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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Herstellung eines bioaktiven, PCL-basierte "Self-Montage" Formgedächtnispolymer Scaffold

Published: October 23, 2015 doi: 10.3791/52981
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Material Science and Engineering, Texas A&M University, 3Institute of Advanced Materials and Technology, University of Science & Technology Beijing

Introduction

Zur Zeit als Goldstandard der Kiefer- und Gesichts (CMF) Knochendefekt-Behandlungen, ist die Transplantation von autologen Transplantaten geerntet durch komplexe Transplantation Verfahren, Entnahmemorbidität und der begrenzten Verfügbarkeit 1 behindert. Eine besondere Schwierigkeit ist die Gestaltung und Befestigung des starren Autotransplantat fest in den Defekt, um die Osseointegration zu erhalten und Transplantat Resorption verhindern. Tissue Engineering ist als alternative Strategie zur Autotransplantation und synthetischen Knochenersatzmaterialien (zB Knochenzement) 2,3 untersucht. Entscheidend für den Erfolg einer Tissue-Engineering-Ansatz ist ein Gerüst mit einem bestimmten Satz von Eigenschaften. Erstens, um die Osseointegration zu erreichen, muss das Gerüst engem Kontakt mit angrenzenden Knochengewebe 4 zu bilden. Das Gerüst sollte auch osteokonduktive werden, wodurch die Zellmigration, Nährstoffdiffusion und neotissue Abscheidung 4,5. Dieses Verhalten ist in der Regel mit biologisch abbaubaren sca erreichtffolds die eine hochgradig vernetzten Porenmorphologie. Schließlich sollte das Gerüst bioaktiven sein, um die Integration und Bindung mit umgebenden Knochengewebe 5 zu fördern.

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Gewebetechnik Gerüst mit diesen Eigenschaften herzustellen. Wichtig ist, weist dieses Gerüst die Fähigkeit, "self-fit" in unregelmäßige CMF Defekte aufgrund seiner Formgedächtnisverhalten 6. Thermoresponsive Formgedächtnispolymere (SMP) sind dafür bekannt, Formänderung bei Belichtung unterziehen, um zu heizen 7,8. SMPs sind von "Netzpunkte" (dh chemische oder physikalische Vernetzungen), die die permanente Form und "Schaltsegmente", die die temporäre Form zu erhalten und wiederherzustellen die permanente Form festzustellen, besteht. Die Schaltsegmente weisen eine Wärmeübergangstemperatur (T trans) entspricht, entweder die Glasübergangs (Tg) oder Schmelzübergang (Tm) des Polymers. AlsFolglich können SMPs nacheinander in eine temporäre Form bei T> T trans, in der temporären Form bei T <T trans fixiert verformt werden und wiedergewonnen, um die permanente Form bei T> T trans. Somit wird ein SMP-Gerüst "Selbst-Montage" in einem CMF Defekt erreichen könnte wie folgt 6. Nach der Belichtung mit warmer Kochsalzlösung (T> T trans), wäre ein SMP-Gerüst werden zu formbaren, wodurch eine allgemein vorbereiteten zylindrischen Gerüst Hand gepressten in einem unregelmäßigen defekt sein, mit Formrück Förderung Expansion des Gerüsts des Mangels Grenze. Beim Abkühlen (T <T trans), würde das Gerüst seiner relativ starrer Zustand zurück, mit Formstarrheit seiner neuen temporären Form innerhalb des Defekts erhalten bleibt. In diesem Protokoll wird ein SMP-Gerüst von Polycaprolacton (PCL) hergestellt, ein biologisch abbaubares Polymer intensiv untersucht für die Geweberegeneration und andere biomedizinische Anwendungen 9-11. Für Formgedächtnis, the T m von PCL dient als die T trans und variiert zwischen 43 und 60 ºC, abhängig vom Molekulargewicht des PCL 12. In diesem Protokoll wird die T trans (dh T m) des Gerüstes beträgt 56,6 ± 0,3 ºC 6.

Um Osteokonduktivität zu erreichen, wurde ein Protokoll entwickelt, um PCL-basierten SMP Gerüste mit stark miteinander verbundenen Poren auf der Basis eines Lösungsmittelgießen Partikel-Laugung (SCPL) Methode 6,13,14 zu machen. Polycaprolacton-diacrylat (PCL-DA) (M n = ~ 10.000 g / mol) wurde verwendet, um eine schnelle, photochemischen Vernetzung zu ermöglichen, und wurde in Dichlormethan (DCM) gelöst, um Lösungsmittel-Gießen über der Salzvorlage ermöglichen. Nach der photochemischen Härtung und Lösungsmittelverdampfung wurde das Salz Vorlage durch Auslaugen in Wasser entfernt. Die durchschnittliche Salzgröße regelt Gerüstporengröße. Wichtig ist, das Salz-Vorlage mit Wasser verschmolzen wurde vor der Lösungsmittel-Gießen zur Poren interconnectivi erreichenty.

