Introduction
כיום נחשב סטנדרטי של קרניו-ולסת (CMF) טיפולי פגם עצם הזהב, השתלה אוטולוגית של שתלים שנקטפו מתעכבת על ידי הליכים מורכבים השתלה, תחלואת אתר תורם וזמינות מוגבלת 1. קושי מיוחד הוא בעיצוב ותיקון autograft הנוקשה בחוזקה לפגם במטרה להשיג osseointegration ולמנוע ספיגת שתל. הנדסת רקמות נחקרה כאסטרטגיה חלופית לautografting ותחליפים סינטטיים עצם (מלט עצם למשל) 2,3. קריטי להצלחה של גישת הנדסת רקמות הוא פיגום עם קבוצה מסוימת של נכסים. ראשית, על מנת להשיג osseointegration, הפיגום חייב ליצור קשר הדוק עם רקמת עצם סמוך 4. הפיגום צריך להיות גם osteoconductive, המאפשר נדידת תאים, דיפוזיה התזונתית ו4,5 תצהיר neotissue. התנהגות זו, בדרך כלל, שהושגה עם SCA מתכלהffolds מציג מורפולוגיה נקבובית קשורה מאוד. לבסוף, הפיגום צריך להיות ביו כדי לקדם אינטגרציה ומליטה עם רקמות עצם 5.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכין פיגום הנדסת רקמות עם מאפיינים אלה. חשוב לציין, פיגום זה מציג את היכולת "כושר-עצמי" לפגמי CMF בלתי סדירים בשלה צורת התנהגות זיכרון 6. פולימרים Thermoresponsive זיכרון צורה (SMPS) ידועים לעבור שינוי צורה בחשיפה לחום 7,8. SMPS מורכב "netpoints" (כלומר כימי או crosslinks הפיזי) הקובע את הצורה הקבועה ו" מגזרי מיתוג ", שלשמור על הצורה הזמנית ולשחזר את הצורה הקבועה. מגזרי המיתוג להציג טמפרטורה תרמית מעבר (T טראנס) המתאימה לשני מעבר הזכוכית (ז T) או להמס מעבר (T מ ') של הפולימר. כתוצאה, SMPS עשוי להיות מעוות ברצף לצורה זמנית בT> T טראנס, קבועה בצורה הזמנית בT <T טראנס, והתאושש לצורה הקבועה בT> T טראנס. לפיכך, פיגום SMP יכול להשיג "עצמי הולם" בתוך פגם CMF כדלקמן 6. לאחר החשיפה לחמם מלוח (T> T טראנס), פיגום SMP יהיה נזיל, המאפשר פיגום גלילי מוכן הגנרי להיות יד לחץ לפגם לא סדיר, עם התאוששות צורת קידום הרחבת הפיגום לגבול הפגם. בקירור (T <T טראנס), הפיגום יחזור למצב יחסית יותר הנוקשה שלה, עם קיבעון צורת שמירת הצורה הזמנית החדשה שלה בפגם. בפרוטוקול זה, פיגום SMP מוכן מpolycaprolactone (PCL), פולימר מתכלה נחקר בהרחבה לשחזור רקמות ויישומים ביו-רפואיים אחרים 9-11. לזיכרון צורה, הT מ 'דואר של PCL משמש כT טראנס ומשתנה בין 43 ו -60 המעלות צלזיוס, תלוי במשקל המולקולרי של PCL 12. בפרוטוקול זה, T טרנס (T מ 'כלומר) של הפיגום הוא 56.6 מעלות צלזיוס ± 0.3 6.
על מנת להשיג osteoconductivity, פרוטוקול פותח כדי להפוך את פיגומי SMP מבוססי PCL עם נקבוביות קשורות מאוד המבוססות על שיטת חלקיקים-שטיפת הליהוק ממס (SCPL) 6,13,14. diacrylate Polycaprolactone (PCL-DA) (M = n ~ 10,000 g / mol) נוצל כדי לאפשר crosslinking המהיר, פוטו ופורק ב dichloromethane (DCM) כדי לאפשר ממס הליהוק מעל תבנית מלח. בעקבות תרופת פוטו ואידוי ממס, תבנית מלח הוסרה על ידי שטיפה במים. הגודל הממוצע מלח מסדיר גודל נקבובית פיגום. חשוב לציין, תבנית מלח הייתה התמזגה עם מים לפני ממס ליהוק להשיג interconnectivi הנקבוביתטאי.
