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Bioengineering

खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का उपयोग नेत्र परेशान रसायन का खतरा पहचान के लिए आंखों में जलन टेस्ट (ईआईटी)

Published: August 23, 2015 doi: 10.3791/52979
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1MatTek Corporation, 2MatTek In Vitro Life Science Laboratories

Summary

हम एक तीन आयामी खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का इस्तेमाल करता है जो एक आंख में जलन परीक्षण विकसित किया है। परीक्षण नेत्र अड़चन और संक्षारक सामग्री (जीएचएस श्रेणियाँ 1 और संयुक्त 2) और लेबलिंग (जीएचएस कोई श्रेणी) की आवश्यकता नहीं है कि उन लोगों के बीच भेदभाव करने में सक्षम है।

Abstract

यूरोपीय संघ के सौंदर्य प्रसाधन निर्देशक और यूरोपीय संघ पहुंच कानून को सातवाँ संशोधन के साथ पालन करने के लिए, आदमी में नेत्र विषाक्तता के विश्वसनीय और सटीक आकलन के लिए मान्य गैर पशु वैकल्पिक तरीकों की जरूरत है। इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम एक आंख में जलन परीक्षण सामान्य मानव कोशिकाओं पर आधारित है कि एक तीन आयामी खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का इस्तेमाल करता है जो (ईआईटी) विकसित किया है। ईआईटी नेत्र परेशानी और corrosives (जीएचएस श्रेणियाँ 1 और 2 संयुक्त) और लेबलिंग (जीएचएस कोई श्रेणी) की आवश्यकता नहीं है कि उन लोगों को अलग करने में सक्षम है। परीक्षा दो अलग-अलग प्रोटोकॉल, तरल रसायन और ठोस परीक्षण के लेख के लिए एक दूसरे, इसी तरह के प्रोटोकॉल के लिए बनाया गया एक का इस्तेमाल करता है। ईआईटी भविष्यवाणी मॉडल एक जोखिम अवधि (तरल पदार्थ के लिए 30 मिनट, ठोस के लिए 6 घंटा) और एक ही ऊतक व्यवहार्यता कट ऑफ (MTT परख द्वारा निर्धारित रूप में 60.0%) का उपयोग करता है। ईआईटी 95.5 / 68.2 / और 81.8% Sens हासिल की (44 तरल पदार्थ और 39 ठोस) 83 रसायनों के लिए परिणामों के आधार परitivity / विशिष्टता और सटीकता (एस एस एंड ए) तरल पदार्थ के लिए, ठोस के लिए / 68.4 100.0 / और 84.6% एसएस एंड ए, और 97.6 / 68.3 / और समग्र एसएस एंड ए के लिए 83.1%। ईआईटी नियामक परीक्षण आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए जानवरों के इस्तेमाल के बिना तरल और ठोस रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के नेत्र जलन संभावित वर्गीकृत करने में महत्वपूर्ण योगदान होगा। EpiOcular ईआईटी विधि टीजी 492 के रूप में ओईसीडी टेस्ट दिशानिर्देश में 2015 में लागू किया गया था।

Introduction

इस तरह के सौंदर्य प्रसाधन, डिटर्जेंट, और घर क्लीनर के रूप में उपभोक्ता उत्पादों वे आंखों से संपर्क किया तो गंभीर क्षति उत्पन्न हो सकता है कि रसायनों की एक किस्म शामिल हैं। इसलिए, आंखों में जलन के लिए इन एजेंटों के परीक्षण के उपभोक्ता सुरक्षा 1 सुनिश्चित करने के लिए अमेरिका और यूरोपीय संघ नियामक एजेंसियों द्वारा आवश्यक है। मिश्रण और योगों की आंखों में जलन की क्षमता का एक आकलन भी रसायनों के परिवहन के लिए यूरोपीय संघ के सौंदर्य प्रसाधन निर्देश के तहत सौंदर्य प्रसाधन सामग्री की लेबलिंग के लिए रीच (पंजीकरण, मूल्यांकन, प्राधिकरण, और रसायन के प्रतिबंध) के साथ कानून का पालन करने के लिए एक आवश्यकता है, और के लिए कीटनाशकों और घरेलू उत्पादों 2 की लेबलिंग। वर्तमान में, नियामक एजेंसियों के वर्गीकरण और रसायन की लेबलिंग (जीएचएस) 3 की वैश्विक स्तर पर संगत प्रणाली का उपयोग कर आंख का जोखिम मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। जीएचएस मुख्य रूप से Draize आंखों में जलन परीक्षण पर आधारित है, सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल आंखों में जलन परख जिसमें विदेशी तत्वों और मीलxtures खरगोश आंख 4 की नेत्रश्लेष्मला थैली में सीधे पेश कर रहे हैं। जीएचएस वर्गीकरण के अनुसार, जीएचएस श्रेणी 1 (नेत्र corrosives) आँखों ऊतकों या जोखिम 3,5 निम्नलिखित 21 दिनों के भीतर पूरी तरह से प्रतिवर्ती नहीं है, जो आंख और दृष्टि को गंभीर क्षति के लिए गंभीर प्रारंभिक चोट के कारण रसायन है कि परीक्षण करने के लिए संदर्भित करता है। जीएचएस श्रेणी 2 जोखिम के 21 दिनों के भीतर पूरी तरह से प्रतिवर्ती हैं कि आंख में महत्वपूर्ण परिवर्तन का उत्पादन है कि रसायनों का परीक्षण करने के लिए संदर्भित करता है। Corrosives या परेशानी नहीं कर रहे हैं कि टेस्ट रसायनों जीएचएस कोई श्रेणी के रूप में करने के लिए भेजा जाता है।

40 से अधिक वर्षों के लिए, Draize खरगोश नेत्र परीक्षण अपनी reproducibility की कमी है, मानव प्रतिक्रियाओं की overestimation, और जीवित पशुओं 5-8 के उपयोग के लिए आलोचना की गई है। इन चिंताओं शोधन, कमी है, और इन विवो परीक्षण 9 के प्रतिस्थापन के लिए कई प्रस्तावों को प्रोत्साहित किया है। मान्य गैर पशु विकल्पों की आवश्यकता के आगे मजबूत बनाया गया था(2009 में) प्रसाधन सामग्री (2005 में) कॉस्मेटिक उत्पादों की सुरक्षा के मूल्यांकन में जानवरों के इस्तेमाल पर प्रतिबंध लगा दिया है, जो निर्देशक, और सामग्री के लिए सातवाँ संशोधन की गोद से 2।

1996 के बाद से खंगाला कॉर्निया की तरह ऊतक मॉडल व्यापक रूप से कच्चे माल, पृष्ठसक्रियकारक आधारित योगों की जलन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए कॉस्मेटिक उद्योग द्वारा इस्तेमाल किया है, और में इस्तेमाल के लिए तैयार कर रहे हैं कि मिश्रण पैदा हो गई, या, आंख के आसपास के क्षेत्र में की गई है 10-13। RHCE ऊतक मॉडल के उपयोग के अपने मूल, undiluted रूप में ऊतक सतह पर परीक्षा सामग्री का सीधा सामयिक आवेदन की अनुमति देता है। इस रास्ते में, गैर-पानी में घुलनशील योगों सॉल्वैंट्स के साथ उन्हें गिराए बिना परीक्षण किया जा सकता है। एक व्यापक रूप से लागू सीधा, और आर्थिक विधि के लिए अनुरोध (वैकल्पिक तरीकों के सत्यापन के लिए यूरोपीय संघ के संदर्भ प्रयोगशाला यूरोपीय केन्द्र) EURL ECVAM की प्रतिक्रिया के रूप में आंखों में जलन टेस्ट (ईआईटी) एक singl इस्तेमाल करता है जोई जोखिम समय और लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है कि सामग्री से नेत्र परेशानी और corrosives अलग करने में सक्षम है (चित्रा 1) 14 विकसित किया गया था। 83 रसायन (44 तरल पदार्थ और 39 ठोस) के लिए परिणामों के आधार पर, ईआईटी 95.5 / 68.2 / और 81.8% संवेदनशीलता / विशिष्टता और सटीकता (एस एस एंड ए) तरल पदार्थ के लिए, ठोस के लिए 100.0 / 68.4 / और 84.6% एसएस एंड ए, और 97.6 / हासिल की 68.3 / और समग्र एसएस एंड ए के लिए 83.1%।