Bioaktivität wurde auf Porenwänden 6 zu der SMP-Gerüst durch die in situ-Bildung eines polydopamine Beschichtung verliehen wird. Bioaktivität wird häufig durch Einschluß von Glas oder Glaskeramik-Füllstoffe 15 in Gerüste eingebracht. Doch diese können zu unerwünschten spröden mechanischen Eigenschaften zu geben. Dopamin ist gezeigt worden, um eine haftende, dünne polydopamine Schicht auf einer Vielzahl von Substraten 16-19 bilden. In diesem Protokoll wurde die SMP Gerüst einer leicht basischen Lösung (pH = 8,5) von Dopamin zogen, um eine Beschichtung von polydopamine nanothick auf allen Porenwandoberflächen 6 bilden. Zusätzlich zur Verbesserung Oberflächenhydrophilie für verbesserte Zelladhäsion und Ausbreitung hat polydopamine gezeigt worden bioaktiven in Bezug auf die Bildung von Hydroxyapatit (HAp) bei Belichtung mit simulierter Körperflüssigkeit (SBF) 18,20,21 sind. In einem letzten Schritt wird das beschichtete Gerüst ausgesetzt Behandlung bei 85 ºC (T> T trans) wh erhitzenich führt zu Verdichtung Schafott. Wärmebehandlung wurde bereits erwähnt die für Gerüstformgedächtnisverhalten zu sein, möglicherweise aufgrund PCL kristallinen Domänen Reorganisation um eine größere Nähe 14.

Wir beschreiben außerdem die Methoden, um die Selbstsitz Verhalten innerhalb einer unregelmäßigen Modell Defekt zu charakterisieren, Formgedächtnisverhalten in Bezug auf Belastung gesteuerte zyklische thermomechanische Druckversuche (dh Wiederherstellung der Form und Gestalt Festigkeit), Porenmorphologie und In-vitro-Bioaktivität. Strategien zur Gerüsteigenschaften maßzuschneidern werden ebenfalls vorgestellt.

