Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع يستند إلى PCL النشطة بيولوجيا، "تركيب الذاتي" الشكل الذاكرة البوليمرات سقالة

Published: October 23, 2015 doi: 10.3791/52981
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Material Science and Engineering, Texas A&M University, 3Institute of Advanced Materials and Technology, University of Science & Technology Beijing

Introduction

تعتبر حاليا معيار الذهب من القحف-الوجه والفكين (CMF) علاجات خلل العظام، وأعاقت زرع الطعوم ذاتي تحصد إجراءات التطعيم معقدة، موقع المانحة الاعتلال ومحدودية 1. وثمة صعوبة معينة يتم تشكيل وتحديد الطعم الذاتي جامدة بإحكام في عيب من أجل الحصول على الاندماج العظمي ومنع الكسب غير المشروع ارتشاف. وقد تم التحقيق هندسة الأنسجة كاستراتيجية بديلة لتطعيم ذاتي وبدائل العظام الاصطناعية (مثل الاسمنت العظام) 2،3. حاسمة لنجاح نهج هندسة الأنسجة هو سقالة مع مجموعة محددة من خصائص. أولا، من أجل تحقيق الاندماج العظمي، يجب على سقالة تشكيل اتصال وثيق مع أنسجة العظام المجاورة (4). وينبغي أيضا أن يكون سقالة عظمي، والسماح الهجرة الخلية، نشر المغذيات وneotissue ترسب 4،5. ويتحقق هذا السلوك عادة مع هيئة السلع التموينية القابلة للتحللffolds اظهار التشكل المسام مترابطة للغاية. وأخيرا، يجب أن يكون سقالة النشطة بيولوجيا وذلك لتعزيز التكامل والترابط مع الأنسجة المحيطة عظم 5.

هنا، نقدم بروتوكول لإعداد سقالة هندسة الأنسجة مع هذه الخصائص. الأهم من ذلك، هذا سقالة المعارض القدرة على "صالح الذاتي" إلى عيوب CMF غير النظامية بسبب شكل السلوك الذاكرة 6. ومن المعروف أن البوليمرات الذاكرة شكل Thermoresponsive (SMPS) للخضوع لتغيير الشكل عند التعرض للحرارة 7،8. وتتألف المكاتب الصغيرة من "netpoints" (أي مادة كيميائية أو crosslinks المادية) التي تحدد شكل دائم و "شرائح التحول" التي تحافظ على شكل مؤقت واستعادة شكل دائم. شرائح التبديل يحمل درجة الحرارة الحرارية التي تمر بمرحلة انتقالية (T العابرة) الموافق إما التحول الزجاجي (T ز) أو تذوب الانتقالية (T م) من البوليمر. مثلنتيجة لذلك، المكاتب الصغيرة قد تكون مشوهة بالتتابع في شكل مؤقت في T> T العابرة، ثابتة في شكل مؤقت في T <T العابرة، واستعاد لشكل دائم في T> T العابرة. وهكذا، يمكن للسقالة SMP تحقيق "ذاتيا المناسب" في غضون عيب CMF كما يلي 6. بعد التعرض لتسخين المياه المالحة (T> T العابرة)، سقالة SMP سوف تصبح طيعة، والسماح أسطواني سقالة مستعدة بشكل عام لتكون إلى خلل وعدم انتظام لضغوط ناحية، مع شكل الانتعاش والعمل على توسيع السقالة إلى حد العيب. على التبريد (T <T العابرة)، فإن سقالة يعود إلى حالته أكثر جمودا نسبيا، مع شكل ثبات الحفاظ على شكله مؤقت جديد داخل هذا العيب. في هذا البروتوكول، ويتم إعداد سقالة SMP من polycaprolactone (PCL)، بوليمر قابلة للتحلل ودرس على نطاق واسع لتجديد الأنسجة والتطبيقات الطبية الحيوية الأخرى 9-11. للذاكرة الشكل، عشره T م PCL بمثابة T عبر وتتراوح ما بين 43 و 60 درجة مئوية، اعتمادا على الوزن الجزيئي للPCL 12. في هذا البروتوكول، وT العابرة (أي T م) من سقالة هو 56.6 ± 0.3 درجة مئوية 6.