הפעילות ביולוגית הייתה הנחילה לפיגום SMP על ידי בהיווצרות באתרו של ציפוי polydopamine על קירות נקבוביות 6. פעילות ביולוגית הוא הציג לעתים קרובות לפיגומים על ידי ההכללה של חומרי מילוי זכוכית או זכוכית קרמית 15. עם זאת, אלה עלולים לגרום לתכונות מכאניות פריכות לא רצויות. דופמין הוכח כדי ליצור שכבה חסיד, דקה polydopamine על מגוון רחב של מצעי 16-19. בפרוטוקול זה, פיגום SMP היה נתון לפתרון מעט בסיסי (pH = 8.5) של דופמין כדי ליצור ציפוי nanothick של polydopamine על כל הקיר נקבובית המשטחים 6. בנוסף לשיפור hydrophilicity משטח להידבקות תא משופר ומתפשט, polydopamine הוכח להיות ביו במונחים של היווצרות של hydroxyapatite (הפ) בחשיפה לנוזלי גוף המדומה (SBF) 18,20,21. בשלב אחרון, הפיגום המצופה חשוף לחום טיפול ב 85 המעלות צלזיוס "ש (T> T טראנס)ich מוביל לפיגומי ציפוף. טיפול בחום צוין בעבר להיות חיוני לזיכרון צורת פיגום התנהגות, אולי בשל תחומים גבישי PCL ארגון מחדש של קרבה קרובה יותר 14.
אנחנו גם לתאר את השיטות כדי לאפיין את ההתנהגות הולמת העצמית בתוך פגם מודל לא סדיר, זיכרון צורת התנהגות במונחי בדיקות דחיסה מכאנית מחזוריות-תרמית בשליטת מתח (התאוששות צורה כלומר ולעצב את הקיבעון), נקבוביות מורפולוגיה, ובפעילות ביולוגית מבחנה. אסטרטגיות כדי להתאים את מאפייני פיגום גם מוצגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזת PCL-DA Macromer
- הפעל את תגובת acrylation.
- שוקל 20 גרם של PCL-דיאול (n = M ~ 10,000 g / mol) לבקבוק 250 מיליליטר עגול תחתון מצוידים בבר ומערבבים מגנטי מכוסה טפלון.
- ממיסים את PCL-דיאול בDCM.
- להוסיף 120 mLlof DCM לבקבוק (הריכוז = 0.17 גר '/ מיליליטר).
- מניחים מחץ גומי רופפת לצוואר של הבקבוק כדי למנוע הצטברות לחץ תוך מניעת אידוי של DCM.
- פתרון מערבבים ל~ 30 דקות ב ~ 250 סל"ד לפזר לגמרי הפולימר.
- להוסיף ~ 6.6 מ"ג של 4-dimethylaminopyridine (DMAP) לפתרון ולפזר עם ערבוב.
- מניחים מחץ גומי היטב לצוואר של הבקבוק. אפשר הפתרון להמשיך ערבוב.
- דרך מחיצת הגומי, בעדינות לטהר את הבקבוק עם N 2 ל~ 3 דקות באמצעות כניסה חיובית N 2 מחט לחץ ומחט פתוחהכמוצא.
- הסר את כניסת N 2 ושקע.
- להוסיף 0.56 מיליליטר (4.0 mmol) של triethylamine (Et 3 N) dropwise באמצעות מזרק זכוכית מצויד במחט המוחדרת דרך מחיצת הגומי.
- להוסיף 0.65 מיליליטר (8.0 mmol) של acryloyl dropwise כלוריד באמצעות מזרק זכוכית מצויד במחט המוחדרת דרך מחיצת הגומי.
- להחזיר את כניסת N 2 לבקבוק ולאפשר את התוכן לעורר תחת לחץ N 2 חיובי ל~ 30 דקות.
- טרום לחמם שמן אמבט עד 55 מעלות צלזיוס.