2007 में, EURL ECVAM के तत्वावधान में प्रसाधन सामग्री यूरोप (पूर्व में Colipa) द्वारा प्रायोजित एक बहु प्रयोगशाला पूर्व सत्यापन अध्ययन औपचारिक सत्यापन 15 को लाने के लक्ष्य के साथ ईआईटी की प्रासंगिकता और विश्वसनीयता का आकलन किया। इस अध्ययन में, 298 स्वतंत्र परीक्षणों सात स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया गया। अध्ययन के परिणाम भाग लेने वाले सभी प्रयोगशालाओं 15 के पार भिन्नता के कम गुणांक के साथ भविष्यवाणी में 99.7% समझौते का प्रदर्शन किया। नतीजतन, 2010 में ईआईटी प्रोटोकॉल एक औपचारिक EURL ECVAM में प्रवेश कियासत्यापन कार्यक्रम। सत्यापन के अध्ययन में विवो संदर्भ डेटा (Draize आंखों में जलन डेटा) उपलब्ध थे, जिसके लिए अलग-अलग पदार्थों और रासायनिक मिश्रण, सहित 104 कोडित परीक्षण रसायन, का उपयोग किया। इस काम की सफलता के आधार पर, एक ओईसीडी मसौदा परीक्षण दिशानिर्देश यह ईआईटी संयुक्त राष्ट्र जीएचएस वर्गीकरण और लेबलिंग प्रणाली के अनुसार सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के नेत्र जलन क्षमता का वर्गीकरण में महत्वपूर्ण योगदान होगा अनुमान है कि 2014 में प्रस्तुत की गई थी।

Protocol

उपचार के लिए RHCE ऊतकों की 1. तैयारी - 0 दिवस

  1. वाणिज्यिक मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) किट के प्राप्त होने पर, पर। ईआईटी परख (तालिका 2) करने के लिए आवश्यक सभी किट अखंडता के लिए (किट जानकारी के लिए घटकों को देखने के मानक परख किट घटकों (1 टेबल) और उपकरण और सामग्री की जांच प्राप्त होने के दिन, 15 मिनट के लिए आरटी के लिए (अपने 24 अच्छी तरह से शिपिंग कंटेनर में) ऊतकों संतुलित करना।

मात्रा अभिकर्मक शर्तेँ स्रोत विवरण समाप्ति तिथि
1 EpiOcular ऊतकों की सील 24 अच्छी तरह से थाली
(ओसीएल-200) 		2-8 डिग्री सेल्सियस MatTek 24 Tiss शामिलसेल संस्कृति के ues agarose पर, पैकेज सम्मिलित करता है 72 घंटा
1 बोतल,
200 मिलीलीटर 		EpiOcular परख माध्यम
(ओसीएल-200-ASY) 		2-8 डिग्री सेल्सियस MatTek DMEM आधारित मध्यम 21 दिन
1 बोतल,
100 मिलीलीटर 		मिलीग्राम ++ नि: शुल्क Dulbecco's पीबीएस (DPBS) ++ सीए आरटी सिग्मा Aldrich, D5652, या equiv। सम्मिलित करता है धोने के लिए प्रयुक्त 1 वर्ष
4 6 अच्छी तरह प्लेटें आरटी बाज़ परख प्रोटोकॉल के दौरान ऊतकों को बनाए रखने के लिए प्रयुक्त एनए
2 12 अच्छी तरह प्लेटें आरटी बाज़ परख प्रोटोकॉल के दौरान इस्तेमाल किया एनए
2 24 अच्छी तरह प्लेटें आरटी बाज़ MTT परख प्रदर्शन किया एनए
एक शीशी,
0.5 मिलीलीटर 		मिथाइल एसीटेट
(कैस # 79-20-9) 		आरटी सिग्मा Aldrich,
बिल्ली # 186,325 		परख में पीसी के रूप में प्रयुक्त 1 महीना

तालिका 1: मानक परख किट घटकों।

<टीडी> नेकां के रूप में प्रयोग करें
उपकरण / सामग्री के लिए ज़रूरी है:
Humidified इनक्यूबेटर (37 ± 1 डिग्री सेल्सियस, 5 ± 1% सीओ 2, 90 ± 10% आर्द्रता) पहले और assays के दौरान incubating ऊतकों
पर्णदलीय प्रवाह शिरोवेष्टन बाँझ शर्तों के तहत सुरक्षित कार्य
वैक्यूम पंप (वैकल्पिक) मध्यम और समाधान Aspirating
प्लेट रीडर दीप्तिमापी (96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए) पढ़ना आयुध डिपो
थाली प्रकार के बरतन उद्धरणformazan के आयन
बाँझ, कुंद धार संदंश ऊतक सम्मिलित करता हैंडलिंग
घड़ियों बंद करो प्रोटोकॉल में परीक्षा सामग्री और अन्य समय पर कदम के आवेदन का समय
पानी स्नान (37 ± 1 डिग्री सेल्सियस) वार्मिंग मीडिया और MTT समाधान
ओखल और मूसल दानेदार ठोस पीस
सकारात्मक विस्थापन पिपेट (50 μl) चिपचिपा और अर्द्ध ठोस सामग्री और निलंबन के आवेदन
एडजस्टेबल pipettes (200 μl-2 मिलीलीटर) तरल सामग्री, परख मध्यम और MTT के आवेदन
पूर्व निष्फल युक्तियाँ (200 μl और 20 μl), Rainin बिल्ली # एचआर-200F और मानव संसाधन-20F (या समतुल्य) तरल सामग्री, परख मध्यम और MTT के आवेदन
वाइड छिद्र पूर्व निष्फल युक्तियाँ (250 μl), Rainin बिल्ली # एचआर-250WS (या equivalent) चिपचिपा और अर्द्ध ठोस सामग्री और निलंबन के आवेदन
8 औंस / 220 मिलीलीटर कंटेनर नमूना, फाल्कन बिल्ली # 3,540,200 (या समतुल्य) ऊतकों Rinsing
बाँझ एकल उपयोग सीरिंज (जैसे सिरिंज Omnifix-एफ, बी Braun Melsungen एजी, बिल्ली tuberkulin 1 मिलीलीटर। सं 9161406V) ~ 50 मिलीग्राम ठोस सामग्री के वितरण (वैकल्पिक)
टेड पेला सूक्ष्म रंग / चम्मच, टेड पेला इंक, बिल्ली # 13,504 (या समतुल्य, तेज चम्मच या हड्डी curette, जैसे Aesculap, नहीं: FK 623) ~ 50 मिलीग्राम ठोस सामग्री के वितरण
सीए ++ और मिलीग्राम ++ मुक्त Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (सीए ++ मिलीग्राम ++ फ्री-DPBS): सिग्मा Aldrich, बिल्ली # D5652 (या समतुल्य) परख के दौरान Rinsing ऊतकों
बाँझ विआयनीकृत पानी, टिशू कल्चर ग्रेड (गुणवत्ता जैविक या समतुल्य)
96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों, फाल्कन (या समतुल्य) आयुध डिपो पढ़ने के लिए
कपास टिप स्वैप (बाँझ) ऊतक सतह सुखाने (वैकल्पिक) के लिए
चिपकने वाला टेप या Parafilm Formazan निकासी के दौरान प्लेटों को कवर
MTT -100 परख किट MTT-Thiazolyl ब्लू tetrazolium ब्रोमाइड अभिकर्मक (सिग्मा # एम 5655) और isopropanol निकालने शामिल हैं।