من أجل تحقيق osteoconductivity، تم وضع بروتوكول لجعل السقالات SMP استنادا PCL مع المسام مترابطة إلى حد كبير على أساس طريقة الصب المذيبات الجسيمات الرشح (SCPL) 6،13،14. وقد استخدمت diacrylate Polycaprolactone (PCL-DA) (M ن = ~ 10000 جم / مول) للسماح السريع، يشابك الضوئي وحلت في ثنائي كلورو ميثان (DCM) للسماح المذيبات الصب على مدى قالب الملح. وبعد العلاج الضوئي وتبخر المذيبات، تم إزالة قالب الملح الارتشاح في المياه. متوسط ​​حجم الملح ينظم حجم سقالة المسام. الأهم من ذلك، وتنصهر في قالب الملح بالماء قبل الصب مذيب لتحقيق المسام interconnectiviتاي.

تم اضفاء النشاط الحيوي للسقالة SMP من قبل في تشكيل الموقع من طلاء polydopamine على مسام الجدران 6. وغالبا ما قدم النشاط الحيوي في السقالات بإدراج الزجاج أو السيراميك والزجاج الحشو 15. ومع ذلك، وهذه قد تؤدي إلى الخواص الميكانيكية هشة غير المرغوب فيها. وقد تبين الدوبامين لتشكيل طبقة رقيقة ملتصقة polydopamine على مجموعة متنوعة من ركائز 16-19. في هذا البروتوكول، تعرض السقالة SMP إلى الحل الأساسي قليلا (درجة الحموضة = 8.5) الدوبامين لتشكيل طلاء nanothick من polydopamine على جميع الأسطح جدار المسام 6. بالإضافة إلى تعزيز hydrophilicity السطح لتحسين التصاق الخلية والانتشار، وقد تبين polydopamine أن يكون النشطة بيولوجيا من حيث تشكيل هيدروكسيباتيت (هاب) عند التعرض لمحاكاة السوائل في الجسم (SBF) 18،20،21. في الخطوة الأخيرة، يتعرض السقالة المغلفة للحرارة العلاج في 85 درجة مئوية (T> T العابرة) WHالتراث الثقافي غير المادي يؤدي إلى سقالة التكثيف. ولوحظ المعالجة الحرارية في السابق على أنها ضرورية للسلوك ذاكرة شكل سقالة، وربما يرجع ذلك إلى مجالات البلورية PCL إعادة تنظيم لأقرب القرب 14.

نحن بالإضافة إلى ذلك وصف الطرق لوصف السلوك المناسب الذاتي ضمن عيب نموذج غير النظامية، وتشكيل السلوك الذاكرة من حيث دوري الحرارية اختبارات الضغط الميكانيكي التي تسيطر عليها سلالة (أي شكل الانتعاش وتشكيل ثبات)، المسام التشكل، والنشاط الحيوي في المختبر. وتعرض أيضا استراتيجيات لتفصيل خصائص السقالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليف PCL-DA Macromer

