu vergleichen. Ferner induziert es Thrombose ohne Kraniektomie oder zu vorgeformten Embolien. Angesichts dieser einzigartigen Verdienste ist die THI-Modell eine sinnvolle Ergänzung zum Repertoire präklinische Schlaganfallforschung.
Introduction
Thrombolyse und Rekanalisation ist die effektivste Therapie des akuten ischämischen Schlaganfalls in der klinischen Praxis 1. Dennoch war die Mehrheit der präklinischen Forschung Neuroprotektion in einem transienten Mechaniker Obstruktion Modell (intraluminale Naht mittleren Hirnarterie), die schnelle Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach dem Entfernen des Gefäßverschlusses erzeugt und zeigt wenig bis keine Vorteile tPA Thrombolyse durchgeführt. Es wurde vorgeschlagen, dass die zweifelhaften Wahl der Taktmodelle beigetragen, zumindest teilweise auf die Schwierigkeit bei der Übersetzung neuroprotektive Therapie für die Patienten 2,3. Daher gibt es eine zunehmende Forderung nach Einsatz tPA-responsive thromboembolischen Schlaganfall-Modelle in der präklinischen Forschung, aber solche Modelle haben auch technische Probleme (siehe Diskussion) 4-7. Hier beschreiben wir eine neue thrombotischer Schlaganfall-Modell auf Grund einseitiger transiente hypoxischischämischer (THI) Beleidigung und ihre Reaktionen auf intravenöse tPA-Therapie 8.
Die THI Schlaganfall-Modell wurde auf der Grundlage des Verfahrens Levine (dauerhafte Unterbindung der einseitigen Halsschlagader, gefolgt von der Exposition gegenüber transiente Hypoxie in einer Kammer), die für Versuche mit erwachsenen Ratten im Jahr 1960 9 erfunden wurde entwickelt. Die ursprüngliche Levine Verfahren in Vergessenheit geraten, weil nur erzeugt variable Hirnschäden, aber das gleiche Beleidigung verursacht konsequente Neuropathologie in Nagetier Welpen, als es von Robert Vannucci und seine Kollegen als ein Modell der neonatalen hypoxischischämischer Enzephalopathie (HIE) 1981 10 wieder eingeführt. In den letzten Jahren einige Ermittler neu adaptierte das Levine-Vannucci Modell erwachsener Mäuse durch Einstellen der Temperatur in der hypoxischen Kammer 11. Es ist plausibel, dass die im Widerspruch Hirnläsionen in der ursprünglichen Levine Verfahren kann von schwankenden Körpertemperaturen von erwachsenen Nagetieren in der hypoxischen Kammer auftreten. Um diese Hypothese zu testen, modifizierten wir die Levine Verfahren durch Verabreichung hypoxischen Gasdurch eine Gesichtsmaske, während die Nagetierkerntemperatur bei 37 ° C auf dem OP-Tisch 12. Wie erwartet, strenge Kontrolle der Körpertemperatur stark die Reproduzierbarkeit der HALLO-induzierte Gehirnpathologie erhöht. Die HALLO Beleidigung löst auch Koagulation, Autophagie und Grau und weißen Substanz Verletzungen 13. Andere Forscher haben auch die HALLO-Modell, um nach Schlaganfall Entzündungsreaktionen 14 zu untersuchen.