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Protocol

1. Synthesizing PCL-DA Makromer

  1. Führen Sie das Acrylierung Reaktion.
    1. Wiegen 20 g PCL-Diol (Mn = ~ 10.000 g / mol) in einem 250 ml Rundkolben, der mit einem mit Teflon überzogen Magnetrührstab ausgestattet.
    2. Lösen Sie die PCL-diol in DCM.
      1. Zugabe von 120 mLlof DCM in den Kolben (Konzentration = 0,17 g / ml).
      2. Platzieren Gummiseptum lose in den Hals des Kolbens, um Druckaufbau zu vermeiden, während auch Verdampfung von DCM zu verhindern.
      3. Stir-Lösung für ca. 30 min bei ~ 250 Upm, um das Polymer vollständig aufzulösen.
    3. Hinzufügen ~ 6,6 mg 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) zu der Lösung und Rühren lösen.
    4. Platzieren einem Gummiseptum fest in den Hals des Kolbens. Lassen Sie die Lösung unter Rühren fortgesetzt.
    5. Durch das Gummiseptum, vorsichtig den Kolben zu spülen mit N 2 ~ 3 min unter Verwendung einer positiven N 2 -Druck Nadel Einlass und einen offenen Nadelals Ventil.
    6. Nehmen Sie die N 2 Einlass und Auslass.
    7. Hinzufügen 0,56 ml (4,0 mmol) Triethylamin (Et 3 N) tropfenweise mittels einer Glasspritze mit einer Nadel durch das Gummiseptum eingeführt ausgestattet.
    8. Hinzufügen 0,65 ml (8,0 mmol) Acrylsäurechlorid tropfenweise mittels einer Glasspritze mit einer Nadel durch das Gummiseptum eingeführt ausgestattet.
    9. Geben die N 2 Einlass in den Kolben und damit der Inhalt unter einem positiven N 2 Druck für 30 min rühren ~.
    10. Vorheizen ein Ölbad auf 55 ° C.
    11. Nach der vorgegebenen ~ 30 Minuten, entfernen Sie die N 2 Einlass und ersetzen Sie das Septum mit einem Kondensator.
    12. Tauchen Sie den Kolben in den vorgeheizten Ölbad.
    13. Damit der Inhalt des Kolbens auf 20 h rühren.
    14. Nach der vorgesehenen 20 Stunden, entfernen Sie den Kolben aus dem Ölbad und ermöglicht Inhalte auf RT abkühlen.
    15. Mit einem Rotationsverdampfer entfernen DCM Lösungsmittel aus dem Kolben.
  2. Purify das rohe PCL-DA Produkt.
    1. In den Kolben, fügen ~ 135 ml Ethylacetat und Auflösen des rohen PCL-DA.
    2. Gravity Die Lösung wird durch Filterpapier in einen sauberen 250 ml-Rundkolben. (Anmerkung: Die Lösung kann auf das Filterpapier zu verdicken, nicht leicht durchlauf Wenn ja, sorgfältig milder Wärme mit einer Wärmepistole anwendbar.).
    3. Mit einem Rotationsverdampfer entfernen Ethylacetat-Lösungsmittel aus dem Kolben.
    4. In den Kolben, fügen ~ 140 ml DCM und lösen das rohe PCL-DA.
    5. Übertragen Inhalt in einen 500 ml Scheidetrichter gegeben.
    6. In den Trichter gegeben hinzuzufügen 13,5 ml 2 M Kaliumcarbonat (K 2 CO 3).
    7. Verschließen Sie den Trichter. Vorsichtig mischen die beiden Schichten durch Invertierung des Trichters und sanft ein- oder zweimal wirbelnden, kümmert sich um den Druck über den Absperrhahn zu lösen. 3 Mal wiederholen.
    8. Setzen Sie die Kappe mit einer Schicht aus Parafilm und lassen Sie die Mischung zu trennen O / N (~ 12 h).
    9. Sammeln Sie die unten oderganische Schicht in eine 250 ml-Erlenmeyerkolben.
    10. Hinzufügen ~ 5 g wasserfreies Magnesiumsulfat (MgSO 4), um den Kolben gegeben und durch vorsichtiges Schwenken.
    11. Gravity Das Gemisch wird durch qualitative Filterpapier und in einen sauberen 250 ml-Rundkolben.
    12. Mit einem Rotationsverdampfer entfernen DCM Lösungsmittel aus dem Kolben.
    13. Trocken unter hohem Vakuum, um restliches DCM zu entfernen. (Hinweis: Die PCL-DA sollte weg von Licht gelagert werden.)
    14. Bestätigen Acrylierung mit 1 H-NMR 22,23.