- לאחר ~ 30 דקות המוקצבות, להסיר את כניסת N 2 ולהחליף את המחיצה עם הקבל.
- להטביע את הבקבוק לתוך האמבטיה השמן המחוממת מראש.
- לאפשר תכולת הבקבוק לעורר במשך 20 שעות.
- אחרי 20 שעות שהוקצו, להסיר את הבקבוק מאמבטית השמן ולאפשר תוכן להתקרר לRT.
- באמצעות מאייד סיבובי, להסיר ממס DCM מהבקבוק.
- Purify מוצר PCL-DA הגולמי.
- לבקבוק, להוסיף ~ 135 מיליליטר של אתיל אצטט ולפזר את PCL-DA הגולמי.
- כוח משיכה לסנן את הפתרון באמצעות נייר סינון לתוך בקבוק עגול תחתון 250 מיליליטר נקי. (הערה: פתרון עשוי לעבות על נייר הסינון, לא בקלות עובר אם כן, תחול בזהירות חום קל עם אקדח חימום..)
- באמצעות מאייד סיבובי, להסיר אתיל אצטט ממס מהבקבוק.
- לבקבוק, להוסיף ~ 140 מיליליטר של DCM ולפזר את PCL-DA הגולמי.
- העבר את התוכן למשפך separatory 500 מיליליטר.
- למשפך, להוסיף 13.5 מיליליטר של 2 מ 'פחמה אשלגן (K 2 CO 3).
- מכסה את המשפך. לערבב בעדינות את שתי השכבות על ידי היפוך המשפך ומתערבל בעדינות פעם או פעמיים, דואג לשחרר לחץ באמצעות ברזלים. חזור 3 פעמים.
- החלף את הכובע בשכבה של Parafilm ולאפשר את התערובת להפריד O / N (~ 12 שעות).
- לאסוף את התחתית, אושכבת ganic לתוך בקבוק 250 מיליליטר Erlenmeyer.
- להוסיף ~ 5 גרם של מגנזיום סולפט נטול מים (MgSO 4) לבקבוק ועדינות מערבולת.
- כוח משיכה לסנן את התערובת דרך נייר סינון איכותי ולבקבוק 250 מיליליטר נקי עגול תחתון.
- באמצעות מאייד סיבובי, להסיר ממס DCM מהבקבוק.
- יבש תחת ואקום גבוה כדי להסיר DCM שייר. (הערה: PCL-DA יש לאחסן הרחק מאור.)
- לאשר acrylation עם 1 H NMR 22,23.
2. הכנת פיגום SMP (איור 1)
- הכן את תבנית מלח התמזגה.
- השתמש במסננת 425 מיקרומטר להשיג נתרן כלורי חלקיקים (NaCl) ~ 460 ± 70 מיקרומטר קוטר. (הערה: גודל חלקיקים ממוצע עשוי להיות מאושר ממיקרוסקופ אלקטרונים הסורק [SEM] תמונות עם תוכנת ImageJ.) 14
- לבקבוקון זכוכית 3 מיליליטר (ID = 12.9 מ"מ), להוסיף 1.8 גרם של NaCl הסתנן בעבר.
- לאט לאט להוסיף, בארבע מנות, 7.5% WT (המבוסס על משקל מלח) המים DI (ז 0.146) לבקבוקון. מערבבים עם מרית מתכת לאחר התוספת של כל מנה של מים.
- מכסה את הבקבוקון, לעטוף ברקמות ולמקם בצורה אנכית לתוך צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב3,220 x גרם.
- הסר את המכסה ולתת O האוויר יבש / N (~ 12 שעות).
- בבקבוקון זכוכית חדש, להכין "פתרון macromer" על ידי שילוב של 0.15 גרם של PCL-DA לכל מיליליטר של DCM. (הערה:. לפיגום אחד, ~ 1 מיליליטר של תמיסה צריך להיות מוכן) קאפ ומערבבים את הפתרון במהירות גבוהה במיקסר מערבולת ~ 1 דקות.