Ein einzigartiges Merkmal des HALLO Schlaganfall-Modell ist, dass es genau das Virchow-Trias der Thrombusbildung, einschließlich der Stauung des Blutflusses, Endothelverletzung (zB aufgrund von HALLO-induzierten oxidativen Stress) und Hyperkoagulabilität (HALLO-induzierte Blutplättchen-Aktivierung) (folgt 1A) 15. Als solches kann die HALLO-Modell einige pathophysiologischen Mechanismen relevant, um reale ischämischen Schlaganfall zu erfassen. Mit dieser Idee im Hinterkopf, haben wir weiter verfeinert die HALLO-Modell mit reversible Ligation des unilateral Arteria carotis communis (also um einen transienten HALLO Insult zu schaffen) und testete seine Antworten auf tPA Thrombolyse mit oder ohne Edaravone. Edaravone ist ein Radikalfänger in Japan bereits genehmigt, um ischämischen Schlaganfall innerhalb von 24 Stunden nach Auftreten 9 zu behandeln. Unsere Experimente zeigten, dass so kurz wie 30 Minuten Transienten HALLO löst thrombotischen Infarkt, und das kombinierte tPA-Behandlung verleiht Edaravone Synergieeffekte 8. Hier beschreiben wir detailliert chirurgischen Verfahren und methodologischen Überlegungen des THI-Modell, das verwendet werden kann, um Reperfusion Behandlungen von akutem ischämischem Schlaganfall zu optimieren.
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Protocol
Dieses Protokoll wird von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Emory University zugelassen und folgt den National Institutes of Health der Leitlinie für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Setup-
- Vorbereitung des chirurgischen Bett auf Erwärmung Pad mit Wärmepumpe bei 37 ° C für mindestens 15 min vor der Operation verbunden sind. Legen Sie eine Nackenrolle mit dem Lauf 3-ml-Spritze auf dem OP-Bett. Bereiten Sie das Anästhesiegas mit 2% Isofluran in der medizinischen Luft.
- Bereiten autoklaviertem Zangen, Scheren, Nadelhalter Mikro, Gefäßklemme, Wattestäbchen und Nähte. Bereiten Gewebekleber und Augensalbe.
- Einrichten des Hypoxie-System und Temperaturregler mit Wärmelampe und rektale Sonde. Bereiten Hypoxie Gas mit 2% Isofluran in 7,5% O 2 von 92,5% N 2 ausgeglichen.
- Eine Stunde vor der Operation werden die Mäuse durch eine subkutane Injektion einer langsamen Freisetzung: Meloxicam (4,0 mg / kg) analgesized.
- Betäuben 10-13 Wochen alten männlichen C57BL / 6-Mäuse mit einem Gewicht von 22 bis 30 g in der Narkose Kammer mit 3% Isofluran, bis das Tier nicht reagiert zu Fuß Squeeze, und entfernen Sie die Haare auf der rechten Hals mit Hilfe eines elektronischen Rasierer.
- Platzieren Mäuse auf dem chirurgischen Bett mit 2% Isofluran in medizinischer Luft mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 L / min verbunden. Sichere Vorderbeine gestreckt entlang Nackenrolle an den Seiten mit einem Pflaster.
- Reinigen Sie die Operationsstelle für Schnitt mit betadine gefolgt von Alkohol und Wattestäbchen.
- Unter Binokular, Machen Sie einen 0,5 cm rechten Hals-Schnitt mit einem geraden Pinzette und ein Mikro Schere etwa 0,2 cm seitlich von der Mittellinie der Haut.
- Verwenden Sie ein Paar fein gezackten Pinzette auseinander die Faszie und Gewebe zu ziehen, um die rechte Arteria carotis communis (RCCA) aussetzen. Sorgfältig trennen die RCCA vom Vagusnerv unter Verwendung eines Paares von feinen glatten Pinzette.
- Live-Knoten zwei vorgeschnittene 5-0 Seidennaht (lösbare) auf der RCCA und nähen Sie dann die Haut mit 4-0 Nylon Monofilamentnahtmaterial (Abbildung 1c).
- Bewerben Augensalbe auf beiden Augen bis zur Trockenheit zu verhindern.
- Schnell übertragen die Mäuse auf Hypoxie-System und setzen Nase und Mund in Gesichtsmaske mit 2% Isofluran in 7,5% O 2 bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 bis 1 l / min für 30 min.