2. Vorbereitung des SMP Gerüst (Abbildung 1)

  1. Bereiten Sie die Salzschmelze-Vorlage.
    1. Verwenden ein 425 um Sieb zu Natriumchlorid (NaCl) Partikel mit einem Durchmesser erhalten ~ 460 ± 70 um. (Hinweis: Die mittlere Teilchengröße kann von Rasterelektronenmikroskopie [SEM] Bilder mit ImageJ Software bestätigt werden.) 14
    2. In einen 3 ml-Glasfläschchen (ID = 12,9 mm), fügen 1,8 g des zuvor gesiebt NaCl.
    3. Langsame Zugabe in vier Portionen, 7,5 Gew% (bezogen auf Salzgewicht) DI Wasser (0.146 g) in das Fläschchen. Mix mit einem Metallspatel nach der Zugabe jeder Portion Wasser.
    4. Verschließe das Röhrchen, wickeln Sie sie in Gewebe und legen vertikal in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 15 min bei 3.220 x g.
    5. Entfernen Sie den Deckel und lassen Sie an der Luft trocknen O / N (~ 12 h).
  2. In einer neuen Glasfläschchen, bereiten eine "Makromerlösung" durch Kombination von 0,15 g PCL-DA pro ml DCM. (Hinweis:. Zum einen Gerüst, ~ 1 ml Lösung vorbereitet werden) Cap und mischen Sie die Lösung mit hoher Geschwindigkeit auf einem Vortex-Mischer für ca. 1 min.
  3. In einer neuen 3-ml-Glasgefäß, bereiten eine "Photoinitiatorlösung" auf Basis von 10 Gew% 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon (DMP) in 1-Vinyl-2-pyrrolidinon (NVP). Kombinieren 0,115 g DMP in 1 ml NVP. (Anmerkung: Bei einem Gerüst, ~ 180 & mgr; l ist erforderlich.) Cap, in Alufolie wickeln (um Licht zu blockieren) und mischen Sie die Lösung mit hoher Geschwindigkeit auf einem Vortex-Mischerfür ca. 1 min. (Hinweis: Wenn in fortgeschrittenen vorbereitet, sollte die Lösung im Kühlschrank aufbewahren und vor Licht geschützt werden.)
  4. Wickeln Sie das Fläschchen mit dem Makromerlösung (ohne Cap) mit Aluminiumfolie (um Licht zu blockieren) und fügen über eine Pipette 15 Vol% (bezogen auf das Gesamtvolumen des Makromerlösung) des Photoinitiatorlösung. Cap und mischen Sie die Lösung mit hoher Geschwindigkeit auf einem Vortex-Mischer für ca. 1 min.
  5. Wickeln Sie das Fläschchen mit dem geschmolzenen Salz-Vorlage (ohne Cap) mit Aluminiumfolie (um Licht zu blockieren) und fügen über eine Pipette die zuvor hergestellte Makromer / Photoinitiatorlösung (~ 0,6 ml oder bis die Vorlage vollständig bedeckt ist).
  6. Verschließe das Röhrchen, wickeln Sie sie in Gewebe und legen vertikal in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren für 10 min bei 1.260 · g, um die Makromerlösung ganzen Schablone zu verteilen.
  7. Entfernen Sie die Aluminiumfolie, uncap das Fläschchen und setzen mit UV-Licht (365 nm, 25 W) für 3 min. Luft trocknen O / N.
  8. Entfernen Sie die "salzhaltigen scaffold "aus dem Fläschchen mit einer Pinzette nach Scoring und Brechen der Oberseite der Glasfläschchen.
  9. In einem 400 ml Becherglas, herzustellen ~ 200 ml eines Wasser / Ethanol-Lösungsmittel (1: 1 vol: vol).
  10. Pflegen Sie das Gerüst in der Wasser / Ethanol-Lösungsmittel für 4 Tage mit täglichen Änderungen Lösungsmittel getaucht.
  11. Nehmen Sie das Gerüst von dem Lösungsmittel und der Luft trocknen O / N.

3. Anwenden Polydopamine Coating auf SMP-Gerüst (Abbildung 1)

  1. In 400 ml Becherglas mit einem Teflon bedeckten Rührstab, bereiten ~ 200 ml eines Dopamin-Hydrochloridlösung (2 mg / ml in 10 mM Tris-Puffer, pH = 8,5, 25 ºC). Rühre bei ~ 150 Upm.
  2. Legen Sie eine Einweg-Injektionsnadel (Länge = 40 mm; Gauge = 20) in das Gerüst, ~ die Hälfte der Strecke durch das Schafott. Wickeln Sie ein Draht um den Nadelansatz.
  3. Unterzutauchen das Gerüst (mit der Nadelnabe über der Oberfläche der Lösung) in die gerührte Lösung Dopamin durch Verankern des Drahtes auf dem Rand des Bechers.
  4. Entgasen Gerüst indem eine Spritze in das Nadelverbindungsstück und dessen Verwendung, um Luft aus dem Gerüst zu ziehen. (Anmerkung: Die Entgasung ist abgeschlossen, wenn keine Luft mehr entfernt werden kann, und die Lösung wurde komplett das Gerüst infiltriert.)
  5. Pflegen Sie das Gerüst in der Dopamin-Lösung unter Rühren für 16 Stunden unter Wasser.
  6. Nehmen Sie das Gerüst aus der Lösung und entfernen Sie die Nadel. Spülen mit DI-Wasser und trocken in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur für 24 Stunden.
  7. Legen Sie das Gerüst in einem 85 ºC Ofen für 1 Stunde.
  8. Ermöglichen das Gerüst auf RT abkühlen. Die endgültige zylindrische Gerüst wird ~ 6 mm Durchmesser x ~ 5 mm hoch sein.

4. Auswerten "Self-Montage" Verhalten

  1. Bereiten Sie eine "irreguläre CMF Defektmodell" mit einem Blatt aus Hartplastik, deren Dicke ca. 5 mm. Mit einem Bohrer, um einen Hohlraum in dem Kunststoffblatt mit einem mittleren Durchmesser von etwas weniger als ca. 6 mm zu erzeugen, wie in 2A gezeigt.
  2. In abEaker Wärme DI-Wasser (die den klinischen Einsatz von Kochsalzlösung) auf eine Temperatur von ca. 60 ºC.
  3. Legen Sie das Gerüst in das Becherglas von ~ 60 ° C Wasser. Verwenden einer Pinzette, um das Gerüst unter der Wasseroberfläche zu drücken, Belichten alle Bereiche zum Wasser. Fahren Sie für ca. 2 Min oder bis das Gerüst spürbar gemildert (2B).
  4. Nehmen Sie das Gerüst aus dem Becherglas und drücken Sie sofort (von Hand) in das Modell Defekt.
  5. Es wird auf RT (~ 5-10 min) (2C) zu kühlen.
  6. Von dem Defekt zu entfernen, um den neuen, temporären Form fixiert und die Rückkehr der relativ starren Zustand (2D) zu beobachten.

