Abstract
מחקר שבץ סבל עיכובים רבים בתרגום טיפולי נוירו לתוך פרקטיקה קלינית. לעומת זאת, הטיפול בעולם האמיתי (thrombolysis tPA) לעתים רחוקות מייצר יתרונות בדגמים ניסיוניים המבוסס על חסימה מכאני, אשר שולטים מחקר פרה-קליני שבץ. פיצול זה בין הספסל והמיטה מרמז על הצורך להעסיק דגמי tPA מגיבים במחקר פרה-קליני שבץ. לשם כך, מודל שבץ טרומבוטיים פשוט וtPA-reactive הוא המציא ושתואר כאן. מודל זה מורכב מחסימה הזמנית של עורק תרדמה המשותף חד-צדדי ואספקה של חמצן 7.5% באמצעות מסכת פנים בעכברים בוגרים למשך 30 דקות, תוך שמירה על הטמפרטורה רקטלית של בעלי החיים ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס. למרות קשירה הפיכה של עורק תרדמה חד-צדדי או היפוקסיה כל מודחקת זרימת דם במוח רק זמני, השילוב של שניהם העלבונות שנגרם נמשך גירעונות reperfusion, הפיברין ותצהיר של טסיות דם, וinfar הגדולct בשטח המסופק עורק המוח האמצעי. חשוב לציין, הזרקה של רקומביננטי tPA ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות שלאחר תי (10 מ"ג / קילוגרם) וריד זנב סיפק הפחתה של גודל שיעור תמותה ואוטם תלוי זמן. מודל השבץ חדש זו הוא פשוט ויכול להיות טופל בכל מעבדות להשוות את תוצאות ניסוי. יתר על כן, זה גורם פקקת ללא craniectomy או החדרת תסחיפים מראש יצר. בהתחשב ביתרונות הייחודיים אלה, מודל תי הוא תוספת שימושית לרפרטואר של מחקר פרה-קליני שבץ.
Introduction
Thrombolysis וrecanalization הוא הטיפול היעיל ביותר של שבץ איסכמי חריף בפרקטיקה קלינית 1. ובכל זאת, רוב המחקר פרה-קליני neuroprotection בוצע במודל חולף מכונאי חסימה (חסימת intraluminal תפר האמצע מוחית עורק) שמייצר התאוששות מהירה של זרימת דם במוח על הסרת החסימה של כלי הדם ומראה לא מעט על מנת יתרונות על ידי thrombolysis tPA. זה כבר הציע כי הבחירה המפוקפקת של דגמי שבץ תרמה, לפחות בהחלק, לקושי בתרגום טיפול נוירו לחולי 2,3. לפיכך, יש שיחת הגדלת להעסקת דגמי שבץ תרומבואמבוליים tPA מגיבים במחקר פרה-קליני, אך מודלים כאלה צריכים גם בעיות טכניות (ראה דיון) 4-7. כאן אנו מתארים מודל שבץ טרומבוטיים חדש המבוסס על עלבון חד צדדי חולף חוסר חמצן-איסכמי (תי) והתגובות שלה לטיפול tPA לוריד 8.
מודל שבץ תי פותח על בסיס הליך לוין (קשירת קבע של עורק תרדמה משותפת חד-צדדי ואחרי חשיפה להיפוקסיה החולפת בתא) שהומצא לניסויים בחולדות מבוגרות בשנת 1960 9. הליך לוין המקורי דהוי לתוך החושך כי זה רק מיוצר נזק מוחי משתנה, אבל באותו העלבון שנגרם נוירופתולוגיה עקבית בגורי מכרסמים כאשר הוא מחדש הוצג על ידי רוברט ואנוצ'י ועמיתיו כמודל של אנצפלופתיה חוסר חמצן-איסכמי בילוד (hie) בשינה 1981 10. בשנים האחרונות, כמה חוקרים מחדש מותאמים מודל לוין-אנוצ'י לעכברים בוגרים על ידי התאמת הטמפרטורה בתא חוסר חמצן 11. זה מתקבל על הדעת שהנגעים במוח עולים בקנה אחד בהליך לוין המקורי יכולים לנבוע מתנודות טמפרטורות גוף של מכרסמים מבוגרים בחדר חוסר חמצן. כדי לבדוק השערה זו, שינינו את הליך לוין ידי מתן גז חוסר חמצןדרך facemask, תוך שמירה על טמפרטורת הליבה של מכרסמים על 37 מעלות צלזיוס על השולחן כירורגית 12. כצפוי, בקרת טמפרטורת גוף מחמיר גדלה מאוד את שחזור של פתולוגיה המוח הנגרם על-HI. עלבון HI גם מפעיל קרישה, autophagy, ואפורה ולבן-עניין פציעה 13. גם חוקרים אחרים השתמשו במודל HI לחקור תגובות דלקתיות פעימות הודעה 14.