तालिका 2: उपकरण और ईआईटी प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक सामग्री।

  1. बाँझ शर्तों के तहत, RHCE ऊतकों के साथ 24 अच्छी तरह से थाली युक्त प्लास्टिक की थैली खोलने के लिए और बाँझ धुंध को हटा दें। Agarose जेल के बीच हवा के बुलबुले के लिए सभी ऊतकों का निरीक्षण किया और डालें। सम्मिलित क्षेत्र, दोषपूर्ण ऊतकों, या ऊतकों whi के> 50% डालने को कवर के तहत हवा के बुलबुले के साथ संस्कृतियों का प्रयोग न करें चर्चा पूरी तरह से तरल के साथ कवर कर रहे हैं।
  2. परीक्षण लेख या नियंत्रण कोड और जोखिम समय के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें लेबल। (किट के साथ प्रदान की) परख माध्यम से विभाज्य 1.0 मिलीलीटर, पूर्व लेबल 6 अच्छी तरह प्लेटों के कुओं में, लगभग 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म।
  3. लेबल 6 अच्छी तरह से थाली में डालने RHCE ऊतक युक्त प्रत्येक डालने को हटाने और जगह के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें। इस चरण के दौरान, बाँझ फिल्टर पेपर पर कोमल सोख्ता द्वारा डालने की बाहरी पक्षों का पालन करता है कि किसी भी शेष शिपिंग agarose हटा दें। आवेषण के नीचे फंस किसी भी हवाई बुलबुले को छोड़ दें।
  4. 1 घंटे के लिए (37 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 5 ± 1% सीओ 2 के साथ एससीसी, humidified माहौल) मानक संस्कृति की स्थिति के लिए 6 अच्छी तरह प्लेटें में RHCE ऊतकों पूर्व सेते हैं।
  5. एक घंटे के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस तक prewarmed ताजा परख माध्यम से 1.0 मिलीलीटर के साथ परख माध्यम की जगह है और एससीसी की स्थिति पर RHCE ऊतकों सेते (रातोंरात = हे / एन) (16-24 घंटा)।
। ove_title "> 2 पूर्व उपचार - दिवस 1

  1. हे / एन ऊष्मायन के बाद, एक उचित pipetting डिवाइस का उपयोग (बशर्ते DPBS,) सीए 2 मिलीग्राम 2 + मुक्त-Dulbecco फास्फेट खारा बफर के 20 μl लागू होते हैं। DPBS के ऊतकों भर में फैल नहीं करता है, तो धीरे DPBS पूरे ऊतक सतह wets विश्वास दिलाता हूं कि प्लेट पर डालने के नल।
  2. 30 ± 2 मिनट के लिए एससीसी पर RHCE ऊतकों को सेते हैं।
    यह कदम ऊतक हाइड्रेशन के लिए आवश्यक है और इन विवो परिस्थितियों में नकल करने के लिए: ध्यान दें।

3. परीक्षा सामग्री एक्सपोजर प्रक्रिया

  1. RHCE ऊतकों नकल करने के लिए प्रत्येक परीक्षा लेख और नियंत्रण लागू करें (एन = 2)। परीक्षण लेख खुराक प्रक्रिया तरल और ठोस के लिए अलग है। Topically एक विंदुक का उपयोग तरल परीक्षण लेख के 50 μl लागू होते हैं। तरल पदार्थ के लिए जोखिम समय 30 मिनट है। (सोडियम क्लोराइड के 50 मिलीग्राम पकड़ करने के लिए calibrated) एक समतल चम्मच का उपयोग कर ठोस परीक्षण के लेखों की 50 मिलीग्राम लागू करें। भूतपूर्वठोस के लिए posure समय 6 घंटा है।
    नोट: तरल पदार्थ एक pipetting डिवाइस का उपयोग लागू किया जा सकता है कि तरल पदार्थ (जैसे, तरल पदार्थ, जैल, और क्रीम) के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। एसएनएफ एक पिपेट का उपयोग कर लागू नहीं किया जा सकता है कि गैर-द्रव पदार्थ (जैसे, पाउडर, राल या मोमी सामग्री) के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।
    1. परीक्षण लेखों की शारीरिक स्थिति का निर्धारण करने के लिए आसान नहीं है, तो 15 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए एक पानी के स्नान में परीक्षण के लेख के साथ शीशियों जगह है। 37 डिग्री सेल्सियस पर दव्र उन है कि परीक्षण के लेख के लिए तरल पदार्थ के लिए ईआईटी प्रोटोकॉल का पालन करें।
    2. विशेष रूप से चिपचिपा सामग्री के लिए एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक का प्रयोग करें।
  2. पहली बार नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण खुराक और फिर परीक्षण लेख खुराक।
    1. नकारात्मक नियंत्रण (नेकां) और एक मानक पिपेट का उपयोग RHCE ऊतकों को सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) के 50 μl लागू करें। नेकां बाँझ de-ionized पानी है; पीसी मिथाइल एसीटेट (कैस # 79-20-9) है। जब परीक्षण 30 मिनट के लिए नेकां और पीसी लागू करेंतरल परीक्षण लेख हैैं और 6 घंटे के लिए ठोस परीक्षण के लेख जब परीक्षण।