5. Testen Formgedächtnisverhalten

  1. Verwendung eines dynamisch-mechanischen Analysators (DMA, zB einem TA Instruments Q800 wie hier verwendet), und führen eine Spannung-gesteuerte zyklische thermischer mechanischer Kompressionstest auf einem Gerüst über zwei Zyklen (N), die Form fixity (R f) zu bestimmen, undFormwiederherstellung (R r) (Abbildung 3).
    1. Äquilibrieren bis 60 ° C (T high) für 5 min.
    2. Zu komprimieren, um eine maximale Dehnung (ε m = 50%) bei 50% / min.
    3. Halten Sie bei ε m (5 min).
    4. Kühlen auf 25 ° C (T low) und für 10 Minuten beibehalten, um die temporäre Form zu fixieren.
    5. Entfernen Sie die Last.
    6. Messen Sie die Bruchdehnung im spannungsfreien Zustand (ε u).
    7. Aufwärmen auf 60 ° C (T hoch) und für 10 Minuten beibehalten, um die permanente Form zurückzugewinnen.
    8. Messen Sie die wiederhergestellte Dehnung (ε p).
    9. Während noch bei 60 ° C (T high), starten Sie den 2. Zyklus (N = 2) durch Zusammendrücken des Gerüsts zu 50% der Höhe nach dem 1. Zyklus gewonnen (N = 1).
    10. Wiederholen 5.1.3-5.1.8 Für N = 2.
    11. Berechnen R f und R r für N = 1 und 2 unter Verwendung der folgenden Gleichungen:
      R f (N) = [ε u (n) / ε m] r R (N) = [ε m - ε p (N)] / [ε m - ε p (N -1)]

6. Visualisierung Porengröße und Interkonnektivität

  1. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (SEM; zB eine FEI Quanta SEM, wie hier verwendet), beobachten die Porengröße und Interkonnektivität.
    1. Mit einer Pinzette die SMP-Gerüst zu halten, tauchen in flüssigem N 2 für 1 min.
    2. Von flüssigem N 2 und Bruch entlang der Mitte des Gerüsts mit einer Rasierklinge zu entfernen.
    3. Verwendung von Kohlenstoffband, befestigen eine der SMP Gerüsthälften auf die ProbeStufe mit dem Bruchfläche nach oben zeigt.
    4. Sputter-Mantel mit Au-Pt (~ 4 nm).
    5. Erfassen die REM-Aufnahme bei einer empfohlenen Beschleunigungsspannung von 10-15 kV (4A).

7. Prüfung von in-vitro-Bioaktivität

  1. In ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, fügen ~ 30 ml 1X SBF 24.
  2. Besorgen Sie sich ein Gerüst in seiner ursprünglichen, zylindrisch geformten permanenten Form. Schneiden Sie das Gerüst in die Hälfte (über den kreisförmigen Rand) mit einem sauberen Klinge.
  3. Legen Sie eine einzelne Gerüsthälfte in die vorbereitete Zentrifugenröhrchen und Kappe.
  4. Aufrechterhaltung des Rohrs bei 37 ° C in einem Wasserbad unter statischen Bedingungen ohne SBF ändert.
  5. Nach 14 Tagen, entfernen Sie das Gerüst aus dem SBF und der Luft trocknen für 24 Stunden.
  6. Verwendung von Kohlenstoffband, bringen Sie das Gerüst auf den Probentisch mit der Bruchfläche nach oben zeigt.
  7. Sputter-Mantel mit Au-Pt (~ 4 nm).
  8. Nehmen Sie das SEM-Bild bei einer Wiedergelobt Beschleunigungsspannung von 10-15 kV (4B).

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Representative Results

Die resultierende PCL basierende MMP-Gerüst ist in der Lage selbst passend in einem Modell CMF Defekt (Abbildung 2). Nach kurzer Einwirkung von Salzlösung (~ 60 ° C) erwärmen, erweicht die zylindrische Gerüst ermöglicht das Gerüst manuell in gedrückt werden und innerhalb des Modells Defekt zu erweitern. Nach dem Abkühlen auf RT wird das Gerüst in die neue temporäre Form, die nach der Entnahme aus dem Defekt zurückgehalten wird fixiert.