- Bei Hypoxie Verwenden Temperaturregler mit Heizlampen, die rektale Temperatur bei 37,5 ± 0,5 ° C zu steuern. Überwachen Sie die Atemfrequenz bei 80-120 Atemzüge / min. Die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur über 37 ° C während der Hypoxie die Konsistenz der Hirninfarkt erstellen. Niedrige Atemfrequenz geschieht in der Regel nach 20 min Hypoxie. Entfernen Sie die Gesichtsmaske und lassen normale Luftzufuhr, wenn die Atemfrequenz unter bis 40. Das dauert 1-2 Minuten und nicht in die 30 min Hypoxie Dauer zu zählen.
- Nach Hypoxie, zu übertragenMäuse auf eine chirurgische Bett und lassen Sie die beiden Fäden aus RCCA. Schließen Sie die Wunde mit Gewebekleber, und zurück in den Käfig Mäuse dann. Schließen Sie die Tiere, wenn beide von zwei Live-Knoten unerwartet nach Hypoxie freigegeben.
- Überwachen Sie die Mäuse für 5-10 Minuten, um von Hypoxie und Anästhesie zu erholen. Setzen Sie den benetzten Essen im Käfig und senden es an Tierstation.
Hinweis: Tiere, die leichte bis schwere Drehverhalten bei 24 Stunden nach THI mit Gehirn Verletzung korreliert. Die meisten Tiere mit Anfallssymptome sterben, bevor der 24-Stunden-Zeitpunkt nach THI.
3. Laser Speckle Contrast Imaging
Anmerkung: Obwohl dies nicht ein wesentlicher Vorgang des THI-Modell kann eine zweidimensionale Laser-Speckle Kontrastbildgebungssystem 16 verwendet werden, um die Änderungen des zerebralen Blutflusses (CBF) während oder nach transienter Hypoxie-Ischämie zu charakterisieren. Um die Veränderungen des CBF unter Thi unmittelbar nach der st dokumentieren, Rekordep 2.6. Alternativ zu CBF Erholung nach THI Beleidigung zu vergleichen, diese Verfahren nach dem Schritt 2.10 durchgeführt werden.
- Ein anästhesierten Maus in die Bauchlage und führen eine 1 cm lange Inzision auf die Kopfhaut mit dem Schädel belichtet, jedoch ungeöffnet.
- Überwachen CBF in beiden Gehirnhälften unter einem Blutfluss Imager nach Herstellerprotokoll und starten Sie die Aufzeichnung der Hirndurchblutung unmittelbar nach dem CCAO Operation (Schritt 2.6). Fahren Sie für 50 min.
- Die ausgewählten Bereiche mit der MoorFLPI Software nach den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2) zeigen CBF-Bild mit beliebigen Einheiten in einem 16-Farbpalette und in Echtzeit zu analysieren.
- Nach Aufzeichnung der CBF Bild, schließen Sie die Kopfhaut mit Gewebekleber und senden Sie das Tier in den Käfig.
4. tPA Verwaltung
- Injizieren Tiere am Schwanzvene mit dem Lösungsmittel oder 10 mg / kg rekombinanten tPA (220-300 &# 956; l von 1 mg / m tPA) bei 0,5, 1, oder 4 h nach tCCAo zuzüglich Hypoxie (Abbildung 4).
5. Brain Damage Erkennung mit verschiedenen Optionen
Hinweis: Um die Gehirnproben zu sammeln, einschläfern die Mäuse bei 1, 4 oder 24 Stunden nach der THI.
- Führen Quantifizierung der Infarktvolumen von in-vivo-2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Verfahren bei 24 Stunden nach der THI Beleidigung als vorherige beschrieben. 17
- Intraperitoneal injizieren Tiere mit 1,4 M Mannit-Lösung (~ 0,1 ml / g Körpergewicht) 30 Minuten vor transkardialer Perfusion. Transkardialer perfuse Mäuse mit PBS, gefolgt von 10 ml 2% TTC.
- Entfernen Sie das Gehirn von Tieren, die mit chirurgischen Instrumenten nach 10 Minuten aufnehmen und in 4% Paraformaldehyd für die Fixierung über Nacht und Abschnitt in 1 mm Dicke mit einem Vibratom.