תכונה ייחודית של מודל שבץ HI היא שזה כדלקמן השלישייה של Virchow של היווצרות קריש דם, כוללים הקיפאון של זרימת דם, פגיעת אנדותל (למשל עקב סטרס חמצוני המושרה HI), וhypercoagulability (הפעלת טסיות דם הנגרם על-HI) (בשיתוף פעולה הדוק איור 1 א) 15. ככזה, מודל HI יכול ללכוד כמה מנגנוני pathophysiological רלוונטיים לשבץ איסכמי בעולם האמיתי. עם הרעיון הזה בראש, אנחנו נוספים מעודנים מודל HI עם קשירה הפיכה של האו"םעורק תרדמה משותף ilateral (ולכן כדי ליצור עלבון HI חולף), ונבדק תגובותיה לthrombolysis tPA עם או בלי Edaravone. Edaravone היא נבלות רדיקלים חופשיות שכבר אושרו ביפן לטיפול בשבץ איסכמי בתוך 24 שעות מהופעת 9. הניסויים שלנו הראו כי HI כקצר כ30 דקות חולפות מפעיל אוטם טרומבוטיים, וכי טיפול tPA-Edaravone שילוב מקנה 8 יתרונות סינרגטיים. כאן אנו מתארים ניתוחים מפורטים ושיקולים מתודולוגיים של מודל תי, אשר ניתן להשתמש בי כדי לייעל טיפולי reperfusion של שבץ איסכמי חריף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת אמורי ועוקב המכונים הלאומי לבריאות קו מנחה לטיפול ושימוש בחי מעבדה.
1. התקנה
- הכן את המיטה כירורגית על כרית החימום מחוברת עם משאבת חום על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות לפני הניתוח. מניחים גליל צוואר באמצעות החבית של 3 מיליליטר מזרק על מיטת הניתוחים. הכן את גז ההרדמה עם isoflurane 2% באוויר רפואי.
- הכן מלקחיים autoclaved, מספריים, מחזיקי מחט מיקרו, hemostat, צמר גפן ותפרים. הכן דבק רקמות ומשחת עיניים.
- להגדיר את מערכת היפוקסיה ובקרי טמפרטורה עם מנורת חימום ובדיקה רקטלית. הכן גז היפוקסיה עם isoflurane 2% ב- 7.5% O 2 מאוזנת 92.5% N 2.
- שעה אחת לפני הניתוח, עכברים analgesized על ידי הזרקה תת עורית של שחרור איטי Meloxicam (4.0 מ"ג / קילוגרם).
- הרדימי C57BL זכר 10-13 שבוע ישן / 6 עכברים במשקל 22 עד 30 גר 'בחדר האינדוקציה ההרדמה עם 3% isoflurane עד שהחיה אינה מגיבה ללחיצת רגל, ולאחר מכן להסיר את השיער על צוואר נכון באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
- מניחים עכברים על המיטה כירורגית מחוברת עם 2% isoflurane באוויר רפואי בקצב זרימה של 2 ליטר / דקה. forelimbs המאובטח נמתח לאורך גליל צוואר בצדדים באמצעות קלטת רפואית.