Die Formgedächtnisverhalten eines SMP-Gerüst wird durch spannungsgesteuerten zyklischen thermomechanischen Druckversuche in Bezug auf Form Festigkeit (R f) und Formwiederherstellung (R r) (Abbildung 3) quantifiziert. Für diese PCL basierenden SMP Gerüst Werte (%) für Zyklen n = 1 und 2 sind: R f (1) = 102,5 0,7, R f (2) = 101,8 0,3, R r (1) 95,3 0,9 und R r (2) = 99,8 0,2 6.

Die SMP-Gerüst zeigt eine stark vernetzten Porenmorphologie, die beobachtetdurch REM-Aufnahmen (4A). Dies wurde durch die Verwendung einer Salzschmelze Vorlage, durch die Zugabe einer kleinen Menge von Wasser zu dem gesiebten Salz (Figur 1) gebildet erreicht.

Nach Kontakt mit simulierter Körperflüssigkeit (SBF; 1X) für 14 Tage, REM-Aufnahmen bestätigen die Bildung von HAp (4B), wodurch Gerüst Bioaktivität anzeigt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische für die Vorbereitung der SMP-Gerüst mit polydopamine. ASMP Gerüst beschichtet wird über die beschriebenen Protokoll auf Basis des photochemische Härtung der Polycaprolacton-diacrylat (PCL-DA) unter Verwendung eines Lösungsgießen Partikel-Laugung (SCPL) Verfahren hergestellt unter Verwendung von Schmelzsalz-Vorlage und Anwendung eines bioaktiven polydopamine Beschichtung. Die abschließende Wärmebehandlung bei 85 ° C (T> T trans) induziert Gerüst densifizierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Beobachtung der Selbstsitzverhalten. Ein zylindrischer SMP Gerüst (~ 6 mm Durchmesser x ~ 5 mm Höhe) befindet sich in einem "unregelmäßige Defektmodell" ausgestattet (A) wie folgt. Beim Erhitzen in Wasser bei ~ 60 ° C (T> T trans), das Gerüst weich und formbar wird (B) und kann somit mechanisch gepresst werden ("ausgestattet") innerhalb der Modellfehler (C). Nach Abkühlen auf RT wird das SMP Gerüst entfernt und behält seine neuen, festen temporären Form (D). Beim anschließenden Erhitzen auf ~ 60 ° C, das Gerüst durchläuft eine Formwiederherstellung zu der ursprünglichen, generische zylindrische Form.

Figur 3
Figur 3. Messung der Formgedächtnisverhalten. Das Formgedächtnisverhalten eines SMP Gerüst bei der spannungsgesteuerten zyklischen thermischer mechanischer Kompressionstest auf einem Gerüst quantifiziert Gestalt fixity (Rf) und Formwiederherstellung (R r) auf der Basis festzustellen Messungen der ε m, ε u, und ε p. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Beobachtung der pore Vernetzung und Bildung von Hydroxyapatit (HAp). Repräsentative SEM-Bilder eines unbeschichteten, wärmebehandelt SMP Gerüst (Maßstab = 200 & mgr; m) (A) und beschichtet, wärmebehandelt Gerüst nach der Einwirkung von SBF (1x) 14 Tage (Maßstab = 50 & mgr; m) (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines polydopamine beschichtet, PCL basierende Gerüst deren Selbstschlüssige Verhalten sowie Osteoinduktivität und Bioaktivität, macht es von Interesse bei der Behandlung von irregulären CMF Knochendefekten. Aspekte des Protokolls kann verändert werden, um verschiedene Gerüst Merkmale ändern.

Das Protokoll beginnt mit Acrylierung eines PCL-diol zur UV-Härtung zu ermöglichen. In der dargestellten Beispiel ist das PCL-diol M n ~ 10.000 g / mol. Jedoch durch geeignetes Einstellen Menge von Acryloylchlorid und Et 3 N während der Synthese des PCL-DA, einen PCL-Diol mit einem höheren oder niedrigeren Mn verwendet zu verringern oder zu erhöhen, bzw. die Vernetzungsdichte werden verwendet.