- Machen Sie ein Reihe von vier geschnittene Gehirn gleitet durch Digital-Mikroskop und quantify das Infarktvolumen als das Verhältnis der Infarktfläche (weißer Bereich in der rechten Seite), um den Bereich der unbeschädigt ist, mit der kontralateralen Hemisphäre ImageJ Software.
- Alternativ führen Thrombosebildung durch Immunfluoreszenz bei 1 Stunde nach THI Beleidigung.
- Frieren Sie den festen Gehirn in OCT-Verbindung und Abschnitt die Gehirne bei 12 & mgr; m Dicke mit Hilfe eines Kryostaten.
- Inkubieren des Gehirns Schlitten mit Kaninchen-anti-Fibrinogen-Antikörper (1: 100) gefolgt von Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluro 488 Farbstoff (1: 200), um die Fluoreszenz an einem Fluoreszenzmikroskop zu beobachten.
- Alternativ führen Gefäß Behinderung durch Schwanzveneninjektion von 100 ul 2% Evans-Blau-Farbstoff in 4 Stunden nach THI Beleidigung.
- Euthanize die Mäuse und schnell geschnitten Kopf, um Gehirn nach Evans blue Injektion in 4% Paraformaldehyd zu entfernen. Hinweis: Es dauert 5-10 Minuten für Evans blue Zirkulation mit blauer Farbe sowohl von Vorder- und Hinterbeine.
- Abschnitauf festen Gehirn bei 100 & mgr; m Dicke mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms und beobachten Sie die Fluoreszenz unter Verwendung eines 680 nm Emissionsfilter auf einem Fluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Zweidimensionale Laserfleckenkontrast-Bildgebung (LSCI) 16 wurde verwendet, um die Änderungen des zerebralen Blutflusses (CBF) durch 30-minütiges transienten einseitige Carotisokklusion (tCCAO), 30 min Einwirkung von Hypoxie (7,5% Sauerstoff) und 30 min einseitigen Vergleichs Karotis-Ligation unter Hypoxie (THI). Dieses Experiment zeigte, dass unter Normoxie tCCAO drückte die CBF auf der Carotis, ligiert Hemisphäre zu ~ 50% des Ausgangswertes, der schnell auf über 85% nach dem Lösen der Carotisokklusion (R in Figur 2A) zurückgewonnen. Die Exposition gegenüber systemischen Hypoxie allein reduziert die CBF auf ca. 75% des Ausgangswertes, der vorübergehend Rebound, ~ 130% nach der Rückkehr in die Atmosphäre normoxischen (2B). Im Gegensatz carotis Ligierung unter Hypoxie (THI) schnell reduziert CBF im ipsilateralen Hemisphäre auf weniger als 20% über dem Ausgangswert etwa 10 min, der selten auf über 30% bei 20 min nach dem Lösen der Hals ligatio gewonnenn und Zurückkehren zu Normoxie. CBF auf der kontralateralen Hemisphäre (L), jedoch schwankte zwischen 20 und 50% während der Hypoxie und schnell nach dem THI Insult (2C) kehrte zu über 80%.
Bei 24 Stunden nach tCCAo (30 min) oder tCCAO plus 30 min Hypoxie (THI), wurde in vivo TTC-Färbung verwendet werden, um Infarkt 17 zu erkennen. Diese Analyse zeigte keine offensichtliche Schädigung des tCCAO Beleidigung, aber ansehnliche Infarkt in der A. cerebri media versorgten Gebiet folgende Thi Beleidigung (3A). Anti-Fibrin (ogen) Immunfärbung wurde verwendet, um die tCCAO- und Thi-verletzten Gehirn bei 1 Stunde Erholung Vergleichen und zeigten weit verbreitete Ablagerung von Fibrin (ogen), ein Indikator für die Thrombose, in der THI-verletzt, aber nicht in Frage gestellt tCCAO-Maus Gehirn (3B, C). Schwanzveneninjektion von Evans-Blau-Farbstoff wurde auch verwendet, um Gefäßdurchblutung tCCAO- und Thi-verletzten Gehirn zu 4 Stunden Wiederherstellung zu vergleichen. Diese Analyse zeigte, verminderned Hirndurchblutung und intensiver Extravasation von Evans-Blau-Farbstoff in Thi-verletzt, aber nicht die tCCAO fordert Gehirn der Maus (Abbildung 3D, E).