- נקה את האתר כירורגית לחתך בבטאדין ואחריו אלכוהול ולאחר מכן צמר גפן.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חתך 0.5 סנטימטר ימני של צוואר הרחם באמצעות מלקחיים ישרים ומספרי מיקרו כ -0.2 סנטימטר לרוחב מעור קו האמצע.
- השתמש זוג מלקחיים משוננים בסדר לפרק fascia ורקמה לחשוף את עורק התרדמה המשותף הימני (RCCA). להפריד את RCCA זהירות מעצב מחנק באמצעות זוג מלקחיים חלקים בסדר.
- חי לקשור את שני חתוך 5-0 תפר משי (releasable) על RCCA, ולאחר מכן לתפור את העור באמצעות תפר 4-0 ניילון monofilament (איור 1 ג).
- החל משחה עין על שני העיניים כדי למנוע יובש.
- במהירות להעביר את העכברים למערכת היפוקסיה ולשים האף ופה במסכת פנים עם 2% isoflurane ב7.5% O 2 בקצב זרימה של 0.5-1 ליטר / דקה למשך 30 דקות.
- במהלך היפוקסיה, להשתמש בקרי טמפרטורה עם מנורות חימום לשלוט על הטמפרטורה רקטלית ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס. צג קצב הנשימה ב80-120 נשימות / דקה. התחזוקה של טמפרטורת הגוף מעל 37 מעלות צלזיוס במהלך היפוקסיה חשובה ליצור אוטם מוחי עולה בקנה אחד. קצב נשימה נמוך בדרך כלל קורה אחרי היפוקסיה 20 דקות. הסר את מסכת הפנים ולאפשר אספקת אוויר נורמלית אם קצב הנשימה יורד מתחת לגיל 40. זה לוקח 1-2 דקות ולא נחשב לזמן היפוקסיה 30 דקות.
- לאחר היפוקסיה, להעבירעכברים למיטת ניתוח ולשחרר את שני תפרים מRCCA. לסגור את הפצע באמצעות דבק רקמות, ולאחר מכן להחזיר עכברים לכלוב. תכלול בעלי החיים אם שניהם שני קשרים חיים משתחררים באופן בלתי צפוי לאחר היפוקסיה.
- צג העכברים למשך 5-10 דקות להתאושש מהיפוקסיה והרדמה. הנח את המזון הרטוב בכלוב ולהחזיר אותו למתקן טיפול בבעלי חיים.
הערה: בעלי חיים מראים מתון עד חמורה התנהגות מלקחיים ב 24 שעות לאחר תי מתואמים עם עבירת המוח. רוב בעלי החיים עם תסמיני התקף למות לפני נקודת הזמן 24 שעות לאחר תי.
הדמיה ניגודיות 3. לייזר רבב
הערה: למרות שזה לא הליך חיוני של מודל תי, מערכת הדמיה ניגוד דו ממדי רבב לייזר 16 יכולה לשמש כדי לאפיין את השינויים בזרימת דם במוח (CBF) במהלך או לאחר היפוקסיה-איסכמיה החולפת. לתעד את השינויים של CBF תחת תי, שיא מייד לאחר stEP 2.6. לחלופין, כדי להשוות התאוששות CBF אחרי עלבון תי, ניתן לבצע הליכים אלה הבאים הצעד 2.10.
- הנח עכבר הרדים במצב שכיבה ולבצע חתך קו האמצע 1 ס"מ ארוך על הקרקפת עם הגולגולת החשופה אבל לא נפתחה.
- צג CBF בשני אונות המוח תחת תרמי זרימת דם על פי הפרוטוקול של היצרן ולהתחיל להקליט את זרימת דם במוח באופן מיידי לאחר ניתוח CCAO (שלב 2.6). המשך במשך 50 דקות.
- הצג תמונת CBF עם יחידות שרירותיות בלוח 16 צבעים ולנתח בזמן אמת האזורים הנבחרים באמצעות תוכנת MoorFLPI הבאה הוראות היצרן (איור 2).
- לאחר הקלטת תמונת CBF, לסגור את הקרקפת עם דבק רקמות ולהחזיר את בעלי החיים לכלוב.