Die geschmolzenen Salz-Vorlage ist ein wichtiger Bestandteil des Protokolls (Abbildung 1). Die durchschnittliche Salzgröße bestimmt die resultierende Gerüst Porengröße. In dem beschriebenen Beispiel war der durchschnittliche Salzgröße ~ 460 ± 70 &# 181; m. Während ein kleinerer Salzgröße verwendet werden kann, ist zu beachten, dass das Gerüst erfährt Schrumpfung während der abschließenden Wärmebehandlung Schritt, der Porengröße zu reduzieren bleiben erhalten. Sieben des Salzes verwendet wird, um das Salz Größenverteilung zu verringern, und daher die Porengrößenverteilung. Ein Gerüst mit stark miteinander verbundenen Poren zu erzeugen, wurde Salz Fusion durch Zugabe einer kleinen Menge von Wasser induziert (7,5 Gew% bezogen auf Salzgewicht). Dies ist bekannt, isoliert NaCl Teilchen in eine kontinuierliche Poragen Vorlage 25,26 teilweise lösen. In Abhängigkeit von der durchschnittlichen Salz Größe, muss die Menge Wasser zugegeben, 14 eingestellt werden. Ferner wird während Salz Fusion, muss das Wasser nach und nach, mechanisch gemischt und schließlich zentrifugiert, um ihre gleichmäßige Verteilung sowie die Verpackung der Salzpartikel sicherzustellen, hinzugefügt werden.

Nachdem das geschmolzene Salz Vorlage gebildet, wird die PCL-DA in DCM für die Lösungsmittelgießen gelöst. In dem beschriebenen Protokoll, ein concentration von 0,15 g PCL-DA pro 1 ml DCM wurde verwendet. Diese Konzentration kann erhöht oder verringert werden. Während jedoch die steigenden Konzentrationen wird erwartet, dass Gerüst Modul zu erhöhen, kann es auch Gerüste mit geringeren Poreninterkonnektivität 14 zu produzieren.

Nachdem die Vorläuferlösung wurde auf die Salzform hinzugefügt wurde, ist der Zentrifugation hilfreich zur Unterstützung bei dessen Diffusion in die Vorlage. Im Anschluss an eine schnelle UV-Härtung, Lufttrocknung ermöglicht die Verdampfung des Lösungsmittels DCM. (: 1 vol: vol 1) für 4 Tage, um das Salz zu entfernen, nachdem Vorlage Entformen wird das Gerüst in Wasser / Ethanol eingeweicht. Die REM-Aufnahmen bestätigen die Bildung einer stark vernetzten Porenmorphologie (4A).

A polydopamine Beschichtung auf den Porenwänden des Gerüsts angewendet, um biologische Aktivität zu verleihen. Aufgrund der daraus resultierenden Gerüst Schrumpfung ist es am besten, um die Beschichtung vor der endgültigen Wärmebehandlungsschritt 6 anzuwenden. Zusätzlich Entgasungdas Gerüst während in die wässrige Lösung eingetaucht Dopamin unterstützt Infiltration. Die entgaste Gerüstreste in die Lösung eingetaucht, um eine einheitliche polydopamine Abdeckung zu erleichtern. Einmal aufgetragen und gründlich gespült, zeigt die bisher weiße Gerüst eine braune Farbe charakteristisch polydopamine 21. Somit kann Abdeckung im ganzen Gerüst durch visuelle Inspektion durch Halbierung ein Gerüst, um polydopamine Diffusions bestätigen, beurteilt werden.

Nach dem Aufbringen der Beschichtung polydopamine wird eine abschließende Wärmebehandlung durchgeführt (85 ºC, 1 h). Wie bereits erwähnt, führt dieser Prozess in Gerüst Schrumpfung. Jedoch ist die Wärmebehandlung erforderlich ist, damit Formgedächtnisverhalten 14, vielleicht wegen Reorganisation der PCL kristallinen Domänen (also Schaltsegmente) in größerer Nähe.

Wie in Abbildung 2 gezeigt, erreicht das SMP Gerüst Selbst passend in einem Modellfehler aufgrund seiner thermoresponsive mich prägenMory Natur. Einwirkung von Salz erwärmen (~ 60 ° C) induziert Schmelzen der PCL kristalline Domänen, so dass der erweichte Gerüst könnte in das Modell Defekts gedrückt werden. Wenn der manuelle Druck wurde die Formwiederherstellung gefördert Expansion des Gerüsts, um die unregelmäßige Grenzen zu füllen. Nach dem Abkühlen auf RT, reformiert die PCL kristallinen Domänen, zur Festsetzung des Gerüsts in die neue temporäre Form, die nach der Entnahme aus dem Defekt zurückgehalten wurde. Früher haben wir bestätigt, daß die Poren an den Rändern der entfernten Gerüst blieb trotz Berührung mit der Form 6 ganz geöffnet.