Schließlich werden die Ergebnisse der Thi Insult in Mäusen, die Schwanzvenen-Injektion von Vehikel (0,5 h Rückgewinnung) oder rekombinanten menschlichen tPA (Activase, 10 mg / kg, 0,5, 1, oder 4 Stunden nach der THI) wurden unter Verwendung von im Vergleich vivo TTC-Färbung bei 24 Stunden Wiederherstellung (4A). In Vehikel-behandelten Mäusen, die Mortalitätsrate bei 24 Stunden nach der THI war 23,8% und nur eine in 21 THI-verletzten Mäusen über den mittleren und 2 SD (der Ausreißer) war. Die 24 Stunden Sterblichkeit in Mäusen, die tPA-Behandlung bei 0,5 Stunden Erholung sank auf 8,3%, aber dieser Effekt ging verloren, als tPA wurde auf 1 oder 4 Stunden nach der THI Beleidigung (4B) verwaltet. 4C aufgetragen die Infarktgröße aller überlebten Mäuse, die in den vier Behandlungsgruppen. Zu beachten ist, beide 0,5 und 1 Std tPA-Verwaltung significantly reduzierte die Infarktgröße im Vergleich zu Vehikelbehandlung. Die 0,5 Stunden tPA-Behandlungsgruppe zeigte auch eine deutlich reduzierte Infarktgröße als die 4 Stunden tPA-Behandlungsgruppe. 4D gezeigt, Vertreter TTC-Färbung Ergebnisse nach jeder Behandlung.
Abb. 1: Verfahren der vorübergehenden zerebralen Hypoxie-Ischämie (THI) Beleidigung in erwachsenen Mäusen (A) Die Virchow-Trias, die Thrombose treibt umfasst Stauung des Blutflusses, Endothelverletzung und Hyperkoagulabilität des Blutes. (B) eine schematische Darstellung des THI Schlaganfall Verfahren. Zwei lösbare Knoten wurden auf die rechte gemeinsame Halsschlagader (CCA) gebunden, gefolgt durch Lieferung von 7,5% Sauerstoff über einen Nasenkegel 30 min, während die Maus rektale Temperatur wurde bei 37-38 ° C gehalten. Nach der transient systemischer Hypoxie das CCA Ligation wurde durch Herausziehen eines Endes der lösbaren Naht Knoten freigegeben. MCA, A. cerebri media; ICA, A. carotis interna; ECA, A. carotis externa; CCA, Halsschlagader. (C) Chirurgische Verfahren zur transienten rechten CCA Okklusion. 1. Zwei Vorschnitt Naht (# 1 und # 2) wurden unter einer isolierten rechten CAA gegeben. 2. Zwei lösbare Knoten vorgenommen. 3. Die Schnittführung wurde von Naht # 3 geschlossen. Stellen Sie sicher, dass die Enden des Fadens # 1 und # 2 waren ansprechbar außerhalb der Schnittführung. 4. Ziehen Sie vorsichtig Naht # 1 und # 2 von außen, um die CCA freizugeben. Wenn sanft durchgeführt wird, wird dieses Verfahren nicht dazu führen, Platzwunde des CCA.