מנהל 4. tPA
- להזריק בעלי חיים בוריד הזנב עם הממס או 10 מ"ג / קילוגרם רקומביננטי tPA (220-300 ו# 956; L של 1 מ"ג / מ 'tPA) ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות לאחר tCCAo תוספת היפוקסיה (איור 4).
איתור נזק 5. מוח עם מספר אפשרויות שונות
הערה: כדי לאסוף דגימות מוח, להרדים את העכברים בבית 1, 4 או 24 שעות לאחר תי.
- שיטה לבצע כימות של נפח אוטם על ידי in vivo כלוריד 2,3,5-Triphenyltetrazolium (TTC) בשעה 24 שעות לאחר עלבון תי כמתואר קודם. 17
- Intraperitoneally להזריק חיות עם 1.4 M פתרון מניטול (~ משקל גוף 0.1 מיליליטר / g) 30 דקות לפני זלוף transcardial. עכברי Perfuse Transcardial עם PBS ואחריו 10 מיליליטר של TTC 2%.
- הסר את המוח של בעלי חיים עם מכשירי ניתוח לאחר 10 דקות ומניח לparaformaldehyde 4% לקיבעון הלילה וסעיף לעובי 1 מ"מ עם vibratome.
- הצמד סדרה של ארבע שקופיות מוח מחולקות על ידי מיקרוסקופ וקוואנט הדיגיטלייםify נפח האוטם כיחס בין שטח אוטם השריר (אזור לבן בצד ימין) לאזור של חצי הכדור ניזוק, הנגדי באמצעות תוכנת ImageJ.
- לחלופין, לבצע היווצרות פקקת ידי immunofluorescence בשעה 1 לאחר עלבון תי.
- להקפיא את המוח הקבוע במתחם OCT וסעיף המוח בגיל 12 מיקרומטר עובי באמצעות cryostat.
- דגירה שקופיות המוח עם נוגדן ארנב נגד פיברינוגן (1: 100) הבא על ידי הצבע עז נגד הארנב Alexa Fluro 488 (1: 200) כדי לבחון את הקרינה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- לחלופין, לבצע חסימת כלי על ידי הזרקה לוריד זנב של 100 μl 2% צבע הכחול אוונס ב 4 שעות לאחר עלבון תי.
- להרדים את העכברים ובמהירות לחתוך את הראש כדי להסיר את המוח לתוך 4 paraformaldehyde% לאחר הזרקה הכחולה אוונס. הערה: זה לוקח 5-10 דקות למחזור כחול אוונס עם צבע כחול של שני קדמיים ואחורי גפיים.
- Sectiעל מוח הקבוע ב 100 עובי מיקרומטר באמצעות microtome הזזה ולבחון את הקרינה באמצעות מסנן פליטה 680 ננומטר במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיה ניגוד רבב לייזר דו-ממדית (LSCI) 16 שימשה כדי להשוות את השינויים בזרימת דם במוח (CBF) על ידי חסימת 30 דקות חולפות תרדמה חד-צדדית (tCCAO), חשיפת 30 דקות להיפוקסיה (חמצן 7.5%), ו -30 דקות חד-צדדית תרדמה קשירה תחת היפוקסיה (תי). ניסוי זה גילה כי tCCAO תחת normoxia דיכא את CBF על חצי הכדור התרדמה ligated ל~ 50% מהערך הבסיסי, שהתאושש במהירות למעל 85% לאחר שחרורו של חסימת עורק התרדמה (R באיור 2 א). חשיפה להיפוקסיה המערכתית לבד מופחתת CBF לכ -75% מהערך הבסיסי, אשר זמני ריבאונד ל~ 130% לאחר שחזר לאווירת normoxic (איור 2). בקשירת הצוואר ניגוד תחת היפוקסיה (תי) מצטמצם במהירות CBF בחצי כדור ipsilateral פחות מ -20% משווי הבסיס כ -10 דקות, שרק לעתים רחוקות התאוששו מעל 30% ב 20 דקות לאחר שחרורו של ligatio התרדמהn וחוזר לnormoxia. CBF על האונה הנגדית (L), לעומת זאת, נע בין 20 ל 50% במהלך היפוקסיה, וחזר במהירות למעל 80% לאחר עלבון תי (איור 2 ג).