Wenn die von dem Stamm gesteuerte zyklische thermischen mechanische Kompressionstests (Abbildung 3), gemessen ideale Formgedächtnisverhalten wird durch R f und R r Werte von 100% aufweist. Für die beschriebenen SMP Gerüst waren Rf-Werte für die Zyklen 1 und 2 leicht> 100% 6. R f zuvor beobachtet wurde leicht gr seinFresser als 100% 14,27 aufgrund einer leichten Erhöhung der Druckspannung während Formhaltigkeit der Umkristallisation der PCL-Segmente in kompakter Strukturen 27 oder von der Kompression induzierte Rekristallisation PCL. Außerdem R R von Zyklus zu Zyklus 1 2 6 erhöht. Eine Erhöhung der R r Werte zuvor für feste 28,29,22 und poröse SMPs 13,14,23 festgestellt. Es wird angenommen, daß während des ersten Zyklus, Restspannung aus der Verarbeitung stamm entfernt, so dass die Formwiederherstellung steigt im nächsten Zyklus 7.

Die beschriebene Gewebetechnik Gerüst löst die spezifischen Satz von Eigenschaften für die erfolgreiche Behandlung von CMF Knochendefekten. Das Gerüst wird erwartet, dass die Osseointegration durch seine Fähigkeit, "Selbstform" innerhalb einer unregelmäßigen CMF Knochendefekt zu erleichtern. Osteokonduktivität vorhergesagt auf der Basis der erreichten Poreninterkonnektivität sowieGerüst biologische Abbaubarkeit. Schließlich wird durch die polydopamine Beschichtung ist der Gerüst bioaktiven wie durch die Bildung von HA während der in vitro-Tests (4B) gezeigt. Diese Bioaktivität wird vorhergesagt, Integration und Bindung mit umgebenden Knochengewebe zu erleichtern. So ist diese Gerüst stellt eine Alternative zur Autotransplantation und konventionellen Knochenersatzstoffe für CMF Knochendefekt zu reparieren.

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Acknowledgments

Die Autoren danken der Texas A & M University Engineering and Experiment Station (TEES) für die finanzielle Unterstützung dieser Forschung. Lindsay Nail dankt Unterstützung von der Texas A & M Universität Louis Stokes Allianz für Minderheitsbeteiligung (LSAMP) und der National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP). Dawei Zhang dank der Texas A & M University Dissertation Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) Sigma-Aldrich 440752
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich D65100 Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma-Aldrich D5640
Triethylamine (Et3N) Sigma-Aldrich T0886
Acryloyl chloride Sigma-Aldrich A24109
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 319902
Potassium carbonate (K2CO3) Sigma-Aldrich 209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) Fisher M65
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) Sigma-Aldrich 196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409
Ethanol Sigma-Aldrich 459844
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502
Tris buffer (2mol/L) Fisher BP1759 Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve VWR 47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) UVP 95-0426-02
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) TA Instruments Q800
High Resolution Sputter Coater Cressington 208HR
Scanning Electron Microscope (SEM) FEI Quanta 600

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References

  1. Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
  2. Elsalanty, M. E., Genecov, D. G. Bone grafts in craniofacial surgery. Craniomaxillofac Trauma Reconstr. 2, 125-134 (2009).
  3. Hollister, S. J., et al. Engineering craniofacial scaffolds. Orthod Craniofacial Res. 8, 162-173 (2005).
  4. Albrektsson, T., Johansson, C. Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration. Eur Spine J. 10, S96-S101 (2001).
  5. Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
  6. Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
  7. Lendlein, A., Kelch, S. Shape-memory polymers. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2034-2057 (2002).
  8. Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
  9. Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
  10. Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
  11. Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
  12. Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
  13. Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
  14. Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
  15. Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
  16. Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
  17. Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
  18. Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
  19. Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
  20. Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
  21. Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
  22. Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
  23. Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
  24. Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
  25. Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
  26. Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
  27. Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
  28. Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
  29. Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).

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Bioengineering Heft 104 Formgedächtnis Polycaprolacton polydopamine Gerüst Salzvorlage bioaktive Knochenheilung
Herstellung eines bioaktiven, PCL-basierte &quot;Self-Montage&quot; Formgedächtnispolymer Scaffold
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Nail, L. N., Zhang, D., Reinhard, J. … More

Nail, L. N., Zhang, D., Reinhard, J. L., Grunlan, M. A. Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold. J. Vis. Exp. (104), e52981, doi:10.3791/52981 (2015).

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