  1. تشغيل رد الفعل acrylation.
    1. تزن 20 غراما من PCL-ديول (M ن = ~ 10000 جم / مول) في 250 مل قارورة أسفل جولة مزودة بقضيب مغناطيسي المغطاة تفلون.
    2. حل PCL-ديول في DCM.
      1. إضافة 120 mLlof DCM إلى قارورة (تركيز = 0.17 ز مل /).
      2. وضع الحاجز المطاطي فضفاضة في عنق القارورة وذلك لتجنب تراكم الضغط في حين منع أيضا تبخر DCM.
      3. حل ضجة ل~ 30 دقيقة في ~ 250 دورة في الدقيقة لتذوب تماما البوليمر.
    3. إضافة ~ 6.6 ملغ من 4 dimethylaminopyridine (DMAP) إلى حل وتذوب مع التحريك.
    4. وضع الحاجز المطاطي بشكل آمن في عنق القارورة. يسمح الحل ليستمر التحريك.
    5. من خلال الحاجز المطاطي، تطهير بلطف القارورة مع N 2 ب ~ 3 دقائق باستخدام إيجابي N 2 مدخل الضغط إبرة وإبرة المفتوحةكمتنفس.
    6. إزالة مدخل N 2 ومنفذ.
    7. إضافة 0.56 مل (4.0 ملمول) من ثلاثي الإيثيلامين (ET 3 N) قطرة قطرة عن طريق حقنة زجاجية مجهزة إبرة من خلال الحاجز المطاطي.
    8. إضافة 0.65 مل (8.0 ملمول) من acryloyl قطرة قطرة كلوريد عن طريق حقنة زجاجية مجهزة إبرة من خلال الحاجز المطاطي.
    9. العودة مدخل N 2 إلى قارورة والسماح للمحتويات لإثارة تحت ضغط إيجابي N 2 ب ~ 30 دقيقة.
    10. قبل حرارة حمام الزيت إلى 55 درجة مئوية.
    11. بعد المخصص ~ 30 دقيقة، وإزالة مدخل N 2 واستبدال الحاجز مع مكثف.
    12. غمر القارورة في حمام الزيت الساخن مسبقا.
    13. السماح محتويات القارورة لاثارة لمدة 20 ساعة.
    14. بعد تخصيص 20 ساعة، وإزالة قارورة من حمام الزيت والسماح محتويات لتبريد لRT.
    15. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة DCM المذيب من القارورة.
  2. Purify المنتج PCL-DA الخام.
    1. إلى القارورة، إضافة ~ 135 مل من خلات الإيثيل وحل الخام PCL-DA.
    2. خطورة تصفية حل من خلال ورق الترشيح في نظيفة 250 مل قارورة أسفل جولة. (ملاحظة: الحل قد رشاقته على ورقة الترشيح، لا يمر بسهولة من خلال إذا كان الأمر كذلك، تطبيق بعناية حرارة معتدلة بمسدس التدفئة.)
    3. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة خلات الإيثيل المذيبات من القارورة.
    4. إلى القارورة، إضافة ~ 140 مل من DCM وحل الخام PCL-DA.
    5. نقل المحتويات إلى 500 مل قمع فصل.
    6. إلى القمع، إضافة 13.5 مل من 2 M كربونات البوتاسيوم (K 2 3 CO).
    7. سقف القمع. المزيج بلطف طبقتين بواسطة قلب القمع ويحوم مرة واحدة أو مرتين بلطف، مع الحرص على اطلاق سراح الضغط عن طريق محبس. كرر 3 مرات.
    8. استبدال الغطاء بطبقة من parafilm والسماح للخليط لفصل O / N (~ 12 ساعة).
    9. جمع القاع، أوطبقة غانيتش في قارورة 250 مل مخروطي.
    10. إضافة ~ 5 غرامات من اللامائية كبريتات المغنيسيوم (MgSO 4) إلى القارورة ودوامة بلطف.
    11. خطورة تصفية الخليط من خلال ورقة مرشح والنوعية في نظيفة 250 مل قارورة أسفل جولة.
    12. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة DCM المذيب من القارورة.
    13. الجافة تحت فراغ عالية لإزالة المتبقي DCM. (ملاحظة: PCL-DA يجب أن يتم تخزينها بعيدا عن الضوء.)
    14. تأكيد acrylation مع 1 H NMR 22،23.

2. إعداد SMP سقالة (الشكل 1)