Fig. 2: Analyse der zerebralen Durchblutung Veränderungen während und nach Thi Insult ein zweidimensionales Laserfleckenkontrast-Bildgebung (LSCI) System wurde verwendet, um Hirndurchblutung (CBF) zu bewerten. R (rechts) zeigt die Carotis-ligierten Hemisphäre; L (links) ist der kontralateralen Hemisphäre. (A) tCCAO unter Normoxie drückt CBF zu ~ 50% der Grundlinienwert auf der Carotis-ligierten Hemisphäre (R) für mindestens 30 min, was über 85% innerhalb von 3 min bei Freigabe der Carotis Ligierung gewonnen. (B) In Hypoxie (7,5% Sauerstoff, 30 min), ohne Halsschlagader-Ligation sank CBF auf 76% des Ausgangswertes und transient nach der Rückkehr in Normoxie erholte sich um rund 130%. (C) In transienten carotis Ligierung unter Hypoxie (thi, 30 min), CBF auf der Carotis-ligiert (R) Hemisphäre schnell auf weniger als 20% über dem Ausgangswert, und es selten mehr als 30% bei der Freisetzung des zurückgewonnenen Karotis-Ligation und der Rückkehr in Normoxie. Demgegenüber CBF auf der kontralateralen (L) Hemisphäre zwischen 20-50% schwankte während der Hypoxie und schnell wieder auf> 80% des AusgangsWert nach der Freigabe der Halsschlagligation und der Rückkehr in Normoxie. Dargestellt sind repräsentative CBF Kurven für n> 4 in jeder Gruppe. Die Zeitpunkte für die Vertreter LSCI Fotografien wurden von grauen Linien im repräsentativen Verfolgung markiert.
Abbildung 3: Hirninfarkt, spontan Thrombose und Gefäßverschluß nach Thi Insult (A) In-vivo-TTC-Färbung zeigte keine sichtbaren Infarkt bei 24 Stunden nach 30 min transienten Ligatur der rechten Arteria carotis communis (tCCAO), aber die Zugabe von. 30 min Hypoxie (7,5% Sauerstoff) um tCCAO erzeugt beträchtliche Infarkt im ipsilateralen Hemisphäre (Sternchen), meist in der mittleren zerebralen Arterie Zufuhrbereich. (B, C) Anti-Fibrin (ogen) Immunfärbung bei 1 Stunde nach der THI Beleidigung zeigten weit verbreitete Vorkommen in deripsilaterale Hemisphäre. Im Gegensatz dazu gab es keine Fibrin (ogen) Einlagen bei 1 Stunde nach dem tCCAo (30 min) Beleidigung (n> 4 für jeden). (D, E) Cerebrale Perfusion wurde durch Schwanzvenen-Injektion von Evans Blue-Farbstoff in 4 h nach tCCAO (30 min) oder Thi (30 min) Insult beurteilt. In post-tCCAO Gehirn, die meisten von den Blutgefäßen gefüllt Evans Blue-Farbstoff in der ipsilateralen Hemisphäre. Im Gegensatz dazu wird in post-Thi Gehirn, gefüllt Evan Blue-Farbstoff weniger Blutgefäße und wurde in das Parenchym (n> 3) zugespielt. Maßstab: 250 um.
Abbildung 4: Auswirkungen von tPA Thrombolyse in der THI Schlaganfallmodell (A) Überblick über Versuche, die Auswirkungen der intravenöse tPA Verwaltung (10 mg / kg) bei 0,5, 1, oder 4 Stunden nach der THI Beleidigung zu vergleichen.. (B) Zusammenfassung der Zahl der operierten Tiere, mortality in 24 Stunden nach der Beleidigung, Ausreißer (die Infarktgröße außerhalb der mittleren +/- 2 SD), und die Zahl der Tiere enthalten zum Vergleich der Infarktgröße. (C) Eine Quantifizierung zeigte eine gemittelte 32% Infarktvolumen in der Vehikelgruppe signifikante Reduzierung von Infarkt im Bereich von 0,5 h (16%) und 1 h (20%) -Gruppen (Gezeigt sind die Mittelwerte und SEM für jede Gruppe). Die p-Werte sind durch t-Test bestimmt. (D) Vertreter TTC-gefärbten Gehirn von Tieren, die von der THI Beleidigung herausgefordert und erhalten tPA-Behandlung bei der angegebenen Zeitpunkt nach der Verletzung wurden. In TTC-Färbung zeigte lebendes Gewebe rote Farbe; Infarktgewebe war blass.