- בבקבוקון זכוכית 3 מיליליטר חדש, להכין "פתרון photoinitiator", המבוסס על 10% WT אצטופנון 2,2-dimethoxy-2-פניל (DMP) ב1-ויניל-2-pyrrolidinone (NVP). לשלב 0.115 גרם של DMP ב 1 מיליליטר של NVP. (הערה: פיגום אחד, ~ 180 μl נדרש.) קאפ, לעטוף ברדיד אלומיניום (כדי לחסום את האור) ומערבבים את הפתרון במהירות גבוהה במיקסר מערבולתל~ 1 דקות. (שים לב: אם הכין במתקדם, הפתרון צריך להיות בקירור ומוגן מפני אור.)
- עטוף את הבקבוקון המכיל את פתרון macromer (לא כולל הכובע) ברדיד אלומיניום (כדי לחסום את האור) ולהוסיף באמצעות פיפטה 15% כרך (המבוסס על נפח כולל של פתרון macromer) של פתרון photoinitiator. כובע ומערבבים את הפתרון במהירות גבוהה במיקסר מערבולת ~ 1 דקות.
- עטוף את הבקבוקון המכיל את תבנית מלח התמזגה (לא כולל הכובע) ברדיד אלומיניום (כדי לחסום את האור) ולהוסיף באמצעות פיפטה פתרון macromer / photoinitiator הכין בעבר (~ 0.6 מיליליטר או עד התבנית מכוסה לחלוטין).
- מכסה את הבקבוקון, לעטוף ברקמות ולמקם בצורה אנכית לתוך צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 1,260 XG להפיץ את פתרון macromer לאורך התבנית.
- הסר את נייר האלומיניום, uncap הבקבוקון ולחשוף לאור UV (365 ננומטר, 25 W) במשך 3 דקות. O אוויר יבש / N.
- הסר "scaffol המכיל מלחד "מהבקבוקון עם פינצטה לאחר הבקיע והשבירה העליון של בקבוקון הזכוכית.
- בכוס 400 מיליליטר, להכין ~ 200 מיליליטר של מים / אתנול ממס (1: 1 כרך: כרך).
- לשמור על הפיגום השקוע במים / אתנול הממס במשך 4 ימים עם שינויי ממס יומיים.
- הסר את הפיגום מO / N הממס והאוויר יבש.
3. החלת Polydopamine ציפוי לSMP פיגום (איור 1)
- בכוס 400 מיליליטר מצויד בבר ומערבבים מכוסה טפלון, להכין ~ 200 מיליליטר של פתרון hydrochloride דופמין (2 מ"ג / מיליליטר ב 10 מ"מ טריס חיץ, pH = 8.5, 25 מעלות צלזיוס). מערבבים ב~ 150 סל"ד.
- הנח מחט חד פעמית (אורך = 40 מ"מ; מד = 20) לפיגום, ~ מחצית המרחק בפיגום. לעטוף תיל סביב רכזת המחט.
- להטביע את הפיגום (עם רכזת המחט מעל פני השטח הפתרון) לפתרון דופמין ערבוב על ידי עיגון החוט לשפת הכוס.
- דגה הפיגום על ידי הצבת מזרק לרכזת המחט ומשתמש בו כדי למשוך אוויר מהפיגום. (הערה: סילוק גזים הוא מלא כאשר אין יותר אוויר ניתן להסיר והפתרון יש שחדר הגרדום לחלוטין.)
- לשמור על הפיגום השקוע בפתרון דופמין ערבוב במשך 16 שעות.
- הסר את הפיגום מהפתרון ולהסיר את המחט. יש לשטוף במי DI ויבשים בתנור ואקום ב RT למשך 24 שעות.
- מניחים את הפיגום בתנור 85 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לאפשר הפיגום להתקרר לRT. הפיגום הגלילי הסופי יהיה ~ 6 קוטר מ"מ x ~ 5 מ"מ גובה.
התנהגות "עצמית הולם" 4. הערכה
- הכן "מודל סדיר CMF פגם" באמצעות יריעת פלסטיק הקשיח עוביו הוא ~ 5 מ"מ. השתמש בתרגיל כדי ליצור חלל בתוך יריעת הפלסטיק עם קוטר ממוצע מעט פחות מ ~ 6 מ"מ, כפי שמודגם באיור 2 א.