  1. إعداد قالب الملح المنصهر.
    1. استخدام منخل 425 ميكرون للحصول على كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) الجسيمات ~ 460 ± 70 ميكرون في القطر. (ملاحظة: متوسط ​​حجم الجسيمات يمكن تأكيد من المجهر الإلكتروني [SEM] الصور مع برنامج يماغيج.) 14
    2. إلى قنينة زجاجية 3 مل (ID = 12.9 مم)، إضافة 1.8 غرام من كلوريد الصوديوم منخول سابقا.
    3. إضافة ببطء، في أربعة أجزاء، 7.5٪ بالوزن (على أساس الوزن الملح) المياه DI (0،146 ز) إلى القارورة. تخلط مع ملعقة معدنية بعد إضافة كل جزء من الماء.
    4. سقف القارورة، والتفاف في الأنسجة ووضع عموديا في أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 3220 ز س.
    5. إزالة الغطاء وترك O-الهواء الجاف / N (~ 12 ساعة).
  2. في قارورة زجاجية جديدة، وإعداد "حل macromer" من خلال الجمع بين 0.15 غرام من PCL-DA لكل مل من DCM. (ملاحظة: للحصول على سقالة واحد، ~ 1 مل من محلول ينبغي إعداد) كاب وتخلط الحل بسرعة عالية على خلاط دوامة ل~ 1 دقيقة.
  3. في الجديدة 3 مل قنينة زجاجية، وإعداد "حل photoinitiator" على أساس 10٪ بالوزن 2،2-dimethoxy-2-فينيل acetophenone (DMP) في 1-فينيل-2-pyrrolidinone (NVP). الجمع بين 0.115 غرام من DMP في 1 مل من NVP. (ملاحظة: للحصول على سقالة واحد، ~ مطلوب 180 ميكرولتر.) قبعة، والتفاف في رقائق الألومنيوم (لمنع الضوء) وتخلط الحل بسرعة عالية على خلاط دوامةل~ 1 دقيقة. (ملاحظة: إذا أعدت في مرحلة متقدمة، يجب تبريد الحل ومحمية من الضوء.)
  4. التفاف القارورة التي تحتوي على حل macromer (باستثناء الغطاء) بورق الألمنيوم (لمنع الضوء) وإضافة عن طريق ماصة المجلد 15٪ (على أساس الحجم الكلي للحل macromer) من الحل photoinitiator. غطاء وتخلط الحل بسرعة عالية على خلاط دوامة ل~ 1 دقيقة.
  5. التفاف القارورة التي تحتوي على قالب الملح المنصهر (باستثناء الغطاء) بورق الألمنيوم (لمنع الضوء) وإضافة عن طريق ماصة الحل macromer / photoinitiator معدة مسبقا (~ 0.6 مل أو حتى القالب مغطى تماما).
  6. سقف القارورة، والتفاف في الأنسجة ووضع عموديا في أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1260 x ج لتوزيع الحل macromer في جميع أنحاء القالب.
  7. إزالة رقائق الألومنيوم، إرفع قبعة القارورة وفضح لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر، 25 W) لمدة 3 دقائق. O الهواء الجاف / N.
  8. إزالة "scaffol التي تحتوي على الملحد "من القارورة مع ملاقط بعد أن سجل وكسر الجزء العلوي من قارورة زجاجية.
  9. في كوب 400 مل، وإعداد ~ 200 مل من الماء / الإيثانول المذيبات (1: 1 المجلد: المجلد).
  10. الحفاظ على سقالة غارقة في المياه / الإيثانول المذيبات لمدة 4 أيام مع التغييرات المذيبات اليومية.
  11. إزالة السقالة من المذيبات والهواء الجاف O / N.

3. تطبيق Polydopamine طلاء لSMP سقالة (الشكل 1)

  1. في 400 مل دورق مزودة بقضيب المغطاة تفلون، وإعداد ~ 200 مل من محلول الدوبامين هيدروكلوريد (2 ملغ / مل في 10 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة = 8.5، 25 درجة مئوية). إثارة في ~ 150 دورة في الدقيقة.
  2. وضع إبرة يمكن التخلص منها (الطول = 40 مم؛ مقياس = 20) في سقالة، ~ نصف المسافة من خلال منصة الاعدام. لف سلك حول محور الإبرة.
  3. غمر سقالة (مع محور إبرة فوق سطح الحل) في حل الدوبامين التحريك من خلال ربط السلك إلى حافة الكأس.
  4. ديغا السقالة عن طريق وضع الحقنة في محور إبرة واستخدامها لسحب الهواء من السقالة. (ملاحظة: إفراغ الغاز اكتمال عندما لا مزيد من الهواء يمكن إزالة والحل قد تسللت تماما السقالة).
  5. الحفاظ على سقالة غارقة في حل الدوبامين مع التحريك لمدة 16 ساعة.
  6. إزالة السقالة من الحل وإزالة الإبرة. يشطف بالماء DI وجاف في فرن فراغ في RT لمدة 24 ساعة.
  7. ضع سقالة في الفرن 85 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  8. السماح للسقالة لتبريد لRT. سوف سقالة اسطوانية النهائية ستكون ~ 6 مم قطر × ~ 5 مم الارتفاع.

4. تقييم سلوك "تركيب الذاتي"

  1. إعداد "CMF نموذج عيب عدم انتظام" باستخدام ورقة من البلاستيك القوي الذي سمك غير ~ 5 مم. استخدام الحفر لخلق فراغا داخل ورقة من البلاستيك مع متوسط ​​قطرها أقل قليلا من ~ 6 مم، كما هو موضح في الشكل 2A.
  2. في أبايكر، المياه DI الحرارة (الذي يمثل الاستخدام السريري من المياه المالحة) إلى درجة حرارة 60 درجة مئوية ~.
  3. ضع سقالة في كوب من ~ 60 درجة مئوية الماء. استخدام ملاقط لدفع سقالة تحت سطح الماء، وفضح كافة المجالات إلى الماء. يستمر ل~ 2 دقيقة أو حتى خففت السقالة بشكل ملحوظ (الشكل 2B).
  4. إزالة السقالة من كوب واضغط على الفور (باليد) إلى خلل نموذج.
  5. السماح لتبرد لRT (~ 5-10 دقيقة) (الشكل 2C).
  6. إزالة من خلل لمراقبة، شكل مؤقت ثابت جديد وعودة الدولة أكثر جمودا نسبيا (الشكل 2D).