בגיל 24 שעות לאחר tCCAo (30 דקות) או tCCAO בתוספת 30 דקות היפוקסיה (תי), כתם TTC in vivo שימש לזיהוי אוטם 17. ניתוח זה לא הראה פגיעה ברורה בעלבון tCCAO, אבל אוטם גדול בשטח המסופק עורק המוח האמצעי הבאה תי עלבון (איור 3 א). אנטי-הפיברין (עוגן) immunostaining שימש להשוות את המוח נפצע-תי tCCAO- ובהתאוששות שעה 1 והראה בתצהיר נרחב של הפיברין (עוגן), חיווי של פקקת, בנפצע-תי, אבל לא-תיגר tCCAO עכבר מוח (איור 3, C). הזרקת זנב-וריד של צבע הכחול אוונס הייתה בשימוש גם כדי להשוות זלוף כלי דם של מוח נפגע-תי tCCAO- ובהתאוששות שעה 4. ניתוח זה הראה להמעיטאד זלוף המוחין וextravasation האינטנסיבי של הצבע הכחול אוונס בתי-נפצע, אך לא את המוח של עכבר תיגר-tCCAO (איור 3D, E).
לבסוף, התוצאות של עלבון תי בעכברים שקיבלו הזרקה לוריד זנב של רכב (ברמה של 0.5 שעות התאוששות) או אנושית רקומביננטי tPA (Activase, 10 מ"ג / קילוגרם, ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות לאחר תי) הושוו באמצעות ב vivo כתם TTC בהתאוששות 24 שעות (איור 4 א). בעכברים שטופל רכב, שיעור התמותה ב 24 שעות שלאחר תי היה 23.8%, ורק אחד בעכברים 21 נפצעו-תי היה מעבר לממוצע ו- 2 SD (החריג). שיעור תמותת 24 שעות בעכברים שקיבלו טיפול tPA בהתאוששות 0.5 שעות ירד ל -8.3%, אך השפעה זו אבדה כאשר tPA היה מנוהל ב1 או 4 שעות אחרי עלבון תי (איור 4). איור 4C זמם הגודל האוטם של כל שרד עכברים בארבע קבוצות הטיפול. ראוי לציין, שניהם של tPA-ממשל 0.5 ו 1 שעותignificantly מופחת גודל אוטם, בהשוואה לטיפול ברכב. קבוצת tPA-טיפול 0.5 שעות הראתה גם גודל אוטם מופחת באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת tPA-טיפול 4 שעות. איור 4D הראה תוצאות TTC-כתם נציג לאחר כל טיפול.
איור 1:. נוהל של עלבון חולף היפוקסיה-איסכמיה מוחית (תי) בעכברים בוגרים השלישייה של Virchow () המניע פקקת כולל קיפאון של זרימת דם, פגיעת אנדותל, וhypercoagulability של הדם. תרשים סכמטי של הליך שבץ תי (B). שני קשרים releasable היו קשורים אל עורק התרדמה המשותף הימני (CCA), ואחריו אספקת חמצן 7.5% באמצעות חרטום למשך 30 דקות, ואילו הטמפרטורה רקטלית העכבר נשמרה ב37-38 מעלות צלזיוס. אחרי טרנסהיפוקסיה מערכתית ient, קשירת המרכז לאמנות עכשווית שוחררה על ידי תלישת קצה אחד של הקשרים תפר releasable. MCA, עורק המוח אמצעי; הרשפ"ת, עורק תרדמה פנימי; ECA, עורק תרדמה חיצוני; המרכז לאמנות עכשווית, עורק תרדמה משותף. (ג) הליכים כירורגיים לחסימת מרכז לאמנות עכשווית נכונה חולפת. 1. שני תפר חתוך (# 1 ומס '2) הונח תחת CAA תקין מבודד. 2. שני קשרים releasable נעשו. 3. קו החתך נסגר על ידי תפר # 3. ודא שקצות תפר # 1 ומס '2 היו נגישים מחוץ לקו החתך. 4. משכו בזהירות תפר # 1 ומס '2 מבחוץ כדי לשחרר את המרכז לאמנות עכשווית. כאשר מבוצעים בעדינות, בהליך זה לא יגרום לקריעה של המרכז לאמנות העכשווית.