- בabתייקר, מים DI החום (המייצגים את השימוש הקליני של תמיסת מלח) לטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס ~.
- מניחים את הפיגום לתוך הכוס של ~ 60 מעלות צלזיוס מים. להשתמש בפינצטה כדי לדחוף את הפיגום מתחת לפני שטח המים, חושפת את כל האזורים למים. המשך ל~ 2 דקות או עד שהפיגום הוא התרכך במידה ניכרת (איור 2).
- הסר את הפיגום מהכוס והקש מייד (ביד) לפגם המודל.
- אפשר להתקרר לRT (~ 5-10 דקות) (איור 2 ג).
- מוציאים מהפגם להתבונן הצורה החדשה, קבועה זמנית והחזרת המצב יחסית יותר הנוקשה (איור 2 ד).
התנהגות זיכרון צורה 5. בדיקה
- באמצעות נתח דינמי מכאני (DMA; למשל ת"א מכשירי Q800 כבשימוש במסמך), להפעיל מבחן שליטת מתח מחזורי-תרמי מכאני דחיסה על פיגום מעל שני מחזורים (N) כדי לקבוע קביעות צורה (ו R) ולעצב התאוששות (r R) (איור 3).
- לאזן עד 60 ° C (גבוה T) במשך 5 דקות.
- לדחוס למתח מרבי (מ '= 50% ε) ב 50% / דקה.
- להחזיק במ 'ε (5 דקות).
- מגניב 25 ° C (T נמוך) ולשמור במשך 10 דקות כדי לתקן את הצורה הזמנית.
- הסר את העומס.
- מדוד את המתח האולטימטיבי במדינה ללא מתח (ε u).
- לחמם עד 60 ° C (T גבוה) ולשמור במשך 10 דקות כדי לשחזר את הצורה הקבועה.
- מדוד את המתח התאושש (עמ 'ε).
- אמנם עדיין על 60 מעלות צלזיוס (גבוהה T), להתחיל את מחזור nd 2 (N = 2) על ידי דחיסת הפיגום 50% מהגובה התאושש לאחר מחזור -1 (N = 1).
- חזור על 5.1.3-5.1.8 עבור N = 2.
- לחשב F R ו- R R עבור N = 1 ו -2 באמצעות המשוואות הבאות:
ו R (N) = r R (N) = [מ ε - עמ 'ε (N)] [ε u / מ' ε (N)] / [מ ε - עמ 'ε (N -1)]
גודל 6. חזותי נקבובית וקישורי גומלין נקבוביות
- באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM; למשל פיי Quanta SEM כפי שלהלן), לקיים את הגודל הנקבובית ונקבוביים קישוריות.
- באמצעות פינצטה כדי להחזיק את פיגום SMP, לצלול בנוזל N 2 דקות 1.
- הסר מנוזל N 2 ושבר לאורך אמצע הפיגום בסכין גילוח נקי.
- באמצעות קלטת פחמן, להדביק אחד חצאים פיגום SMP על המדגםהבמה עם המשטח הסדוק פונה כלפי מעלה.
- גמגום מעיל עם Au-Pt (~ ננומטר 4).
- ללכוד את תמונת SEM במתח מאיץ מומלץ של 10-15 קילו וולט (איור 4 א).
7. בדיקה של פעילות ביולוגית במבחנה
- לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר, להוסיף ~ 30 מיליליטר של 1X 24 SBF.
- להשיג פיגום בצורתו המקורית, cylindrically היצוקים הקבועה. חותך את הפיגום במחצית (מעבר לקצה העגול) באמצעות סכין נקי.
- מניחים מחצית פיגום בודדת לתוך צינור צנטריפוגות מוכן והכובע.
- לשמור על הצינור ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים בתנאים סטטיים ללא שינויי SBF.
- לאחר 14 ימים, להסיר את הפיגום מיבש SBF והאוויר במשך 24 שעות.
- באמצעות קלטת פחמן, להדביק הפיגום על הבמה המדגם עם המשטח הסדוק פונה כלפי מעלה.
- גמגום מעיל עם Au-Pt (~ ננומטר 4).