5. اختبار الشكل الذاكرة السلوك

  1. باستخدام محلل الميكانيكي الحيوي (DMA؛ على سبيل المثال TA الآلات Q800 كما المستخدمة هنا)، تشغيل دوري الحرارية اختبار ضغط الميكانيكية التي تسيطر عليها الضغط على سقالة على دورتين (N) لتحديد شكل ثبات (R و) وتشكيل الاسترداد (R ص) (الشكل 3).
    1. تتوازن إلى 60 درجة مئوية (عالية T) لمدة 5 دقائق.
    2. ضغط إلى أقصى سلالة (ε م = 50٪) في 50٪ / دقيقة.
    3. عقد في ε م (5 دقائق).
    4. بارد إلى 25 ° C (T منخفض) والحفاظ على لمدة 10 دقيقة لإصلاح شكل مؤقت.
    5. إزالة هذا العبء.
    6. قياس الضغط في نهاية المطاف في دولة خالية من الإجهاد (ε ش).
    7. يسخن إلى 60 درجة مئوية (عالية T) والحفاظ على لمدة 10 دقيقة لاستعادة شكل دائم.
    8. قياس الضغط تعافى (ε ع).
    9. في حين لا يزال في 60 ° C (ارتفاع T)، تبدأ دورة الثانية 2 (N = 2) عن طريق ضغط السقالة إلى 50٪ من ارتفاع تعافى بعد الحادي دورة 1 (N = 1).
    10. كرر 5.1.3-5.1.8 لN = 2.
    11. حساب R و R و R لN = 1 و 2 باستخدام المعادلات التالية:
      R و (N) = [ε ش (N) / ε م] R ص (N) = [ε م - ε ص (N)] / [ε م - ε ص (N -1)]

6. تصور حجم المسام والمسام ربط بيني

  1. باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM، على سبيل المثال الاتحاد الدولي للفروسية كوانتا SEM المستخدمه هنا)، ومراقبة حجم المسام والمسام الترابط.
    1. باستخدام الملقط لعقد سقالة SMP، غمر في السائل N 2 لمدة 1 دقيقة.
    2. إزالة من N السائل 2 وكسر على طول منتصف سقالة بشفرة حلاقة نظيفة.
    3. باستخدام شريط الكربون، يلصق أحد نصفي SMP سقالة على عينةالمرحلة مع سطح بكسر مواجهة.
    4. تفل معطف مع الاتحاد الافريقي حزب العمال (~ 4 نانومتر).
    5. التقاط صورة SEM في الجهد تسريع الموصى بها من 10-15 كيلو فولت (الشكل 4A).

7. اختبار في المختبر النشاط الحيوي

  1. في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، إضافة ~ 30 مل من 1X SBF 24.
  2. الحصول على سقالة في الأصلي، شكل دائم مصبوب إسطوانيا من العام. قطع سقالة في نصف (عبر الحافة الدائرية) باستخدام شفرة نظيفة.
  3. وضع النصف سقالة الفردية في أنبوب الطرد المركزي مستعد والغطاء.
  4. الحفاظ على أنبوب عند 37 درجة مئوية في حمام الماء تحت ظروف ثابتة مع أية تغييرات SBF.
  5. بعد 14 يوما، إزالة السقالة من SBF والهواء الجاف لمدة 24 ساعة.
  6. باستخدام شريط الكربون، يلصق السقالة على خشبة المسرح عينة مع سطح بكسر مواجهة.
  7. تفل معطف مع الاتحاد الافريقي حزب العمال (~ 4 نانومتر).
  8. التقاط صورة SEM في إعادةوأشاد تسريع الجهد من 10-15 كيلو فولت (الشكل 4B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الناتج استنادا PCL-SMP سقالة قادرة على إلى نموذج CMF خلل في تركيب النفس (الشكل 2). بعد التعرض قصيرة لتدفئة المياه المالحة (~ 60 ° C)، سقالة اسطوانية يلطف السماح السقالة إلى أن الضغط يدويا في وتوسع في عيب نموذج. بعد التبريد لRT، يتم إصلاح سقالة في شكله المؤقت الجديد الذي يتم الاحتفاظ على إزالة من الخلل.