4. परीक्षण लेख एक्सपोजर - दिवस 1

  1. तरल परीक्षण लेख के उपचार के लिए,। तालिका 3 में दिए गए समय अनुसूची का पालन सभी ऊतकों के लिए बराबर प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक परीक्षा लेख के अनुप्रयोगों के बीच एक मिनट के अंतराल छोड़ दें।
    1. 30 ± 2 मिनट पूर्व उपचार DPBS के बाद, topically topically एक उपयुक्त pipetting डिवाइस का उपयोग RHCE ऊतकों पर 50 नेकां और पीसी के μl, और प्रत्येक तरल परीक्षण लेख लागू होते हैं।
    2. ऊपरी सतह को कवर करने के लिए सीधे ऊतक पर तरल परीक्षण लेख के 50 μl लागू करें। चिपचिपा सामग्री के लिए छिद्र को चौड़ा करने के विंदुक टिप की संकीर्ण बिंदु काट दिया। बहुत चिपचिपा सामग्री के लिए, एक खुराक डिवाइस के लिए परीक्षण लेख (ऊतक डालने या एक प्लास्टिक नक़्शे की पिन के भीतरी व्यास की तुलना में थोड़ा कम व्यास का एक फ्लैट अध्यक्षता सिलेंडर) को लागू करने, खुराक डी पलटनाevice और ऊतक पर यह जगह परीक्षा लेख में समान रूप से संपर्क ऊतक सतह सकें।
    3. परीक्षण लेख ऊतक भर में फैल नहीं करता है, तो यह धीरे पूरे ऊतक सतह पर फैलता है कि यह सुनिश्चित करना डालने नल। मैकेनिकल (एक विंदुक टिप के साथ, उदाहरण के लिए) की परीक्षा लेख के प्रसार यह ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है के बाद से सिफारिश नहीं है।
    4. 30 ± 2 मिनट के लिए एससीसी में ऊतकों को सेते हैं।
  2. ठोस परीक्षण के लेख के उपचार के लिए -। दिवस 1, 4 तालिका में दिया गया समय अनुसूची का पालन सभी ऊतकों के लिए बराबर प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक परीक्षा लेख के अनुप्रयोगों के बीच 2 मिनट के अंतराल छोड़ दें।
    1. 30 ± 2 मिनट पूर्व उपचार DPBS के बाद, topically एक उपयुक्त pipetting डिवाइस का उपयोग RHCE ऊतकों पर 50 नेकां के μl और पीसी लागू होते हैं।
    2. ठोस परीक्षण लेख आवेदन के लिए, सम्मिलित करता है हटाने के लिए (एन = 2) अच्छी तरह से और (एक बाँझ सतह पर उन्हें जगह जैसे, बजे के ढक्कनultiwell प्लेट) मध्यम में spilling एक परीक्षण लेख से बचने के लिए।
    3. एक समतल चम्मच का प्रयोग, topically ऊतक सतह पर परीक्षण लेख के लगभग 50 मिलीग्राम लागू होते हैं; ऊतक की सतह पूरी तरह से परीक्षण लेख द्वारा कवर किया जाता है कि सुनिश्चित करें। परीक्षण लेख ऊतक भर में फैल नहीं करता है, ऊतक पूरी तरह से परीक्षण लेख द्वारा कवर किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के पक्ष की ओर से धीरे डालने हिला। मैकेनिकल (एक विंदुक टिप के साथ, उदाहरण के लिए) की परीक्षा लेख के प्रसार यह ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है के बाद से सिफारिश नहीं है।
      1. यदि आवश्यक हो, परीक्षण लेख और ऊतकों के बीच बेहतर संपर्क की गारंटी के लिए एक मोर्टार और मूसल के साथ क्रिस्टलीय पाउडर पीस।
      2. वैकल्पिक रूप से, अपने सिर के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके डालने के अंदर टिशू कल्चर पर सीधे जगह पाउडर काट दिया। सिरिंज में सामान पाउडर सवार वापस खींचा और फिर नीचे सवार दबाकर लागू किया जाता है।
      3. डालने की बाहरी दीवार सी हैontaminated जैसे, पाउडर से, एक बाँझ धुंध के साथ कणों से साफ कर लें।
    4. खुराक के बाद, संस्कृति के माध्यम से युक्त 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए ऊतकों लौटने और 15 मिनट ± 6 घंटे के लिए एससीसी पर सेते हैं।

5. Rinsing

  1. परीक्षण लेख के अनुसार तीन साफ ​​बीकर (150 मिलीलीटर क्षमता) का एक सेट तैयार है और DPBS के 100 मिलीलीटर के साथ उनमें से प्रत्येक को भरने के लिए। प्रत्येक परीक्षा लेख के लिए, तीन बीकर का एक अलग सेट का उपयोग।
  2. 30 ± 2 मिनट तरल सामग्री के लिए जोखिम या ठोस सामग्री के लिए 15 मिनट जोखिम ± 6 घंटा के अंत में, हटाने और इसे इस्तेमाल किया गया था कि अगर खुराक डिवाइस त्यागें।
  3. ठीक संदंश के साथ प्लास्टिक के 'कॉलर' के ऊपरी किनारे लोभी द्वारा मध्यम से बाहर RHCE ऊतक युक्त सम्मिलित करता लिफ्ट। हैंडलिंग और decanting की सुविधा के लिए घुमावदार संदंश का प्रयोग करें। संदंश का उपयोग अपनी कॉलर द्वारा एक साथ दो प्रतियों आवेषण धारण करके एक समय में ऊतकों दो कुल्ला। सावधान एन बनेंसंदंश के साथ ऊतकों को नुकसान ओ.टी.।
  4. एक साफ शोषक सामग्री पर ऊतक सतह से परीक्षण लेख या नियंत्रण (कागज तौलिया, धुंध, आदि) छानना
  5. , DPBS, लगभग 2 सेकंड के लिए DPBS में एक परिपत्र गति में चक्कर आने के पहले बीकर में सम्मिलित डुबकी वे ज्यादातर DPBS के साथ भरा जाता है, ताकि सम्मिलित करता उठा, और वापस बीकर में तरल छानना। पहले बीकर में इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएँ।
  6. एक ही तरीके से DPBS तीन बार प्रत्येक के दूसरे और तीसरे बीकर में सम्मिलित करता कुल्ला।
  7. शोषक सामग्री पर डालने में शेष कोई भी तरल छानना। एक अनुमानित 45 डिग्री कोण (खुले अंत नीचे) करने के लिए सम्मिलित बारी बारी से और शोषक सामग्री के लिए ऊपरी होंठ को छूने।
    नोट: यह दिखाई परीक्षण सामग्री के सभी दूर करने के लिए संभव नहीं है, तो आगे नहीं rinsing अत्यधिक होने के कारण से निपटने के लिए ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए किया जाना चाहिए।

6. पोस्ट-सोख

  1. Rinsing के बाद,तुरंत पहले एक पूर्व लेबल 12 अच्छी तरह से थाली में आर टी करने के लिए गर्म परख माध्यम के 5 मिलीलीटर में ऊतकों को विसर्जित कर दिया।
  2. तरल सामग्री के लिए 12 ± 2 मिनट या किसी भी अवशिष्ट परीक्षण लेख को हटाने की सुविधा के लिए आरटी पर डूबे ठोस सामग्री के लिए 25 ± 2 मिनट के लिए ऊतकों को सेते हैं।

7. पोस्ट ऊष्मायन

  1. के अंत में, विसर्जन अवधि पोस्ट सोख ऊतकों से परख माध्यम छानना और एक शोषक सामग्री पर सम्मिलित करता दाग।
  2. गर्म परख के माध्यम से 1 मिलीलीटर युक्त पूर्व लेबल 6 अच्छी तरह से थाली में सम्मिलित स्थानांतरण।
    1. तरल परीक्षण सामग्री के लिए एससीसी 120 ± 15 मिनट के लिए ऊतकों को सेते हैं।
    2. ठोस परीक्षण सामग्री के लिए एससीसी पर 18 ± 0.25 घंटे के लिए ऊतकों को सेते हैं।