איור 2:. ניתוח של זרימת דם במוח שינויים במהלך ואחרי עלבון תי הדמיה ניגוד רבב דו ממדי לייזר (LSמערכת CI) שימשה כדי להעריך את זרימת דם במוח (CBF). R (מימין) מציין את חצי הכדור-ligated תרדמה; L (משמאל) הוא האונה הנגדית. () TCCAO תחת normoxia מודחק CBF ל~ 50% מהערך הבסיסי בחצי הכדור-ligated התרדמה (R) לפחות 30 דקות, שהתאוששו מעל 85% בתוך 3 דקות על שחרורו של קשירת הצוואר. (ב) בהיפוקסיה (חמצן 7.5%, 30 דקות) ללא קשירת עורק תרדמה, CBF סרב 76% מהערך הבסיסי וזמני התאושש לכ -130% לאחר שחזר לnormoxia. (ג) בקשירת הצוואר חולפת תחת היפוקסיה (תי, 30 דקות), CBF על חצי הכדור-ligated תרדמה (R) ירד במהירות עד פחות מ -20% מהשווי הבסיסי, וזה רק לעתים נדירות התאושש מעל 30% על שחרורו של תרדמה קשירה וחוזר לnormoxia. לעומת זאת, CBF על האונה הנגדית (L) נע בין 20-50% במהלך היפוקסיה, וחזר במהירות ל> 80% מהבסיסערך לאחר שחרורו של קשירת הצוואר וחוזר לnormoxia. מוצגים הם העתקים CBF נציג עבור n> 4 בכל קבוצה. נקודות הזמן לצילומי LSCI נציג התאפיינו בקווים אפורים במעקב הנציג.
איור 3: אוטם מוחי, פקקת ספונטני וכלי חסימה לאחר עלבון תי () in vivo TTC-הכתם לא הראה אוטם גלוי ב 24 שעות לאחר קשירה חולפת 30 דקות של עורק התרדמה משותפת הימני (tCCAO), אבל התוספת של. 30 דקות היפוקסיה (7.5% חמצן) לtCCAO מיוצרת אוטם גדול למדי בחץ כדור ipsilateral (הכוכבית), בעיקר באזור אספקה-עורק המוח האמצעי. (B, C) אנטי-הפיברין (עוגן) immunostaining בשעה 1 לאחר עלבון תי הראה פיקדונות נרחבים בחצי הכדור ipsilateral. לעומת זאת, לא היה הפיברין (עוגן) פיקדונות בשעה 1 לאחר tCCAo עלבון (30 דקות) (n> 4 לכל אחד). (D, E) זלוף מוחין הוערך על ידי הזרקה לוריד זנב של הצבע הכחול אוונס ב 4 שעות לאחר tCCAO (30 דקות) או תי עלבון (30 דקות). בפוסט-tCCAO המוח, צבע אוונס הכחול מילא את רוב כלי הדם בחץ כדור ipsilateral. לעומת זאת, בפוסט-תי המוח, צבע הכחול אוון מילא כלי דם פחות והודלף לparenchyma (n> 3). בר סולם: 250 מיקרומטר.