وكميا سلوك الذاكرة شكل من سقالة SMP من قبل دورية الحرارية الاختبارات التي تسيطر عليها سلالة ضغط الميكانيكية من حيث الشكل ثبات (R و) و الانتعاش شكل (R ص) (الشكل 3). لهذا SMP سقالة استنادا PCL، القيم (٪) لدورات N = 1 و 2: R و (1) = 102.5 0.7، R و (2) = 101.8 0.3، R ص (1) 95.3 0.9، وR ص (2) = 99.8 0.2 6.

تعرض سقالة SMP مورفولوجيا المسام مترابطة للغاية كما لوحظبواسطة SEM التصوير (الشكل 4A). وقد تحقق ذلك عن طريق استخدام قالب الملح المنصهر، التي شكلتها إضافة كمية صغيرة من الماء إلى الملح المصفى (الشكل 1).

بعد التعرض لمحاكاة السوائل في الجسم (SBF؛ 1X) لمدة 14 يوما، SEM التصوير يؤكد تشكيل هاب (الشكل 4B) مما يشير سقالة النشاط الحيوي.

الشكل 1
ملفقة الشكل 1. تخطيطي لإعداد SMP سقالة المغلفة مع polydopamine. سقالة ASMP عبر بروتوكول صفها على أساس العلاج الضوئي من diacrylate polycaprolactone (PCL-DA) باستخدام الجسيمات الرشح الصب المذيبات (SCPL) طريقة توظيف تنصهر قالب الملح وتطبيق طلاء polydopamine النشطة بيولوجيا. المعالجة الحرارية النهائية في 85 ° C (T> T العابرة) يستحث سقالة دنsification. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
يتم تركيب الرقم 2. مراقبة السلوك تركيب النفس. A SMP سقالة اسطوانية (~ 6 مم قطر × ~ 5 مم الارتفاع) ضمن "نموذج عيب عدم انتظام" (A) على النحو التالي. عند التسخين في الماء عند 60 درجة مئوية ~ (T> T العابرة)، سقالة تخفف وتصبح طيعة (B)، وبالتالي يمكن الضغط ميكانيكيا ("تركيب") داخل عيب نموذج (C). بعد التبريد لRT، تتم إزالة سقالة SMP ويحتفظ الجديد، شكله الثابتة مؤقت (D). عند التسخين اللاحقة في ~ 60 درجة مئوية، وسقالة يخضع شكل الانتعاش إلى الأصلي، عام شكل اسطواني.

الشكل (3)
وكميا الشكل 3. قياس السلوك الذاكرة الشكل. السلوك الذاكرة شكل سقالة SMP من خلال دوري الحرارية اختبار لسيطرة سلالة الضغط الميكانيكي على سقالة لتحديد شكل ثبات (R و) و الانتعاش شكل (R ص) على أساس قياسات ε م، ش ε، وε ص الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. مراقبة من البرتغاله الترابط وتشكيل هيدروكسيباتيت (هاب). صور الممثل SEM من غير المصقول، المعالجة حراريا SMP سقالة (مقياس بار = 200 ميكرون) (A) والمغلفة، المعالجة حراريا سقالة بعد التعرض لSBF (1X) لمدة 14 يوما (شريط النطاق = 50 ميكرون) (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إعداد، سقالة استنادا PCL-المغلفة polydopamine التي السلوك المناسب النفس، وكذلك osteoinductivity والنشاط الحيوي، يجعل من الفائدة في علاج عدم انتظام عيوب العظام CMF. قد يتم تغيير جوانب البروتوكول لتغيير ملامح مختلفة سقالة.

بروتوكول يبدأ مع acrylation من PCL-ديول للسماح علاج الأشعة فوق البنفسجية. في المثال ذكرت، وPCL-ديول M n هو ~ 10000 ز / مول. ومع ذلك، من خلال تعديل بشكل مناسب كمية من كلوريد acryloyl وإت 3 N استخدامها أثناء تركيب PCL-DA، ديول PCL مع يمكن استخدامها لتقليل أو زيادة، على التوالي، وكثافة تشعبي أعلى أو أدنى M ن.