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Discussion
Schlaganfall ist ein großes gesundheitliches Problem von wachsender Bedeutung für jede Gesellschaft mit einer alternden Bevölkerung. Weltweit ist Schlaganfall die zweithäufigste Todesursache mit einem geschätzten 5,9 Millionen tödlichen Ereignisse im Jahr 2010, das entspricht 11,1% aller Todesfälle 18. Schlaganfall ist die dritthäufigste Ursache für Behinderungen bereinigte Lebensjahre (DALYs) verloren global im Jahr 2010, die sich aus dem fünften Platz im Jahr 1990 19. Diese epidemiologischen Daten unterstreichen die Notwendigkeit von mehr wirksame Therapien der akuten (ischämischen) Schlaganfall. Trotz intensiver Forschung in der präklinischen neuroprotektive Behandlung bleibt jedoch tPA-Thrombolyse die einzige spezifische Therapie des akuten ischämischen Schlaganfalls, die von der Food and Drug Administration in den Vereinigten Staaten zugelassen ist, während zahlreiche einst vielversprechende neuroprotektive Mittel in Tierstudien in klinischen Studien gescheitert. Die Schwierigkeit bei der Übersetzung neuroprotektive Therapien in Patienten hat viele Faktoren, und der aktuelle Schwerpunkt liegt auf gute Labor practice, Meta-Analyse von mehreren Datensätzen, und der internationalen Zusammenarbeit, um die präklinische Schlaganfallforschung 20,21 verbessern. Allerdings gibt es eine Minderheitsmeinung darauf hindeutet, dass die Translations Schwierigkeit ist auf eine schlechte Wahl der mechanischen Gefäßverschluss Modelle (zB intraluminalen Naht MCA-Okklusion) in der Mehrzahl der präklinische Schlaganfallforschung bisher 2,3. Da mechanische Gefäßverschluss Modelle selten eine Thrombose zu induzieren und zerebrale Reperfusion tritt zu schnell nach der Freigabe von Ileus, diese Modelle nicht auf die Echt Wort Therapie (tPA Fibrinolyse) zu reagieren, noch eine geringe therapeutische Breite, wie sie bei Schlaganfallpatienten. Folglich ist die vorgeschlagene Abhilfe zu betonen, zumindest sind, thromboembolischen Schlaganfall-Modelle in der präklinischen Schlaganfallforschung 3.
Diese Empfehlung hat jedoch ihre Beschränkungen, weil Strom thromboembolischen Schlaganfall-Modelle (exogene Embolien Lieferung, MCA-Injektion von thrombin und photothrombosis) haben alle bestimmte technische Nachteile 4. Für die exogene Embolien Modell, intravaskuläre Infusion von Embolien führt zu erheblichen Schwankungen der Infarktgröße und Standort sowie unvorhersehbare Reaktionen auf tPA Thrombolyse aufgrund der Unterschiede in Gerinnsel Zubereitung 4,5. Direkte Injektion von Thrombin in die MCA Zweig erfordert Kraniektomie und seinen Nutzen für die Optimierung der Thrombolyse ist noch nicht bewiesen werden 4,6. Chemisch initiiert Thromboembolien basierend auf der systemischen Injektion eines lichtempfindlichen Farbstoff (zB Rose Bengal oder Erythrosin B) und Bestrahlung durch die freiliegenden Schädel produziert oft plättchen nur Aggregate, die nicht reagieren zu Thrombolyse 4,7. Zusammengenommen werden, besteht ein Bedarf an einfacheren und tPA-responsive thromboembolischen Modellen für vorklinische Forschung Schlaganfall.