איור 4: השפעות של thrombolysis tPA במודל שבץ תי מתאר () של ניסויים כדי להשוות את ההשפעות של ממשל tPA תוך ורידי (10 מ"ג / קילוגרם) ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות לאחר עלבון תי.. סיכום (ב) למספר בעלי חיים המופעלים, מוrtality ב -24 שעות לאחר עלבונות, חריגים (גודל האוטם מחוץ +/- 2 SD הממוצע), ואת מספר בעלי החיים כלול להשוואה של הגודל האוטם. (ג) כימות הראתה בממוצע 32% נפח אוטם בקבוצת הרכב והפחתה משמעותית של אוטם בשעה 0.5 (עד 16%) ושעת 1 (20%) קבוצות (מוצגים הן ממוצעת וSEM לכל קבוצה). P-הערכים נקבעים על ידי מבחן t. מוכתם TTC (ד) נציג מוח מבעלי החיים שהיו לערער על ידי עלבון תי וקיבלו טיפול tPA בנקודת הזמן המצוין לאחר פציעה. בצביעת TTC, רקמת חיה הראתה צבע אדום; רקמת אוטם הייתה חיוורת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שבץ הוא בעיה בריאותית משמעותית של גידול משמעות לכל חברה עם אוכלוסייה מזדקנת. בעולם, שבץ הוא הגורם מוביל השני של מוות עם 5.9 מיליון אירועים משוערים קטלניים בשנת 2010, שווה ערך ל 11.1% מכל מקרי המוות 18. שבץ הוא גם הגורם מוביל השלישי של שנות חיים מותאמות לנכות (DALYs) איבד ברחבי העולם בשינה 2010, עולה מהעמדה החמישית בשינה 1990 19. נתונים אפידמיולוגיים אלה מדגישים את הצורך של טיפולים יעילים יותר של שבץ חריף (איסכמי). עם זאת, למרות מחקר אינטנסיבי בטיפול נוירו פרה-קליני, tPA-thrombolysis נשאר הטיפול הספציפי רק של שבץ איסכמי חריף שאושר על ידי מנהל המזון והתרופות בארה"ב, ואילו סוכני neuroprotective פעם מבטיחים רבים במחקרים בבעלי חיים נכשלו בניסויים קליניים. הקושי בתרגום טיפולי נוירו לחולים יש גורמים רבים, והדגש הנוכחי הוא על practi מעבדה טובלסה"נ, מטה-אנליזה של מערכי נתונים מרובים, ושיתוף פעולה בינלאומי כדי לשפר את המחקר פרה-קליני שבץ 20,21. עם זאת, יש בדעת מיעוט טוענת כי קושי translational בשל בחירה גרועה של דגמי חסימת כלי דם מכאניים (למשל חסימת MCA תפר intraluminal) ברוב של מחקר פרה-קליני לשבץ 2,3 מועד. בגלל החסימה של כלי דם מודלים מכאניים לעתים רחוקות לגרום פקקת וreperfusion המוחי מתרחש מהר מדי על שחרורו של חסימה מכאנית, המודלים האלה לא מגיבים לטיפול האמיתית-מילה (פירוק פיברין tPA) ולא מספקים חלון טיפולי צר כמו אלו בחולי שבץ מוחי. כתוצאה מכך, התרופה הציעה היא להדגיש, לפחות כולל, דגמי שבץ תרומבואמבוליים במחקר פרה-קליני שבץ 3.
המלצה זו, עם זאת, יש מגבלות שלה כי דגמים הנוכחיים תרומבואמבוליים שבץ (משלוח תסחיפי אקסוגני, MCA-הזרקה של thrombin, וphotothrombosis) לכולם יש חסרונות טכניים מסוימים 4. למודל תסחיפי אקסוגני, עירוי תוך-של תוצאות תסחיפים בשונות משמעותיות בגודל אוטם ומיקום, כמו גם תגובות בלתי צפויות לthrombolysis tPA בשל הבדלים בהכנת קריש 4,5. הזרקה ישירה של תרומבין לסניף MCA דורשת craniectomy, והשירות שלה לייעול הטיפול הטרומבוליטיות הוא עדיין לא הוכיח 4,6. כימי יזם תרומבואמבוליזם מבוסס על הזרקה מערכתית של צבע רגיש (למשל רוז בנגל או erythrosine B) וקרינה דרך הגולגולת החשופה לעתים קרובות מייצר אגרגטים-טסיות רק שאינו מגיבים לthrombolysis 4,7. יחדיו, יש צורך במודלים תרומבואמבוליים פשוטים וtPA מגיב למחקר פרה-קליני שבץ.