- ללכוד את תמונת SEM במחדששיבח מתח מאיץ של 10-15 קילו וולט (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיגום SMP מבוסס PCL וכתוצאה מכך הוא מסוגל לפגם CMF מודל ראוי עצמי (איור 2). לאחר חשיפה קצרה כדי לחמם מלוחה (~ 60 מעלות צלזיוס), הפיגום הגלילי מרכך מאפשר הפיגום שלחץ באופן ידני וללהרחיב בתוך פגם המודל. לאחר הקירור לRT, הפיגום קבוע לצורה הזמנית החדשה שלה, אשר נשמרת בעת ההסרה מהפגם.
זיכרון צורת ההתנהגות של פיגום SMP היא לכמת על ידי בדיקות דחיסת שליטת מתח מחזוריות-תרמית מכאניות במונחים של קיבעון צורה (ו R) והתאוששות צורה (r R) (איור 3). לפיגום SMP מבוסס PCL זה, ערכים (%) למחזורים N = 1 ו- 2 הם: F R (1) = 102.5 0.7, F R (2) = 101.8 0.3, r R (1) 95.3 0.9, ו- R R (2) = 99.8 0.2 6.
פיגום SMP מציג מורפולוגיה נקבובית מחוברת מאוד כפי שנצפהעל ידי ההדמיה SEM (איור 4 א). זו הושגה על ידי השימוש בתבנית מלח התמזגה, שהוקם על ידי התוספת של כמות קטנה של מים למלח הסתנן (איור 1).
בעקבות חשיפה לנוזלי גוף מדומה (SBF; 1X) במשך 14 ימים, ההדמיה SEM מאשרת את הקמתה של האפ (איור 4) וכך מצביעה על פעילות ביולוגית פיגום.
איור סכמטי 1. להכנת פיגום SMP המצופה polydopamine. פיגום ASMP הוא מפוברק באמצעות הפרוטוקול המתואר מבוסס על תרופת פוטו של diacrylate polycaprolactone (PCL-DA) באמצעות חלקיקים-שטיפת הליהוק ממס (SCPL) שיטה העסיקה עובדים התמזגו תבנית מלח ויישום של ציפוי polydopamine ביו. הטיפול בחום הסופי על 85 מעלות צלזיוס (T> T טראנס) גורם דן פיגוםsification. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תצפית איור 2. התנהגות הולמת עצמית. פיגום SMP גלילי (~ 6 מ"מ קוטר גובה x ~ 5 מ"מ) מצוידת ב" מודל פגם לא סדיר "() כדלקמן. על החימום במים ב ~ 60 מעלות צלזיוס (T> T טראנס), הפיגום מרכך והופך נזיל (ב ') ובכך ניתן ללחוץ באופן מכאני ("מצויד") בתוך פגם המודל (C). בעקבות הקירור לRT, פיגום SMP מוסר ושומר על צורתו החדשה, הקבוע הזמנית (ד '). על חימום שלאחר מכן ב ~ 60 ° C, הפיגום עובר התאוששות צורה לצורה גלילית המקורית, הגנרית. 
מדידת איור 3. זיכרון צורת ההתנהגות. זיכרון צורת ההתנהגות של פיגום SMP היא לכמת באמצעות בדיקת דחיסת שליטת מתח מחזורית-תרמית מכאנית על פיגום כדי לקבוע קביעות צורה (ו R) והתאוששות צורה (r R) המבוסס על מדידות של מטר ε, ε u, וε p. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 4. תצפית של porקישוריות דואר והיווצרות של hydroxyapatite (הפ). נציג תמונות SEM של פיגום SMP ללא ציפוי, טיפול בחום (בר = 200 מיקרומטר בקנה מידה) (א) ומצופית, טיפול בחום פיגום לאחר החשיפה לSBF (1X) במשך 14 ימים (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) (ב). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה של פיגום התנהגות הולמת עצמי שמצופה polydopamine, מבוסס PCL, כמו גם osteoinductivity ופעילות ביולוגית, הופך אותו לעניין בטיפול בפגמי עצם CMF לא סדירים. היבטים של הפרוטוקול עשויים להשתנות לשנות תכונות פיגום שונות.