Die THI Paradigma hat vier einzigartige Vorteile als thromboembolischen Schlaganfall-Modell. Erstens übte die THI Beleidigungendogenen Komponenten in situ Thromben bilden ohne die Hilfe von exogenen Chemikalien oder vorgeformten Embolien. Somit ist die Thrombusbildung in der THI-Modell stärker auf physiologischen Bedingungen. Zweitens reagiert die Thi Modell günstig rasche tPA-Behandlung (bei 0,5 und 1 Stunde nach der Verletzung), aber nicht, um eine verzögerte Behandlung (in 4 h). Diese therapeutische Fenster ähnlich denen bei Schlaganfall-Patienten beobachtet. So kann die THI-Modell für die Forschung ausgerichtet, um Reperfusionstherapie in akutem ischämischem Schlaganfall zu verbessern, verwendet werden. Drittens, die chirurgische Eingriffe in der THI-Modell sind einfach und unkompliziert, im Vergleich zur intraluminalen Naht MCA-Verschluß-Modell. Die Dauer der Hypoxie im THI-Modell ist auch steuerbar. Diese Eigenschaften machen die THI-Modell weniger anfällig für Verfahrensschwankungen zwischen verschiedenen Labors. Schließlich ist die THI-Modell kann Einblicke in die Mechanismen der unvollständigen Reperfusion trotz Rekanalisation großen Arterien nach Thrombolyse verschüttet wird, daseine einzigartige Herausforderung in der Schlaganfall-Therapie, wenn auf kardiale Ischämie 1,22 verglichen. Daher stellt die THI-Modell ein einzigartiges System, um die Mechanismen des zerebralen Gefäßbett spezifische Fehlregulation der Blutstillung 23 zu studieren.
Alle experimentellen Hirnverletzung Modelle haben Grenzen, und die THI-Modell ist keine Ausnahme. Drei großen technischen Bedingungen der THI Schlaganfallmodell haben im Experiment ermittelt. Erste, im Gegensatz zu anderen Taktmodelle wo die Insult an das Gehirn beschränkt ist, die Kombination von Hypoxie und Carotisokklusion führt zu peripheren Vasodilatation und einer größeren Nachfrage nach Herzleistung 12. So, wenn man die Auswirkungen der Maus Mutationen oder neuroprotektive Mittel gegen die THI Beleidigung, deren Auswirkungen auf die Herz-Kreislauf-Funktionen werden auch sorgfältig verglichen werden. Zweitens haben wir festgestellt, dass verschiedene Mausinzuchtstämmen haben variable Reaktionen auf die THI-Modell, das durch ungleichmäßige Durchgängigkeit des hinteren commun sein könnenicating Arterie 24, unähnlich Herzfunktion oder eine Kombination aus beidem. Daher ist es empfehlenswert, die Geschlecht, Alter, Körpergewicht und der Mausstämme zwischen zwei Versuchsgruppen bei der Neuroprotektion Studien vergleichbar sein. Schließlich beruft sich die THI-Hub an Tieren in der hypoxische Gas unter einem leicht narkotisierten Zustand atmen. Die Auswirkungen der Narkose auf Schlaganfall Ergebnisse müssen minimiert und konsistent zwischen Tieren gehalten werden. Dennoch, solange Forscher sind wachsam dieser technischen Details und die Variablen zu reduzieren vom Tier auf den Tieren, die THI Schlaganfall-Modell kann schnell eingerichtet, um hohe Konsistenz der Hirninfarkt zu ergeben.
Zusammenfassend liegt da eine einfache und standardisierte Schlaganfall-Modell, das positiv auf die reale Therapie (tPA Thrombolyse) in einem klinisch relevanten Zeitfenster reagiert. Dieses neue Modell ist eine wertvolle Ergänzung für präklinische Schlaganfallforschung, und kann dazu beitragen, die Thrombolyse-Therapie bei akuten ischämischen verbessernSchlaganfall.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10-13 weeks old (22-30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-brain imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 | |
| Meloxicam SR | ZooPharm | NSAID analgesia |
References
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