יש פרדיגמה תי ארבעה יתרונות ייחודיים כמודל שבץ תרומבואמבוליים. ראשית, עלבון תי הפעילרכיבים אנדוגניים ליצירת בthrombi אתר ללא העזרה של כימיקלים אקסוגניים או תסחיפים מראש יצר. לפיכך, היווצרות קריש דם במודל תי היא יותר רלוונטית לתנאים פיסיולוגיים. שנית, מודל תי מגיב חיובי לtPA-טיפול מהיר (ברמה של 0.5 ו- 1 שעות לאחר פציעה) אך לא לטיפול מושהה (ב 4 שעות). חלון טיפולי זה דומה לאלו שנצפו בחולי שבץ מוחי. לפיכך, מודל תי עלול להיות מנוצל למחקר שמטרתו לשפר את טיפול reperfusion בשבץ איסכמי חריף. שלישית, הניתוחים במודל תי הם פשוט וברורים, בהשוואה למודל חסימת התפר MCA intraluminal. משך היפוקסיה במודל תי הוא גם לשליטה. תכונות אלה הופכות את מודל תי פחות רגישה לשינויים פרוצדורליים בין מעבדות שונות. לבסוף, מודל תי עשוי לשפוך תובנות לתוך המנגנונים של reperfusion שלם למרות recanalization של עורקים גדולים לאחר thrombolysis, שהואאתגר ייחודי בטיפול שבץ בהשוואה לאיסכמיה לבבית 1,22. לפיכך, מודל תי מספק מערכת ייחודית ללמוד את המנגנונים של חוסר ויסות המיטה ספציפית כלי דם המוחי של עצירת דימום 23.
כל דגמי הפגיעה מוחית ניסיוני מגבלות, ומודל תי הוא לא יוצא מן הכלל. שלושה אילוצים טכניים עיקריים של מודל שבץ תי זוהו בניסוי. ראשית, בניגוד לדגמים אחרים שבם שבץ העלבון מוגבל למוח, השילוב של היפוקסיה וחסימת עורק מוביל להרחבת כלי דם היקפי וביקוש גדול יותר לתפוקת לב 12. כך, כאשר משווים את ההשפעות של מוטציות עכבר או סוכני neuroprotective נגד עלבון תי, ההשפעות שלהם על פונקציות לב וכלי דם תהיינה גם בהשוואה הזהירות. שנית, מצאנו כי יש זנים טהורים עכבר שונים תגובות משתנים למודל תי, שיכול להיות בגלל patency אחיד של commun האחוריעורק icating 24, פונקציות לב שונות, או שילוב של שניהם. לפיכך, מומלץ כי המין, גיל, משקל גוף, ועכבר בין שני זני קבוצות ניסוי יהיו דומים במחקרי neuroprotection. לבסוף, שבץ תי מסתמך על בעלי חיים לנשום בגז חוסר חמצן בתנאי הרדים בקלילות. ההשפעות של הרדמה על תוצאות שבץ צריכה להיות ממוזערות והמשיכו עקבי בין בעלי החיים. יחד עם זאת, כל עוד חוקרים הם על המשמר של הפרטים הטכניים הללו ולהפחית את המשתנים מבעלי חיים לבעלי חיים, מודל שבץ תי ניתן להקים במהירות להניב עקביות גבוהה של אוטם מוחי.
לסיכום, תי הוא מודל שבץ פשוט וסטנדרטי שמגיב בחיוב לטיפול בעולם האמיתי (thrombolysis tPA) בחלון זמן רלוונטי מבחינה קלינית. מודל חדש זה הוא תוספת רבת ערך למחקר פרה-קליני שבץ, ועשוי לסייע בשיפור הטיפול בthrombolysis איסכמישבץ מוחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10-13 weeks old (22-30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-brain imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 | |
| Meloxicam SR | ZooPharm | NSAID analgesia |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