8. MTT व्यवहार्यता परख - दिवस 1 (तरल पदार्थ के लिए प्रोटोकॉल) और दिन 2 (एसएनएफ के लिए प्रोटोकॉल)

  1. 120 का पोस्ट-ऊष्मायन के बाद MTT परख प्रदर्शन77; तरल पदार्थ के लिए 15 मिनट और क्रमशः ठोस के लिए 18 ± 0.25 घंटा,।
  2. एक पूर्व लेबल 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 1.0 मिलीग्राम / एमएल MTT समाधान और समाधान के विभाज्य 0.3 मिलीलीटर की तैयारी।
    1. वाणिज्यिक MTT किट (5 तालिका) का उपयोग करें:
    2. उपयोग करने से पहले 2 घंटा, आरटी पर MTT ध्यान केंद्रित पिघलना। 2 MTT ध्यान केंद्रित करने की मिलीग्राम और 1.0 मिलीग्राम / एमएल MTT समाधान का उत्पादन करने MTT मंदक के 8 मिलीलीटर का मिश्रण।
    3. उपयोग करें जब तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर MTT समाधान स्टोर। अधिक से अधिक 1 दिन के लिए MTT समाधान की दुकान नहीं है।
  3. पोस्ट ऊष्मायन के अंत में, 6 अच्छी तरह से थाली से प्रत्येक डालने को हटाने और धीरे एक शोषक सामग्री पर दाग।
  4. MTT समाधान के 0.3 मिलीग्राम से युक्त 24 अच्छी तरह से थाली में सम्मिलित रखें। आवेषण के नीचे फंस किसी भी हवाई बुलबुले को छोड़ दें। एससीसी 180 ± 10 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
  5. MTT निकासी
    1. MTT समाधान में 180 ± 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक डालने को दूरऔर 24 अच्छी तरह से थाली से एक शोषक सामग्री पर डालने के नीचे दाग।
    2. गैर-पनीर तरल परीक्षण लेख (जलमग्न निकासी के लिए): इसे डालने submerges इतना है कि एक निकासी समाधान (isopropanol) के 2.0 मिलीग्राम से युक्त एक पूर्व लेबल 24 अच्छी तरह से थाली में सम्मिलित स्थानांतरण।
    3. ठोस और तरल colorants के लिए (गैर जलमग्न निकासी समाधान के संक्रमण से बचने के लिए निकासी): इसे डालने डूब नहीं है कि इतनी निकासी समाधान के 1.0 मिलीलीटर (isopropanol) युक्त एक पूर्व लेबल 6 अच्छी तरह से थाली में सम्मिलित स्थानांतरण।
      नोट: इसी नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के लिए एक ही गैर-जलमग्न निष्कर्षण प्रदर्शन।
  6. (प्लेट कवर और कुओं के ऊपरी छोर के बीच या एक मानक प्लेट मुहर के साथ parafilm के साथ, उदाहरण के लिए) प्लेटों सील। एक कक्षीय थाली प्रकार के बरतन पर प्लेटें प्लेस और MTT को निकालने के लिए 2 आरटी पर घंटा 3 करने के लिए हिला।
    1. वैकल्पिक रूप से, 2-8 से निकासी हे / एन प्रदर्शन76; मिलाते हुए बिना अंधेरे में सी।
  7. गैर-पनीर तरल परीक्षण लेख (जलमग्न निकासी के लिए): निकासी की अवधि के अंत में, प्रत्येक से तरल वापस कुएं में डालने और RHCE ऊतकों के साथ सम्मिलित करता त्यागने छानना।
    1. निकालने समाधान मिश्रण और प्लेट विन्यास (चित्रा 2) के अनुसार एक पूर्व लेबल 96 अच्छी तरह से थाली के उचित कुओं में दो 200 μl aliquots के हस्तांतरण।
  8. ठोस और तरल colorants (गैर जलमग्न निकासी के लिए): निकासी की अवधि के अंत में, ऊतकों (ऊतकों बेध यकीन नहीं बनाने के लिए) त्यागें।
    1. ऊतकों से निकाली समाधान युक्त 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में निकासी समाधान के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें। निकासी समाधान मिश्रण और प्लेट विन्यास (चित्रा 2) के अनुसार एक पूर्व लेबल 96 अच्छी तरह से थाली के उचित कुओं में दो 200 μl aliquots के हस्तांतरण।
  9. टी निर्धारित बनाने के लिएवह 550 और 590 एनएम के बीच एक एकल तरंगदैर्ध्य पर निकाले नमूनों की ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) एक प्लेट रीडर या एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर (एक प्रयोगशाला के भीतर अनुरूप होना चाहिए)।
    1. अघुलनशील ठोस की वजह से परेशान निकालने समाधान, सेंट्रीफ्यूज आयुध डिपो (वाष्पीकरण से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेंट्रीफ्यूज शांत नीचे) को मापने के लिए पहले समाधान के मामले में। मामले से rinsing में परीक्षण लेख (टीए) को दूर नहीं करता और टीए MTT कमी के साथ हस्तक्षेप, अतिरिक्त नियंत्रण किया जाना चाहिए। MTT कमी 16 के लिए सही करने के लिए एक विस्तृत शराबी को देखें।
    2. मामले में एक प्रादेशिक सेना के लिए है, या MTT माप के साथ बातचीत कर सकते हैं, जो रंग विकसित करने के लिए दिखाया गया है, एक अतिरिक्त परीक्षण के लिए बाध्य रंग की राशि का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन किया, और बाद में ऊतकों से निकाला जाना चाहिए। रंग का परीक्षण लेख 16 के लिए सही करने के लिए एक विस्तृत शराबी को देखें।

ऊतक व्यवहार्यता टेस्ट (टेबल 6 और चित्रा 3) & # के लिए 9. गणना160;

  1. जनरल गणना
    1. एक प्रयोग के लिए खाली नियंत्रण कुओं (आयुध डिपो BLK) का मतलब आयुध डिपो मूल्य की गणना।
    2. एक ही प्रयोग (BLK डेटा सही) में से प्रत्येक के आयुध डिपो मूल्य से आयुध डिपो Blk घटाना।
    3. प्रत्येक ऊतक (= सुधारा ओवर ड्राफ्ट) के लिए दो aliquots का मतलब मूल्य की गणना।
  2. औसत नकारात्मक नियंत्रण (100% नियंत्रण) के लिए प्रत्येक नियंत्रण और परीक्षण लेख रिश्तेदार के लिए दो को दोहराने के ऊतकों में से प्रत्येक के प्रतिशत व्यवहार्यता की गणना।
    व्यवहार्यता (%) = [सुधारा आयुध डिपो में इलाज के ऊतकों / सुधारा आयुध डिपो नकारात्मक नियंत्रण] 100% x
  3. व्यवहार्यता (दो दोहराने ऊतकों के बीच व्यवहार्यता अंतर) के अंतर की गणना।
  4. मतलब परीक्षण लेख व्यवहार्यता (टीए व्यवहार्यता) की गणना और भविष्यवाणी मॉडल के अनुसार परीक्षण लेख वर्गीकृत।

10 भविष्यवाणी मॉडल (चित्रा 3)

  1. टीए इलाज ऊतक व्यवहार्यता नेकां इलाज ऊतक वी के लिए> 60.0 रिश्तेदार हैiability, गैर अड़चन (एनआई) के रूप में परीक्षण लेख (जीएचएस कोई श्रेणी) लेबल।
  2. टीए इलाज ऊतक व्यवहार्यता नेकां इलाज ऊतक व्यवहार्यता के लिए 60.0 रिश्तेदार ≤ है, तो अड़चन (मैं) के रूप में परीक्षण लेख लेबल (जीएचएस श्रेणियाँ 1 और 2)।
    नोट: ईआईटी परीक्षण के परिणाम यदि योग्य माना जाता है:
    • ईआईटी नेकां आयुध डिपो> 0.8 और <2.5;
    • (नेकां के सापेक्ष%) ईआईटी पीसी ऊतक व्यवहार्यता ≤50.0% है;
    • दो को दोहराने के ऊतकों (नेकां, पीसी, और परीक्षण लेख) के बीच का अंतर 20.0% <है।

Representative Results

10 परीक्षा लेख (टीए) और नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के साथ आयोजित प्रतिनिधि ईआईटी परिणाम तालिका 6 और चित्रा 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं। नेकां 100% ऊतक व्यवहार्यता से मेल खाती है आयुध डिपो = 1.31 के लिए, इसलिए पीसी (आयुध डिपो मतलब = 0.41) मतलब था 31.2% के सापेक्ष ऊतक व्यवहार्यता। ईआईटी प्रोटोकॉल ठोस जोखिम प्रोटोकॉल का उपयोग, 4 प्रयोगशालाओं में तरल जोखिम प्रोटोकॉल और 8 स्वतंत्र वैध प्रयोगों में उपयोग करते हुए 7 प्रयोगशालाओं में 15 वैध स्वतंत्र प्रयोगों में प्रदर्शन किया गया था, जब तरल प्रोटोकॉल का उपयोग कर पीसी के लिए औसत ऊतक व्यवहार्यता 36.4 ± 4.0 था % और ठोस प्रोटोकॉल के लिए 32.3 ± 6.4%। सभी मामलों में, सकारात्मक नियंत्रण परिणाम 60.0% से 15 की काट मूल्य से नीचे थे।

चित्रा 3, TA1, TA2, TA4, TA7 में दिखाया गया है, और TA8 ऊतक viabilities> 60.0% था और इसलिए "एनआई" के रूप में वर्गीकृत किया गया है। TA3, TA5, TA6, TA9, और TA10 ऊतक viabilities एक्स था04, 60.0% और इसलिए "मैं" के रूप में वर्गीकृत किया गया है। डुप्लिकेट ऊतकों के बीच ऊतक व्यवहार्यता का अंतर TA2 की एक अपवाद के साथ सभी TAs के लिए <20.0% थी। वे सब ईआईटी स्वीकृति मानदंडों (धारा 10.2) से मुलाकात के बाद से इसलिए, TA2 की एक अपवाद के साथ सभी परीक्षण लेख, के लिए परिणाम है, "योग्य" माना जाता था। क्योंकि प्रारंभिक प्रयोग में TA2 के लिए डुप्लिकेट ऊतकों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता की, एक दूसरे प्रयोग योग्य ईआईटी परिणाम प्राप्त करने के लिए जरूरी हो गया था।

इस के साथ साथ RHCE ऊतक मॉडल का उपयोग के रूप में वर्णित ईआईटी परीक्षण विधि EURL ECVAM / प्रसाधन सामग्री यूरोप 15,17-19 द्वारा औपचारिक सत्यापन सहित कई multilaboratory सत्यापन अध्ययन में नेत्र जलन के आकलन के लिए इस्तेमाल किया गया था। अध्ययन के सभी में, ईआईटी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने के लिए दिखाया गया है और सही ढंग से रसायन (पदार्थ और मिश्रण दोनों) आंखों में जलन या गंभीर नेत्र क्षति एसी के लिए वर्गीकरण और लेबलिंग की आवश्यकता नहीं पहचान करने में सक्षम थासंयुक्त राष्ट्र जीएचएस 15,17-19 के मुताबिक। ईआईटी परीक्षण विधि संवेदनशीलता, विशिष्टता, और समग्र सटीकता के लिए आंखों में जलन के लिए मान्यता मैनेजमेंट ग्रुप (VMG) की स्वीकृति मानदंडों को पूरा किया है और वर्तमान में यह इन विवो खरगोश Draize परीक्षण 19 के लिए एक आंशिक स्थानापन्न के रूप में औपचारिक कार्यान्वयन लंबित है।

चित्र 1
चित्रा 1: तरल और ठोस परीक्षण के लेख के लिए ईआईटी प्रोटोकॉल की रूपरेखा संकेताक्षर इस्तेमाल किया: बजे, परख मध्यम;। एससीसी, मानक संस्कृति की स्थिति; पीबीएस, Dulbecco फास्फेट खारा बफर; आरटी, कमरे के तापमान।

चित्र 2
चित्रा 2:। MTT ऊतक व्यवहार्यता परीक्षण के लिए मानकीकृत 96 अच्छी तरह से थाली विन्यास दो 200 μl aliquots टीआरए हैंएक पूर्व लेबल 96 अच्छी तरह से थाली के उचित कुओं को nsferred। संकेताक्षर इस्तेमाल किया: नेकां, नकारात्मक नियंत्रण; पीसी, सकारात्मक नियंत्रण; TA1-TA20, परीक्षण लेख 1-20; खाली, निकासी समाधान। 96 MTT प्लेट विन्यास RHCE ऊतक व्यवहार्यता और ईआईटी परिणामों की गणना करने के लिए तैयार एक्सेल स्प्रेडशीट के साथ प्रयोग किया जाता है।

चित्र तीन
चित्रा 3: ईआईटी परिणाम 10 परीक्षा लेख, नेकां और RHCE ऊतक मॉडल का उपयोग कर पीसी पर नियंत्रण के लिए प्राप्त ग्राफ ईआईटी परिणाम पेश करने के लिए बनाया गया एक एक्सेल स्प्रेडशीट से उत्पन्न होता है।। नेकां के लिए 60.0% सापेक्ष ≤ ऊतक व्यवहार्यता कम है, जो टेस्ट रसायन "परेशानी (" मैं ", TA3, TA5, TA6, TA9, और TA10) और ऊतक व्यवहार्यता> 60.0% गैर-परेशानी के रूप में वर्गीकृत किया जाता था, जो परीक्षण रसायन (के रूप में वर्गीकृत किया जाता है एनआई ", TA1, TA2, TA4, TA7, और TA8)।

ईआईटी प्रोटोकॉल काम चरणों के लिए समय (एक ऑपरेटर के लिए एक दिन का काम) शुरू
प्रत्येक पंक्ति के ऊतकों की एक जोड़ी से मेल खाती है
कदम के आदेश: 1 2 3 4 5 6 7
तरल पदार्थ: पीबीएस टीए
एक्सपोजर 		के बाद
भिगोना 		के बाद MTT
प्रतिक्रिया 		MTT
निष्कर्षण 		उपाय
30 मिनट 30 मिनट 12 मिनट 120 मिनट 180 मिनट 120 मिनट आयुध डिपो
नेकां 9:00 9:30 10:00 10:12 00:12 15:12 के बाद
पीसी 9:01 9:31 10:01 10:13 12:13 15:13 17:30
टीए-1 9:02 9:32 10:02 10:14 12:14 15:14
टीए-2 <> / मजबूत 9:03 9:33 10:03 10:15 12:15 15:15
टीए-3 9:04 9:34 10:04 10:16 12:16 15:16
टीए-4 9:05 9:35 10:05 10:17 12:17 15:17
टीए-5 9:06 9:36 10:06 10:18 00:18 15:18
टीए-6 9:07 9:37 10:07 10:19 00:19 15:19
टीए-7 9:08 9:38 10:08 10:20 12:20 15:20
एनजी> टीए-8 9:09 9:39 10:09 10:21 00:21 15:21
टीए-9 9:10 9:40 10:10 10:22 00:22 15:22
टीए-10 9:11 9:41 10:11 10:23 00:23 15:23

तालिका 3:। तरल परीक्षण लेख के परीक्षण के लिए नमूना समय अनुसूची सहित प्रोटोकॉल कदम पूर्व गीला DPBS, टेस्ट लेख का आवेदन (TAS), rinsing और साथ ऊतकों पोस्ट-लेना, पोस्ट-ऊष्मायन अवधि, MTT परख, MTT की निकासी, और MTT आयुध डिपो के मापन कॉलम में प्रस्तुत कर रहे हैं। डुप्लिकेट ऊतकों के लिए टाइम्स पंक्तियों में आयोजित कर रहे हैं। पूरे परख परीक्षण 10 TAS और नियंत्रण एक दिन में समाप्त हो सकता है।

e_content ">

(2 दिनों एक ऑपरेटर के लिए काम करते हैं) ईआईटी प्रोटोकॉल कदम के लिए समय शुरू
प्रत्येक पंक्ति के ऊतकों की एक जोड़ी से मेल खाती है
दिन 1 दिन 2 (अगले दिन)
कदम के आदेश: 1 2 3 4 5 6 7
एसएनएफ: पीबीएस टीए
एक्सपोजर 		के बाद
भिगोना 		के बाद
Incubaction 		MTT
प्रतिक्रिया 		MTT
निष्कर्षण 		उपाय
30 मिनट 6 घंटा 26 मिनट 18 घंटा 180 मिनट 120 मिनट आयुध डिपो
नेकां 9:00 9:30 15:30 15:56 9:56 12:56 के बाद
पीसी 9:02 9:32 15:32 15:58 9:58 12:58 15:30
टीए-1 9:04 9:34 15:34 16:00 10:00 13:00
टीए-2 9:06 9:36 15:36 16:02 10:02 13:02
टीए-3 9:08 9:38 15:38 16:04 10:04 13:04
टीए-4 9:10 9:40 15:40 16:06 10:06 13:06
टीए-5 9:12 9:42 15:42 16:08 10:08 </ टीडी> 13:08
टीए-6 9:14 9:44 15:44 16:10 10:10 13:10
टीए-7 9:16 9:46 15:46 16:12 10:12 13:12
टीए-8 9:18 9:48 15:48 16:14 10:14 13:14
टीए-9 9:20 9:50 15:50 16:16 10:16 13:16
टीए-10 9:22 9:52 15:52 16:18 10:18 13:18

सारणी 4: ठोस परीक्षण के लेख के परीक्षण के लिए नमूना समय सारणी। सहित प्रोटोकॉल कदम पूर्व गीला rinsing और, पोस्ट-सोख पोस्ट-ऊष्मायन अवधि, MTT परख, MTT की निकासी, और MTT आयुध डिपो के मापन कॉलम में प्रस्तुत कर रहे हैं, DPBS, टेस्ट लेख के आवेदन के साथ ऊतकों। डुप्लिकेट ऊतकों के लिए टाइम्स पंक्तियों में आयोजित कर रहे हैं। 10 TAS और नियंत्रणों का परीक्षण पूरे परख एक दो दिन की अवधि में किया जाता है।

मात्रा अभिकर्मक जमा करने की अवस्था स्रोत विवरण समाप्ति तिथि
एक शीशी,
2 मिलीलीटर 		MTT ध्यान लगाओ (MTT-100-कांग्रेस) प्रकाश से संरक्षित (-20ºC) MatTek जमे हुए MTT ध्यान केंद्रित 2 महीने
एक शीशी,
8 मिलीग्राम 		MTT मंदक 2-8 &# 186; सी MatTek MTT ध्यान केंद्रित गिराए लिए पूर्व MTT परख में उपयोग करने के लिए 2 महीने
1 बोतल,
60 मिलीलीटर 		Isopropanol
(कैस # 67-63-0) 		आरटी सिग्मा Aldrich निकासी समाधान एनए

तालिका 5: MTT -100 परख किट अवयव।

कोड n ° ऊतक कच्चा डेटा खाली सही डेटा आयुध डिपो के मतलब व्यवहार्यता का%
n Aliq। 1 Aliq। 2 Aliq। 1 Aliq। 2
नेकां 1 1.316 1.352 1.316 1.352 1.334 101.6
2 1.277 1.309 1.277 1.309 1.293 98.4
पीसी 1 0.379 0.397 0.379 0.397 0.388 29.6
2 0.419 0.442 0.419 0.442 0.431 32.8
TA1 1 1.213 1.244 1.213 1.244 1.229 93.5
2 1.355 1.355 1.355 1.355 1.355 103.2
TA2 1 1.210 1.122 1.210 1.122 1.166 88.7
2 0.828 0.837 0.828 0.837 0.833 63.4
TA3 1 0.167 0.168 0.167 0.168 0.167 12.7
2 0.138 0.136 0.138 0.136 0.137 10.4
TA4 1 1.137 1.160 1.137 1.160 1.149 87.4
2 1.262 1.191 1.262 1.191 1.227 93.4
TA5 1 0.610 0.621 0.610 0.621 0.616 46.9
2 0.480 0.484 0.480 0.484 0.482 36.7
TA6 1 0.502 0.513 0.502 0.513 0.508 38.7
2 0.396 0.407 0.396 0.407 0.402 30.6
TA7 1 1.048 1.050 1.048 1.050 1.049 79.9
2 1.149 1.150 1.149 1.150 1.150 87.5
TA8 1 1.032 1.034 1.032 1.034 1.033 78.7
2 0.941 0.935 0.941 0.935 0.938 71.4
TA9 1 0.022 0.022 0.022 0.022 0.022 1.7
2 0.144 0.149 0.144 0.149 0.147 11.2
TA10 1 0.150 0.150 0.150 0.150 0.150 11.4
2 0.254 0.255 0.254 0.255 0.255 19.4
मतलब अलग। का मतलब अलग। Dif। / 2 वर्गीकरण
आयुध डिपो की आयुध डिपो की viabilities [%] viabilities की
नेकां 1.314 0.041 100.0 3.12 1.56 एनआई योग्य
पीसी 0.410 0.043 31.2 3.23 1.62 मैं योग्य
TA1 1.292 0.127 98.3 9.63 4.81 एनआई योग्य
TA2 0.999 0.333 76.1 25.36 12.68 एनआई डी> 20
TA3 0.152 0.030 11.6 2.32 1.16 मैं योग्य
TA4 1.188 0.078 90.4 5.94 2.97 एनआई योग्य
TA5 0.549 0.134 41.8 10.16 5.08 मैं योग्य
TA6 0.455 0.106 34.6 8.07 4.03 मैं योग्य
TA7 1.100 0.101 83.7 7.65 3.82 एनआई योग्य
TA8 0.986 0.095 75.0 7.23 3.62 एनआई योग्य
TA9 0.085 0.125 6.4 9.48 4.74 मैं योग्य
TA10 0.203 0.105 15.4 7.95 3.98 मैं योग्य

टेबल 6:। 10 परीक्षा लेख के लिए प्राप्त ईआईटी परिणाम, नेकां और पीसी नियंत्रण टेबल ठेस हैंऊतक व्यवहार्यता और ईआईटी परिणामों की गणना करने के लिए बनाया गया एक एक्सेल स्प्रेडशीट द्वारा uced। नेकां के लिए 60.0% सापेक्ष ≤ ऊतक व्यवहार्यता कम है, जो टेस्ट रसायन "परेशानी (" मैं ", TA3, TA5, TA6, TA9, और TA10) और ऊतक व्यवहार्यता> 60.0% गैर-परेशानी के रूप में वर्गीकृत किया जाता था कि परीक्षण रसायन (के रूप में वर्गीकृत किया जाता है एनआई ", TA1, TA2, TA4, TA7, और TA8)।

Discussion

हम EpiOcular ऊतक मॉडल के लिए विकसित किया गया था कि आंखों में जलन टेस्ट (चित्रा 1) प्रस्तुत किया है। जीएचएस श्रेणी के बीच भेदभाव नहीं करता है इस के साथ साथ के रूप में प्रस्तुत ईआईटी संवेदनशीलता और विशिष्टता 17. ईआईटी की उच्च डिग्री के साथ लेबलिंग (जीएचएस कोई श्रेणी) की आवश्यकता नहीं है कि सामग्री से नेत्र परेशानी और corrosives (जीएचएस श्रेणियाँ 1 और 2 संयुक्त) को अलग करने में सक्षम है 1 श्रेणी से 2 रसायनों। ईआईटी वर्गीकरण और कॉस्मेटिक और दवा सामग्री सहित रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के नेत्र जलन संभावित की लेबलिंग के लिए मान्य किया गया था। इन विट्रो परीक्षणों में दूसरे के साथ संयोजन के रूप में, ईआईटी इन विवो खरगोश आंखों में जलन की परीक्षा के लिए एक स्थानापन्न के रूप में काम करेगा।

ईआईटी जोखिम और बाद जोखिम ऊष्मायन अवधि (चित्रा 1) की लंबाई में भिन्न है जो तरल और ठोस सामग्री, के लिए दो समान है लेकिन अलग प्रोटोकॉल का उपयोग करता है। ईआईटी में इस्तेमाल समापन बिंदुपहले से मान्य मानव उपकला ऊतक मॉडल 20,21 में इस्तेमाल किया गया है जो MTT परख द्वारा निर्धारित ऊतक व्यवहार्यता है। इस परख करने के लिए, मानक सेल संस्कृति उपकरणों के अलावा कोई विशेष उपकरणों की जरूरत है। कारण उच्च ऊतक-से-ऊतक reproducibility के स्तर, एन = 2 ऊतकों के बजाय करने के लिए आमतौर पर की सिफारिश एन = 3 इस्तेमाल कर रहे हैं। क्षमता n का उपयोग करने के लिए = यह कारण व्यक्ति के ऊतकों 14 की अलग से निपटने के लिए इस तरह पैदा कर सकते हैं कि परख की परिवर्तनशीलता को कम करने, एक अनुभवी ऑपरेटर एक साथ दो ऊतकों पर कार्रवाई करने के लिए अनुमति देता है के बाद से 2 ऊतकों, प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू है। इसके अलावा, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ-साथ परीक्षा लेख के अनुसार एन = 2 ऊतकों, एक ही शारीरिक राज्य (तरल या ठोस) के 10 परीक्षण पदार्थों की खीज का उपयोग करके, एक किट (24 ऊतकों) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है।