הפרוטוקול מתחיל עם acrylation של PCL-דיאול להתיר תרופת UV. בדוגמא שדווחה, n M PCL-דיאול הוא ~ 10,000 g / mol. עם זאת, על ידי ההתאמה כראוי כמות acryloyl כלוריד וEt 3 N שימוש במהלך הסינתזה של PCL-DA, דיאול PCL עם n M גבוה יותר או נמוך יותר עשוי להיות מנוצל כדי להגדיל או להקטין, בהתאמה, צפיפות crosslink.
תבנית מלח התמזגה היא מרכיב חשוב לפרוטוקול (איור 1). הגודל הממוצע מלח קובע את הגודל הנקבובית פיגום וכתוצאה מכך. בדוגמא שתוארה, גודל מלח הממוצע היה ~ 460 ± 70 ו# 181; מ '. בעוד גודל מלח קטן יותר עלול להיות מנוצל, זה צריך להיות לזכור כי הפיגום עובר התכווצות במהלך שלב טיפול בחום הסופי אשר יפחית גודל נקבובית. סינון של מלח מנוצל כדי להקטין את גודל הפצת מלח, ולכן, התפלגות הגודל הנקבובית. כדי לייצר פיגום עם נקבוביות קשורות מאוד, היתוך מלח היה מושרה על ידי התוספת של כמות קטנה של מים (מבוסס 7.5% WT על משקל מלח). זה ידוע לפזר באופן חלקי חלקיקי NaCl מבודדים לתבנית poragen רציפה 25,26. בהתאם לגודל מלח הממוצע, כמות מים מוספים חייבת להיות מותאמת 14. יתר על כן, במהלך היתוך מלח, המים יש להוסיף בהדרגה, מעורבים מכאניים ולבסוף centrifuged כדי להבטיחה אפילו הפצה, כמו גם האריזה של חלקיקי מלח.
לאחר שיצר את תבנית מלח התמזגה, PCL-DA מומס בDCM לממס הליהוק. בפרוטוקול המתואר, concentration של 0.15 גרם של PCL-DA לכל 1 מיליליטר של DCM נוצל. ריכוז זה עשוי להיות מוגבר או מופחת. עם זאת, בעוד שריכוזי הגדלת צפוי להגדיל מודולוס פיגום, הוא יכול גם לייצר פיגומים עם קישוריות הנקבובית נמוך 14.
לאחר הפתרון המבשר נוספו על תבנית מלח, צנטריפוגה היא מועילה לעוזר בדיפוזיה שלה לתוך התבנית. בעקבות תרופת UV מהירה, ייבוש האוויר מאפשר אידוי של ממס DCM. לאחר ההסרה מהתבנית, הפיגום ספוג במים / אתנול (1: 1 כרך: כרך) במשך 4 ימים כדי להסיר את תבנית מלח. ההדמיה SEM מאשרת את הקמתה של מורפולוגיה נקבובית קשורה מאוד (איור 4 א).
ציפוי polydopamine מוחל על הקירות הנקבוביות של הפיגום להקנות פעילות ביולוגית. בשל הצטמקות פיגום וכתוצאה מכך, דרך טובה ביותר הוא להחיל את הציפוי לפני שלב הטיפול בחום הסופי 6. בנוסף, סילוק גזיםהפיגום תוך שקוע בפתרון דופמין המימי מסייע חדירה. שרידי פיגום degassed השקועים בפתרון כדי להקל על כיסוי polydopamine אחיד. ברגע שמצופה ושטף ביסודיות, הפיגום הלבן בעבר תערוכות אופייני צבע חום של polydopamine 21. לפיכך, כיסוי לאורך הפיגום ניתן להעריך על ידי בדיקה ויזואלית על ידי וחצה פיגום כדי לאשר דיפוזיה polydopamine.
לאחר היישום של ציפוי polydopamine, טיפול בחום סופי מתבצע (85 מעלות צלזיוס, 1 שעה). כאמור, תהליך זה גורם להתכווצות פיגום. עם זאת, טיפול בחום הוא חיוני להשגת צורת זיכרון התנהגות 14, אולי בשל ארגון מחדש של תחומים גבישי PCL (כלומר מגזרי מיתוג) בסמיכות קרובה יותר.
כפי שניתן לראות באיור 2, פיגום SMP הושג בפגם מודל ראוי עצמי בשלה thermoresponsive לעצביטבע Mory. חשיפה לחמם מלוחה (~ 60 מעלות צלזיוס) היתוך מושרה של תחומים גבישי PCL, כך שהפיגום מרוככת יכול להיות לחוץ לפגם המודל. כאשר הלחץ הידני שוחרר, התאוששות הצורה קידמה הרחבת הפיגום כדי למלא את הגבולות לא סדירים. עם הקירור לRT, תחומים גבישי PCL רפורמה, תיקון הפיגום לתוך הצורה הזמנית החדשה שלה שמרה על ההסרה מהפגם. בעבר, אישר כי הנקבוביות בשולי הפיגום הוסר נשאר די פתוח למרות מגע עם העובש 6.
כאשר נמדדים על ידי מבחני שליטת מתח מחזוריים-תרמיים מכאניים דחיסה (איור 3), אידיאלי התנהגות זיכרון צורה מאופיינת בערכי F R ו- R R של 100%. לפיגום SMP תאר, ערכי F R למחזורים 1 ו -2 היו מעט> 100% 6. ו R נצפה בעבר להיות מעט גראוכל מ -100% 14,27 בשל עלייה קלה בלחץ דחיסה בקיבעון צורה מהגיבוש מחדש של מגזרי PCL ליותר מבנים קומפקטיים 27 או מגיבוש מחדש מושרה דחיסה של PCL. בנוסף, R R עלה מ מחזור 1 מחזור 2 6. עלייה בערכי r R כבר ציינה בעבר ל28,29,22 מוצקים ונקבובי SMPS 13,14,23. הוא חשב כי במהלך המחזור הראשון, מתח השיורי שמקורם העיבוד הוסר כך שעליות התאוששות צורה במחזור 7 הבא.
פיגום הנדסת רקמות תאר משיג קבוצה מסוימת של מאפיינים קריטיים לטיפול המוצלח של פגמי עצם CMF. הפיגום צפוי להקל osseointegration באמצעות יכולתה "כושר-עצמי" בתוך פגם עצם CMF לא סדיר. Osteoconductivity צפוי מבוסס על הקישוריות הנקבובית השיגה, כמו גםפריקות ביולוגית פיגום. לבסוף, בשל ציפוי polydopamine, הפיגום הוא ביו-אקטיבי כפי שצוין על ידי ההיווצרות של HA במהלך בדיקות במבחנה (איור 4). פעילות ביולוגית זה צפוי להקל אינטגרציה ומליטה עם רקמות עצם. לפיכך, פיגום זה מייצג אלטרנטיבה לautografting ותחליפי עצם קונבנציונליים לתיקון פגם עצם CMF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים טקסס A & M הנדסת האוניברסיטה ותחנת ניסוי (טיז) לתמיכה כספית של מחקר זה. נייל לינדזי בתודה מודה תמיכה מלואיס אוניברסיטת סטוקס הברית טקסס A & M להשתתפות מיעוט (LSAMP) והקרן הלאומית למדע (NSF) בוגר תכנית עמיתי מחקר (GRFP). דא-הווים ג'אנג הודות טקסס A & M אוניברסיטת מסה המלגה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
| 4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
| Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
| Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
| Sieve | VWR | 47729-972 | |
| UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
References
- Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
- Elsalanty, M. E., Genecov, D. G. Bone grafts in craniofacial surgery. Craniomaxillofac Trauma Reconstr. 2, 125-134 (2009).
- Hollister, S. J., et al. Engineering craniofacial scaffolds. Orthod Craniofacial Res. 8, 162-173 (2005).
- Albrektsson, T., Johansson, C. Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration. Eur Spine J. 10, S96-S101 (2001).
- Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
- Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape-memory polymers. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2034-2057 (2002).
- Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
- Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
- Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
- Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
- Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
- Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
- Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
- Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
- Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
- Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
- Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
- Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
- Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
- Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
- Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
- Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
- Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
- Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
- Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).