قالب الملح المنصهر هو عنصر هام لبروتوكول (الشكل 1). متوسط ​​حجم الملح يحدد الناتجة حجم سقالة المسام. في المثال وصفها، كان متوسط ​​حجم الملح ~ 460 ± 70 &# 181؛ م. في حين أن حجم أصغر الملح يمكن استخدامها، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن السقالة يخضع انكماش خلال خطوة المعالجة الحرارية النهائية التي سوف يقلل حجم المسام. ويستخدم النخل من الملح للتقليل من حجم التوزيع الملح، وبالتالي توزيع حجم المسام. لإنتاج سقالة مع المسام مترابطة للغاية، وكان المستحث الانصهار الملح عن طريق إضافة كمية صغيرة من الماء (7.5٪ بالوزن على أساس وزن الملح). ويعرف هذا حل جزئي جزيئات كلوريد الصوديوم المعزولة في قالب poragen المستمر 25،26. اعتمادا على متوسط ​​حجم الملح، ويجب ضبط كمية المياه المضافة 14. وعلاوة على ذلك، خلال الانصهار الملح، ويجب أن يضاف الماء تدريجيا والميكانيكية المختلط وطرد أخيرا لضمان حتى التوزيع التابعة لها فضلا عن التعبئة من جزيئات الملح.

وقد شكلت قالب الملح المنصهر، يذوب PCL-DA في DCM للمذيب الصب. في البروتوكول وصفها، وconcentratioوقد استخدمت ن 0.15 غرام من PCL-DA لكل 1 مل من DCM. ويمكن زيادة هذا التركيز أو انخفض. ومع ذلك، في حين من المتوقع أن يزيد سقالة معامل زيادة تركيزات، فإنه يمكن أيضا إنتاج السقالات مع انخفاض المسام الترابط 14.

مرة واحدة تم إضافة حل السلائف على قالب الملح، الطرد المركزي مفيد لمساعد في انتشارها في القالب. وبعد علاج الأشعة فوق البنفسجية السريع، يسمح تجفيف الهواء تبخر المذيب DCM. بعد إزالة من العفن، وينقع في الماء السقالة / الإيثانول (1: 1 المجلد: المجلد) لمدة 4 أيام لإزالة قالب الملح. SEM التصوير يؤكد تشكيل المسام التشكل مترابطة للغاية (الشكل 4A).

يتم تطبيق طلاء polydopamine لمسام الجدران من السقالة لنقل النشاط الحيوي. نظرا لانكماش الناتج سقالة، فمن الأفضل لتطبيق الطلاء قبل الخطوة النهائية المعالجة الحرارية 6. بالإضافة إلى ذلك، التفريغالسقالة في حين غارقة في حل الدوبامين مائي تساعد التسلل. بقايا سقالة نزع الغاز غارقة في الحل لتسهيل تغطية polydopamine موحدة. مرة واحدة المغلفة وتشطف جيدا، سقالة البيضاء سابقا المعارض صفة اللون البني من polydopamine 21. وهكذا، والتغطية في جميع أنحاء سقالة يمكن تقييمها عن طريق التفتيش البصري عن طريق خفض سقالة لتأكيد polydopamine نشرها.

بعد تطبيق طلاء polydopamine، يتم تنفيذ عملية المعالجة الحرارية النهائية (85 درجة مئوية، 1 ساعة). كما لوحظ، نتائج هذه العملية في سقالة انكماش. ومع ذلك، والمعالجة الحرارية ضرورية لتحقيق شكل سلوك ذاكرة 14، وربما يرجع ذلك إلى إعادة تنظيم المجالات البلورية PCL (أي قطاعات التحول) في أقرب القرب.

كما هو مبين في الشكل 2، سقالة SMP حققت في خلل نموذج تركيب النفس نظرا لthermoresponsive شكل ليموري الطبيعة. التعرض لتسخين المياه المالحة (~ 60 ° C) ذوبان بفعل من المجالات البلورية PCL، بحيث سقالة خففت يمكن أن تضغط على الخلل نموذج. عندما تم الإفراج عن الضغط اليدوي، تعزيز الانتعاش شكل توسيع سقالة لملء حدود غير منتظمة. على التبريد لRT، المجالات البلورية PCL أصلح، وتحديد سقالة في شكله المؤقت الجديد الذي تم الابقاء على العزل من الخلل. سابقا، أكدنا أن المسام على طول حواف سقالة إزالة ظلت مفتوحة تماما على الرغم من الاتصال مع القالب 6.