सामग्री के विश्वसनीय वर्गीकरण सुनिश्चित करना है कि अन्य महत्वपूर्ण बिंदुओं पर सकारात्मक नियंत्रण सु के लिए विनिर्देशों हैंbstance (ऊतक व्यवहार्यता ≤50.0%), डुप्लिकेट ऊतकों (अंतर <20.0%), और नकारात्मक नियंत्रण आयुध डिपो रीडिंग (> 0.8 और <2.5) के बीच reproducibility।

ईआईटी परीक्षण जब प्रदर्शन ऊष्मायन अवधि में प्रोटोकॉल या परिवर्तन से विचलन बदल परिणाम में परिणाम हो सकता है के बाद से, यह मान्य प्रोटोकॉल के लिए और सुझाव खुराक के लिए और rinsing कार्यक्रम (टेबल्स 3 और 4) पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, MTT ऊष्मायन के लिए 3 घंटा समय से विचलन अलग MTT रीडिंग में परिणाम होगा और परख परिणाम को प्रभावित कर सकता है।

कभी कभी, एक परीक्षण रासायनिक MTT ऊतक व्यवहार्यता परख या MTT के कारण कमी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो ऑप्टिकल या अन्य संपत्तियों के लिए हो सकता है। उदाहरण के लिए, एक परीक्षण रासायनिक सीधे नीले, बैंगनी प्रतिक्रिया उत्पाद में MTT कम कर सकते हैं, या MTT formazan (~ 570 एनएम) के रूप में एक ही श्रेणी में प्रकाश को अवशोषित कर लेता है कि एक रंग का पदार्थ हो सकता है। हालांकि, इन परीक्षण रसायनों जनसंपर्क होगाMTT परख के समय, सामग्री की एक पर्याप्त राशि अभी भी ऊतक पर उपस्थित (या द्वारा अवशोषित) है, तो केवल एक समस्या ESENT। इस हस्तक्षेप से बचने के लिए, व्यापक rinsing प्रक्रियाओं ईआईटी प्रोटोकॉल में शामिल कर रहे हैं। टीए को दूर नहीं करता rinsing और टीए MTT कमी के साथ हस्तक्षेप करते हैं, तो अतिरिक्त नियंत्रण का पता लगाने के लिए किया जाता है और इसके लिए सही किया जाना चाहिए। परीक्षण रसायन के प्रत्यक्ष MTT कमी संदेह है कि अगर संक्षेप में, सवाल में रसायन के 50 μl (या ठोस के लिए 50 मिलीग्राम) एससीसी (नेकां, बाँझ विआयनीकृत पानी की 50 μl पर काम कर रहे MTT समाधान के साथ 3 घंटे के लिए incubated है, होना चाहिए ) साथ-साथ चलेंगी। MTT समाधान नीले, बैंगनी बदल जाता है, परीक्षण लेख MTT कम कर दिया है माना जाता है। इस मामले में फ्रीज मारे गए ऊतक नियंत्रण का उपयोग कर एक कार्यात्मक की जांच परीक्षा सामग्री ऊतक के लिए बाध्य है और एक झूठी MTT कमी के संकेत के लिए अग्रणी है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए किया जाना चाहिए। टीए-अवगत कराया, मारे गए ऊतक नियंत्रण में प्रशंसनीय MTT कमी नहीं है, तो(इलाज व्यवहार्य ऊतक में राशि के सापेक्ष), परीक्षण लेख का मतलब ऊतक व्यवहार्यता मारे गए नियंत्रण का मतलब व्यवहार्यता को घटा कर सही किया जाना चाहिए।

नकारात्मक झूठी वर्गीकरण 14,15,18 की कम भार द्वारा प्रदर्शन के रूप ईआईटी, सुरक्षा के पक्ष में errs। महत्वपूर्ण बात है, आंख के लिए संक्षारक कर रहे हैं और जो जीएचएस श्रेणी 1 रसायन, में से कोई भी, सबसे गंभीर नेत्र खतरा प्रतिनिधित्व इस परख 14,15,18,19 में गैर परेशान के रूप में वर्गीकृत किया गया है। अंत में, इन विट्रो परीक्षा पद्धति में RHCE का प्रमुख लाभ में से एक साफ तरल और (दो आयामी, जलमग्न सेल संस्कृतियों के साथ संभव नहीं है) ठोस सामग्री के परीक्षण की संभावना है।

ईआईटी संयुक्त राष्ट्र जीएचएस वर्गीकरण और लेबलिंग प्रणाली के अनुसार सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के नेत्र जलन क्षमता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण योगदान होगा। जानवरों के प्रतिस्थापन ओ निर्धारित करने के लिएcular विषाक्तता कई वर्षों के लिए विषाक्तता अनुसंधान के एक लक्ष्य दिया गया है। ईआईटी परीक्षण विधि 2014 में EURL ECVAM द्वारा समर्थित एक औपचारिक मान्यता के अध्ययन पूरा कर लिया है और EpiOcular ईआईटी 2015 में ओईसीडी टीजी 492 के रूप में ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश में लागू किया गया था।

Disclosures

इस लेख के लिए प्रकाशन फीस MatTek निगम द्वारा भुगतान किया गया।

Acknowledgments

लेखकों ईआईटी परियोजना के लिए समर्पित उनकी वैज्ञानिक समर्थन और समय के लिए डॉ जॉन Harbell को धन्यवाद देना चाहूंगा। लेखकों को भी, Beiersdorf एजी (जर्मनी), IIVS (यूएसए), मरियम Kay इंक (यूएसए), एवन उत्पाद इंक (यूएसए), प्रोक्टर एंड गैंबल / Cosmital (स्विट्जरलैंड), Laboratoire पियरे fabre (फ्रांस) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं हरलन लेबोरेटरीज (यूनाइटेड किंगडम), और आंखों में जलन टेस्ट 15 की बहु केंद्र इंटरनेशनल पूर्व मान्यता और मान्यता के अध्ययन में भाग लेने के लिए एलवीएमएच parfume (फ्रांस)।

References

  1. National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).
  2. Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).
  3. Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
  4. Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
  5. Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
  6. Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
  7. Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
  8. Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
  9. Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
  10. McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243 (2002).
  11. Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249 (2007).
  12. Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378 (2009).
  13. Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
  14. Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
  15. Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. , (2013).
  16. MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).
  17. Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).
  18. Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
  19. Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).
  20. Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).
  21. Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 102 वैकल्पिक तरीकों कॉर्निया EpiOcular EURL ECVAM आंखों में जलन इन विट्रो MTT व्यवहार्यता परख नेत्र जलन में पहुंच नेत्र ऊतक मॉडल RHCE खंगाला
खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का उपयोग नेत्र परेशान रसायन का खतरा पहचान के लिए आंखों में जलन टेस्ट (ईआईटी)
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Kaluzhny, Y., Kandárová,… More

Kaluzhny, Y., Kandárová, H., d’Argembeau-Thornton, L., Kearney, P., Klausner, M. Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model. J. Vis. Exp. (102), e52979, doi:10.3791/52979 (2015).

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