عندما تقاس دوري الحرارية الاختبارات التي تسيطر عليها سلالة ضغط الميكانيكية (الشكل 3)، ويتميز المثالي السلوك الذاكرة شكل كتبها R و R وص القيم من 100٪. لSMP سقالة وصفها، وكانت القيم R و لدورات 1 و 2 قليلا> 100٪ 6. R و قد لوحظ سابقا أن تكون غرام قليلاآكلى لحوم البشر من 100٪ 14،27 ​​بسبب زيادة طفيفة في سلالة الضغط خلال شكل التثبيت من التبلور من قطاعات PCL إلى المزيد من الهياكل المدمجة أو 27 من التبلور التي يسببها ضغط PCL. بالإضافة إلى ذلك، R ص زيادة من دورة إلى دورة 1 2 6. وقد لوحظ زيادة في قيم ص R سابقا للصلب 28،29،22 والتي يسهل اختراقها المكاتب الصغيرة 13،14،23. ويعتقد أنه خلال الدورة الأولى، تتم إزالة سلالة المتبقية القادمة من معالجة مثل تلك الزيادات شكل الانتعاش في الدورة القادمة 7.

ووصف سقالة هندسة الأنسجة تحقق من مجموعة محددة من خصائص حاسمة لنجاح علاج عيوب العظام CMF. ومن المتوقع أن تسهيل الاندماج العظمي من خلال قدرته على "صالح الذاتي" ضمن CMF عيب العظام غير النظامية السقالة. ومن المتوقع Osteoconductivity على أساس الترابط المسام التي تحققت وكذلكالتحلل البيولوجي سقالة. وأخيرا، نظرا لطلاء polydopamine، السقالة هي النشطة بيولوجيا كما يدل على ذلك تشكيل HA خلال اختبارات في المختبر (الشكل 4B). ومن المتوقع هذا النشاط الحيوي لتسهيل التكامل والترابط مع الأنسجة المحيطة العظام. وهكذا، وهذا سقالة تمثل بديلا للتطعيم ذاتي وبدائل العظام التقليدية لCMF إصلاح الخلل العظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

الكتاب أشكر تكساس A & M جامعة الهندسة وتجربة محطة (تيز) للحصول على الدعم المالي لهذا البحث. ليندساي الأظافر بامتنان بدعم من تكساس A & M جامعة لويس ستوكس التحالف من أجل مشاركة الأقليات (LSAMP) ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF) خريج برنامج زمالة أبحاث (GRFP). داوي تشانغ يشكر جامعة زمالة أطروحة تكساس A & M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) Sigma-Aldrich 440752
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich D65100 Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma-Aldrich D5640
Triethylamine (Et3N) Sigma-Aldrich T0886
Acryloyl chloride Sigma-Aldrich A24109
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 319902
Potassium carbonate (K2CO3) Sigma-Aldrich 209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) Fisher M65
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) Sigma-Aldrich 196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409
Ethanol Sigma-Aldrich 459844
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502
Tris buffer (2mol/L) Fisher BP1759 Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve VWR 47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) UVP 95-0426-02
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) TA Instruments Q800
High Resolution Sputter Coater Cressington 208HR
Scanning Electron Microscope (SEM) FEI Quanta 600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
  2. Elsalanty, M. E., Genecov, D. G. Bone grafts in craniofacial surgery. Craniomaxillofac Trauma Reconstr. 2, 125-134 (2009).
  3. Hollister, S. J., et al. Engineering craniofacial scaffolds. Orthod Craniofacial Res. 8, 162-173 (2005).
  4. Albrektsson, T., Johansson, C. Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration. Eur Spine J. 10, S96-S101 (2001).
  5. Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
  6. Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
  7. Lendlein, A., Kelch, S. Shape-memory polymers. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2034-2057 (2002).
  8. Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
  9. Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
  10. Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
  11. Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
  12. Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
  13. Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
  14. Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
  15. Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
  16. Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
  17. Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
  18. Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
  19. Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
  20. Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
  21. Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
  22. Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
  23. Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
  24. Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
  25. Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
  26. Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
  27. Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
  28. Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
  29. Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 104، ذاكرة الشكل، polycaprolactone، polydopamine، سقالة، قالب الملح والنشطة بيولوجيا، التئام العظام
تصنيع يستند إلى PCL النشطة بيولوجيا، &quot;تركيب الذاتي&quot; الشكل الذاكرة البوليمرات سقالة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nail, L. N., Zhang, D., Reinhard, J. … More

Nail, L. N., Zhang, D., Reinhard, J. L., Grunlan, M. A. Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold. J. Vis. Exp. (104), e52981, doi:10.3791/52981 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter