Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av et bioaktivt, PCL-baserte "Self-fitting" Shape Memory Polymer Stillas

Published: October 23, 2015 doi: 10.3791/52981
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Material Science and Engineering, Texas A&M University, 3Institute of Advanced Materials and Technology, University of Science & Technology Beijing

Introduction

Antatt gullstandarden for cranio-maxillofacial (CMF) bein defekt behandlinger, er transplantasjon av høstet autologe grafts hindret av komplekse pode prosedyrer, donor området sykelighet og begrenset tilgjengelighet en. Spesielt vanskelig er å forme og feste den stive autograft tett inn i defekten for å oppnå osseointegrasjon og for å forhindre graft resorpsjon. Tissue engineering har blitt undersøkt som en alternativ strategi for å autografting og syntetiske bein substitutter (f.eks beinsement) 2,3. Kritisk for å lykkes med en tissue engineering tilnærming er et stillas med et bestemt sett av eiendommer. Først, for å oppnå osseointegrasjon, må stillaset danner nær kontakt med tilstøtende benvev 4. Stillaset skal også være osteoconductive, tillater cellemigrasjon, nærings diffusjon og neotissue deponering 4,5. Denne oppførselen er vanligvis oppnås med nedbrytbare SCAffolds utviser en svært sammenvevd pore morfologi. Endelig bør stillaset være bioaktive slik som å fremme integrering og bonding med omkringliggende benvev 5.

Her presenterer vi en protokoll for å forberede en tissue engineering stillas med disse egenskapene. Viktigere, viser dette stillaset evnen til å "self-fit" i uregelmessige CMF mangler som skyldes formen minne atferd 6. Thermoresponsive formhukommelse polymerer (SMPS) er kjent for å gjennomgå formendring ved eksponering for varme 7,8. SMPS består av "netpoints" (dvs. kjemiske eller fysiske tverrbindinger) som bestemmer permanent form og "koblingssegmenter" som opprettholder en midlertidig form og gjenopprette den permanente form. Segmentene svitsje oppviser en varmeovergangstemperatur (T trans) svarende til enten den glassovergang (Tg) eller smelteovergang (T m) av polymeren. SomDerfor kan SMPS sekvensielt deformert i en midlertidig form ved T> T trans, fiksert i den midlertidige form ved T <T trans, og utvinnes i fast form ved T> T trans. Dermed kan en SMP stillaset oppnå "self-fitting" innenfor en CMF defekt som følger seks. Etter eksponering til varme saltløsning (T> T trans), ville en SMP stillaset blir formbare, hvilket tillater en generelt sylindrisk stillaset forberedt for hånd presses inn i en uregelmessig defekt, med form gjenvinning fremme ekspansjon av stillaset til defekten grense. Ved avkjøling (T <T trans), vil stillaset tilbake til sin relativt stiv tilstand, med form uforanderlighet opprettholde sin nye form midlertidig innenfor defekten. I denne protokollen, er en SMP stillaset forberedt fra polykaprolakton (PCL), en biologisk nedbrytbar polymer studert mye for vev gjenfødelse og andre biomedisinske applikasjoner 9-11. For formen minne, the T m av PCL tjener som T trans og varierer mellom 43 og 60 ° C, avhengig av molekylvekten av PCL-12. I denne protokollen, T trans (dvs. T m) av stillaset er 56,6 ± 0,3 ºC 6.

For å oppnå osteoconductivity, ble en protokoll utviklet for å gjøre PCL-baserte SMP stillaser med sterkt sammenknyttede porer basert på en løsningsmiddel-støpepartikkel-utvasking (SCPL) -metoden 6,13,14. Diakrylat polykaprolakton (PCL-DA) (M n = ~ 10 000 g / mol) ble anvendt for å muliggjøre hurtig, fotokjemisk tverrbinding, og ble oppløst i diklormetan (DCM) for å gi oppløsningsmiddelstøping over saltet malen. Etter fotokjemisk herding og fordampning av løsningsmiddel, ble saltet malen fjernes ved utlutning i vann. Den gjennomsnittlige størrelse salt regulerer stillas porestørrelse. Viktigere, ble saltet mal smeltet sammen med vann før løsemiddel avstøpning å oppnå pore interconnectivity.

Bioaktivitet ble formidles til SMP stillaset ved in situ-dannelse av en polydopamine belegg på poreveggene 6. Bioaktivitet blir ofte innført i stillaser av inkluderingen av glass eller glass-keramiske fyllstoffer 15. Men disse kan gi opphav til uønskede sprø mekaniske egenskaper. Dopamin har vist seg å danne et vedheftende, tynne polydopamine lag på en rekke forskjellige substrater 16-19. I denne protokollen, ble SMP stillaset utsettes for en svakt basisk løsning (pH = 8,5) av dopamin til å danne et belegg av polydopamine nanothick på alle pore veggflater 6. I tillegg til å øke hydrofilisiteten til overflaten forbedret celle adhesjon og spredning, har polydopamine blitt vist å være bioaktivt når det gjelder dannelse av hydroksyapatitt (HAP) ved eksponering overfor simulert kroppsvæske (SBF) 18,20,21. I et siste trinn blir den belagte stillaset utsettes for varmebehandling ved 85 ° C (T> T trans) which fører til stillas fortetting. Varmebehandling ble tidligere kjent for å være avgjørende for stillas formen minne atferd, kanskje på grunn av PCL krystallinske domener omorganisering til større nærhet 14.

Vi i tillegg beskrive metoder for å karakterisere selvsittende atferd i en uregelmessig modell defekt, forme minne atferd i form stammestyrte syklisk-termiske mekanisk trykkprøver (dvs. form utvinning og forme fixity), pore morfologi, og in vitro bioaktivitet. Strategier for å skreddersy stillas egenskaper er også presentert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. syntetisere PCL-DA makromer

  1. Kjør acrylation reaksjon.
    1. Vei opp 20 g av PCL-diol (M n = ~ 10 000 g / mol) i en 250 ml rundbunnet kolbe utstyrt med et teflon-dekket magnetisk rørestav.
    2. Løs opp PCL-diol i DCM.
      1. Legg 120 mLlof DCM til kolben (konsentrasjon = 0,17 g / ml).
      2. Plasser en gummiskillevegg løst inn i halsen av kolben, slik at man unngår oppbygging av trykk og samtidig hindrer fordampning av DCM.
      3. Omrør løsningen i 30 minutter ved ~ ~ 250 rpm for fullstendig å oppløse polymeren.
    3. Legg ~ 6,6 mg 4-dimetylaminopyridin (DMAP) til oppløsningen og oppløses under omrøring.
    4. Plasser en gummiskillevegg fast inn i halsen på kolben. Tillat løsningen å fortsette omrøring.
    5. Gjennom gummiskillevegg, forsiktig spyle kolben med N2 i ~ 3 minutter ved hjelp av et positivt N2 trykk nål innløp og et åpent nålsom en stikkontakt.
    6. Fjerne N2 innløp og utløp.
    7. Legg 0,56 ml (4,0 mmol) trietylamin (Et3N) dråpevis via en glassprøyte utstyrt med en nål stikkes gjennom gummi septum.
    8. Legg 0,65 ml (8,0 mmol) akryloylklorid dråpevis ved hjelp av en glassprøyte utstyrt med en nål stikkes gjennom gummi septum.
    9. Returner N2 innløp til kolben og tillate innholdet å omrøres under positivt N2 trykk for ~ 30 min.
    10. Forvarmer et oljebad til 55 ° C.
    11. Etter den avsatte ~ 30 min, ta av N 2 innløp og erstatte septum med en kondensator.
    12. Neddykke kolben i den på forhånd oppvarmede oljebad.
    13. Tillate innholdet i kolben omrørt i 20 timer.
    14. Etter at den avsatte 20 timer, fjern kolben fra oljebadet og la innholdet avkjøles til romtemperatur.
    15. Ved hjelp av en rotasjonsfordamper, DCM fjerne løsningsmiddel fra kolben.
  2. Purify råoljen PCL-DA produkt.
    1. Til kolben, tilsett ~ 135 ml etylacetat, og oppløse det rå PCL-DA.
    2. Tyngdekraften filtrer løsningen gjennom filterpapir i en ren 250 ml rundbunnet kolbe. (Merk: Løsning kan tykkere på filterpapiret, ikke lett passerer gjennom i så fall gjelde mild varme forsiktig med en varmepistol.).
    3. Ved hjelp av en rotasjonsfordamper, tar etylacetatløsningsmiddel fra kolben.
    4. Til kolben, tilsett ~ 140 ml DCM og oppløse det rå PCL-DA.
    5. Overføre innholdet til en 500 ml skilletrakt.
    6. Til trakten, tilsett 13,5 ml av 2 M kaliumkarbonat (K 2 CO 3).
    7. Cap trakten. Bland forsiktig de to lagene ved å snu trakten og virvlende forsiktig en gang eller to, ta vare for å lette trykket via stoppekranen. Dette gjentas 3 ganger.
    8. Sett hetten med et lag Parafilm og tillate blandingen å skille O / N (~ 12 timer).
    9. Samle bunnen, ellerløse lag inn i en 250 ml Erlenmeyer kolbe.
    10. Legg ~ 5 g vannfritt magnesiumsulfat (MgSO4) til kolben og virvle.
    11. Tyngdekraften å filtrere blandingen gjennom kvalitativt filterpapir, og inn i et rent 250 ml rundbunnet kolbe.
    12. Ved hjelp av en rotasjonsfordamper, DCM fjerne løsningsmiddel fra kolben.
    13. Til tørrhet under høyvakuum for å fjerne gjenværende DCM. (Merk: PCL-DA bør lagres borte fra lys.)
    14. Bekreft acrylation med en H NMR 22,23.

2. Klargjøring av SMP Stillas (figur 1)

  1. Klargjør smeltet salt mal.
    1. Bruk en 425 um sikt for å oppnå Natriumklorid (NaCl) partikler ~ 460 ± 70 mikrometer i diameter. (Merk: Gjennomsnittlig partikkelstørrelse kan bli bekreftet fra scanning elektronmikroskopi [SEM] bilder med ImageJ programvare.) 14
    2. Til en 3 ml hetteglass (ID = 12,9 mm), tilsett 1,8 g av den tidligere siktet NaCl.
    3. Tilsett langsomt, i fire porsjoner, 7,5 vekt% (basert på vekten salt) DI vann (0,146 g) til ampullen. Bland med en metallspatel etter tilsetningen av hver porsjon vann.
    4. Lukk glasset, pakk i vev og plassere vertikalt inn et sentrifugerør. Sentrifuger i 15 minutter ved 3220 x g.
    5. Ta av lokket og la lufttørke O / N (~ 12 timer).
  2. I et nytt hetteglass, utarbeide en "makromer løsning" ved å kombinere 0,15 g PCL-DA per ml DCM. (Merk:. For en stillaset, ~ 1 ml av oppløsningen bør fremstilles) med netting og blande løsningen med høy hastighet på en vortex-blander for ~ 1 min.
  3. I en ny 3 mL hetteglass, fremstille en "fotoinitiator løsning", basert på 10 vekt% 2,2-dimetoksy-2-fenyl-acetofenon (DMP) i 1-vinyl-2-pyrrolidinon (NVP). Kombiner 0,115 g DMP i 1 ml NVP. (Merk: For ett stillas, ~ 180 mL er nødvendig.) Cap, pakk inn i aluminiumsfolie (for å blokkere lys) og bland løsningen i høy hastighet på en vortex mixerfor ~ 1 min. (Merk: Hvis utarbeidet i avansert, bør løsningen være nedkjølt og beskyttet mot lys.)
  4. Pakk hetteglasset med makromeren oppløsning (unntatt hetten) med aluminiumsfolie (for å blokkere lys) og tilsett via pipette 15 vol% (basert på totalt volum av makromer løsning) av fotoinitiatoren løsningen. Cap og blande løsningen med høy hastighet på en vortex-blander for ~ 1 min.
  5. Pakk i hetteglasset med smeltet salt mal (eksklusive cap) med aluminiumsfolie (for å blokkere lys) og tilsett via pipette den tidligere utarbeidet makromer / fotoinitiator oppløsning (~ 0,6 ml eller til malen er helt dekket).
  6. Lukk glasset, pakk i vev og plassere vertikalt inn et sentrifugerør. Sentrifuger i 10 minutter ved 1260 x g for å fordele makromeren løsningen gjennom malen.
  7. Ta av folien, korken på flasken og utsettes for UV-lys (365 nm, 25 W) for 3 min. Lufttørke O / N.
  8. Reduser "saltholdige scaffold "fra hetteglasset med pinsett etter scoring og oppsprekking toppen av hetteglass.
  9. I et 400 ml begerglass, forberede ~ 200 ml av en vann / etanol-løsningsmiddel (1: 1 vol: vol).
  10. Opprettholde stillas neddykket i vann / etanol-løsningsmiddel i 4 dager med daglige løsemiddel endringer.
  11. Fjern stillaset fra løsningsmidlet og lufttørke O / N.

3. Bruk Polydopamine Coating til SMP Stillas (figur 1)

  1. I 400 ml begerglass utstyrt med et teflon-dekket rørestav forberede ~ 200 ml av en dopamin-hydroklorid oppløsning (2 mg / ml i 10 mM Tris-buffer, pH = 8,5, 25 ° C). Rør på ~ 150 rpm.
  2. Plasser en engangs nål (lengde = 40 mm, sporvidde = 20) i stillaset, ~ halve distansen gjennom stillaset. Pakk en ledning rundt nålen hub.
  3. Senk stillaset (med nål-muffen over oppløsningen overflaten) til omrørings dopamin løsningen ved forankring av ledningen til kanten av begeret.
  4. Avgasse stillas ved å plassere en sprøyte inn i nål-muffen, og bruker den til å trekke luft ut av stillaset. (Merk: Avgassing er fullført når ikke noe mer luft kan fjernes, og løsningen fullstendig infiltrert stillaset.)
  5. Opprettholde stillas neddykket i røre dopamin løsningen i 16 timer.
  6. Fjern stillaset fra løsningen og ta ut nålen. Skyll med DI vann og tørk i en vakuum-ovn ved RT i 24 timer.
  7. Plasser stillaset i en 85 ºC ovnen i 1 time.
  8. La stillaset avkjøles til RT. Den endelige sylindriske Stillaset blir ~ 6 mm diameter x ~ 5 mm høyde.

4. Evaluere "Self-fitting" Behavior

  1. Utarbeide en "uregelmessig CMF defekt modellen" ved hjelp av et ark av stiv plast med tykkelse er ~ 5 mm. Bruke en drill for å skape et tomrom innenfor den plastplate med en midlere diameter som er litt mindre enn ~ 6 mm, som vist i figur 2A.
  2. I abEaker, varme DI-vann (som representerer den kliniske bruk av saltoppløsning) til en temperatur på ~ 60 ° C.
  3. Plasser stillaset i begerglasset på ~ 60 ° C vann. Bruk pinsett til å skyve stillaset under vannflaten, utsettes alle deler av vannet. Fortsett for ~ 2 min eller til stillaset er merkbart mykere (figur 2B).
  4. Fjern stillaset fra begeret og umiddelbart trykk (hånd) inn i modellen defekt.
  5. La blandingen avkjøles til romtemperatur (~ 5-10 min) (figur 2C).
  6. Fjerne fra defekten for å observere den nye, faste midlertidig form, og tilbakeføring av den relativt mer stiv tilstand (figur 2D).

5. Testing Shape Memory Behavior

  1. Ved hjelp av en dynamisk mekanisk analysator (DMA, for eksempel en TA Instruments Q800 som brukt her), kjøre en belastning styrt syklisk-termomekanisk kompresjonstest på et stillas over to sykluser (N) for å bestemme formen fixity (Rf) ogform recovery (Rr) (figur 3).
    1. Ekvilibrere til 60 ° C (T høy) i 5 min.
    2. Komprimer til en maksimal belastning (ε m = 50%) ved 50% / min.
    3. Hold på ε m (5 min).
    4. Avkjøl til 25 ° C (T lav) og vedlikeholde i 10 min for å fikse den midlertidige form.
    5. Fjern lasten.
    6. Mål ultimate belastning i stress-fri tilstand (ε u).
    7. Varm opp til 60 ° C (T høy) og opprettholde i 10 minutter for å gjenvinne den faste form.
    8. Mål gjenvunnet stamme (ε p).
    9. Mens fortsatt ved 60 ° C (T høy) ved å starte 2. syklus (N = 2) ved sammenpressing av stillaset til 50% av høyden gjenvunnet etter den 1. syklus (N = 1).
    10. Gjenta 5.1.3-5.1.8 For N = 2.
    11. Beregn R f og R r for N = 1 og 2 ved hjelp av følgende ligninger:
      Rf (N) = [ε u (N) / m ε] R r (N) = [ε m - ε p (N)] / [ε m - ε p (N-1)]

6. Visualisere Pore Størrelse og Pore tilkoblinger

  1. Ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM, for eksempel et FEI Quanta SEM som brukt her), observere porestørrelsen og pore tilkoblinger.
    1. Ved hjelp av pinsett til å holde SMP stillaset, senk i flytende N 2 for 1 min.
    2. Fjern fra flytende N2 og brudd langs midten av stillaset med en ren barberblad.
    3. Ved hjelp av karbon tape, lime en av de SMP stillas halvdeler på prøveniscenesette med brukket siden opp.
    4. Frese frakk med Au-Pt (~ 4 nm).
    5. Fange SEM bilde på en anbefalt akselererende spenning på 10-15 kV (Figur 4A).

7. Testing av in vitro Bioaktivitet

  1. I et 50 ml sentrifugerør, tilsett ~ 30 ml 1X SBF 24.
  2. Skaff et stillas i sin opprinnelige, sylinderformet permanent form. Skjær stillaset i halvparten (over sirkulær kant) med en ren kniv.
  3. Plasser et individ stillaset halvparten i forberedt sentrifugerør og cap.
  4. Opprettholde røret ved 37 ° C i et vannbad under statiske betingelser uten SBF endringer.
  5. Etter 14 dager, fjerne stillaset fra SBF og lufttørke i 24 timer.
  6. Ved hjelp av karbon tape, feste stillaset på prøven scenen med brukket siden opp.
  7. Frese frakk med Au-Pt (~ 4 nm).
  8. Fange SEM bilde på en reroste akselererende spenning på 10-15 kV (figur 4B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den resulterende PCL-baserte SMP stillaset er i stand til selv-passer inn i en modell CMF defekt (figur 2). Etter kort eksponering til varme saltløsning (~ 60 ° C), mykner det sylindriske stillaset slik at stillaset må manuelt presses inn i og ekspandere innenfor modellen defekten. Etter avkjøling til RT blir stillaset fast i sin nye midlertidige form som bibeholdes etter fjerning fra defekten.

Formminne oppførselen til en SMP stillaset er kvantifisert ved strekkstyrte cykliske-termisk mekanisk trykkprøver i form av form fixity (Rf) og formgjenvinnings (Rr) (figur 3). For dette PCL-baserte SMP stillaset, verdier (%) for cykler N = 1 og 2 er: Rf (1) = 102,5 0,7, Rf (2) = 101,8 0,3, R r (1) 95,3 0,9, og R r (2) = 99,8 0,2 6.

SMP stillas viser en svært sammenvevd pore morfologi som observertav SEM imaging (Figur 4A). Dette ble oppnådd ved anvendelse av et smeltet salt mal, som dannes ved tilsetning av en liten mengde vann til det siktede salt (figur 1).

Etter eksponering overfor simulert kroppsvæske (SBF; 1X) i 14 dager, bekrefter SEM avbildning dannelsen av HAP (figur 4B) og dermed indikerer stillaset bioaktivitet.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk for utarbeidelse av SMP stillas belagt med polydopamine. ASMP stillaset er fabrikkert via den beskrevne protokoll basert på den foto kur av polykaprolakton diacrylate (PCL-DA) med en løsemiddel avstøpning partikkel-utlekking (SCPL) metode som anvender smeltet salt mal og påføring av et bioaktivt polydopamine belegg. Den avsluttende varmebehandling ved 85 ° C (T> T trans) induserer den stillasetsering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Observasjon av selvsittende oppførsel. En sylindrisk SMP stillas (~ 6 mm diameter x ~ 5 mm høyde) er montert i en "irregulær defekten modell" (A) som følger. Ved oppvarming i vann ved 60 ° C ~ (T> T trans), stillaset mykner og blir formbart (B) og kan således mekanisk presset ("montert") innenfor modellen defekt (C). Etter avkjøling til RT blir den SMP stillaset fjernet og beholder sin nye, faste midlertidig form (D). Ved etterfølgende oppvarming ved ~ 60 ° C, gjennomgår stillaset formgjenvinnings til den opprinnelige, generell sylindrisk form.

Figur 3
Figur 3. Måling av formhukommelsesadferd. Formen minne oppførselen til en SMP stillaset er kvantifisert gjennom en stamme styrt cyklisk-termisk mekanisk kompresjonstest på et stillas for å bestemme formen fixity (Rf) og formgjenvinnings (Rr) på grunnlag av målinger av ε m, ε u, og ε s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Observasjon av pore tilkoblinger og dannelse av hydroksyapatitt (HAP). Representant SEM bilder av en ubestrøket, varmebehandlet SMP stillaset (skala bar = 200 mikrometer) (a) og bestrøket, varmebehandlet stillaset etter eksponering for SBF (1X) i 14 dager (skala bar = 50 mikrometer) (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver fremstilling av en polydopamine belagt, PCL-baserte stillaset som selvsittende atferd, samt osteoinductivity og bioaktivitet, gjør det av interesse i behandling av uregelmessige CMF beinskader. Aspekter ved protokollen kan bli endret for å endre forskjellige stillas egenskaper.

Protokollen begynner med acrylation av en PCL-diol å tillate UV kur. I det rapportert eksempel PCL-diol M n ~ 10000 g / mol. Men ved passende justering av mengden av akryloylklorid og Et3N som brukes under syntesen av PCL-DA, en PCL-diol med et høyere eller lavere M n kan anvendes øker, henholdsvis tverrbindingsdensitet å redusere eller.

Det smeltede saltet Malen er en viktig komponent til protokollen (figur 1). Den gjennomsnittlige salt størrelse bestemmer den resulterende stillaset porestørrelse. I det beskrevne eksempel den gjennomsnittlige salt størrelsen var ~ 460 ± 70 &# 181; m. Mens en mindre salt størrelse kan benyttes, bør det tas i betraktning at stillaset utsettes for krymping under den siste varmebehandlingstrinnet som vil redusere porestørrelse. Sikting av saltet anvendes for å redusere saltet størrelsesfordeling, og derfor porestørrelsesfordelingen. For å fremstille et stillas med høyt sammenkoblet porer, ble salt fusjon indusert ved tilsetning av en liten mengde vann (7,5 vekt% basert på vekten salt). Dette er kjent for å delvis oppløse isolerte NaCl-partikler til et kontinuerlig poragen mal 25,26. Avhengig av den gjennomsnittlige størrelse salt, må den mengde vann som tilsettes reguleres 14. Videre, i løpet av salt fusjon, må tilsettes vannet gradvis, mekanisk blandet og til slutt sentrifugert for å sikre dets jevn fordeling, samt pakking av saltpartiklene.

Etter å ha dannet det smeltede saltet mal, PCL-DA oppløst i DCM for løsningsmiddelstøping. I den beskrevne protokoll, en-konsentrasjonn av 0,15 g PCL-DA per 1 ml DCM ble benyttet. Denne konsentrasjonen kan økes eller reduseres. Men mens økende konsentrasjoner forventes å øke stillaset modulus, det kan også produsere stillaser med lavere pore tilkoblinger 14.

Når forløperen løsningen er blitt tilsatt til saltet formen, er sentrifugering nyttig å aide i dens diffusjon inn i malen. Etter hurtig UV-herding, tillater lufttørking fordampning av DCM løsningsmiddel. Etter fjerning fra formen, blir stillaset dyppet i vann / etanol (1: 1 vol: vol) i 4 dager for å fjerne salt malen. SEM avbildning bekrefter dannelsen av et sterkt sammenknyttede pore morfologi (figur 4A).

En polydopamine belegg påføres poreveggene av stillaset til å formidle bioaktivitet. På grunn av den resulterende stillaset svinn, er det best å påføre belegget før den endelige varmebehandlingstrinn 6. I tillegg avgassingstillaset mens neddykket i den vandige oppløsning dopamin bistår infiltrasjon. Avgasset stillas restene neddykket i løsningen for å lette uniform polydopamine dekning. Når belagt og skylles grundig, viser den tidligere hvite stillaset en brun farge karakteristisk for polydopamine 21. Dermed kan dekning over hele stillaset bli vurdert ved visuell inspeksjon ved å halvere et stillas for å bekrefte polydopamine diffusjon.

Etter påføring av belegget polydopamine, blir en endelig varmebehandling utføres (85 ° C, 1 time). Som bemerket, resulterer denne fremgangsmåte i stillaset krymping. Men det er avgjørende for å oppnå formen minne atferd 14, kanskje på grunn av omorganisering av PCL krystallinske domener (dvs. koblingssegmenter) i større nærhet varmebehandling.

Som vist i figur 2, SMP stillaset oppnådde selvsittende i en modellfeil på grunn av sin thermoresponsive forme megMory naturen. Eksponering for å varme saltløsning (~ 60 ° C) Indusert smeltingen av PCL krystallinske domener, slik at det myknede stillaset kan bli presset inn i modellen defekten. Når den manuelle trykket ble frigjort, formen gjenvinning fremmet ekspansjon av stillaset til å fylle de uregelmessige grenser. Etter avkjøling til RT, PCL krystallinske domener reformert, feste stillaset inn i sin nye form, som midlertidig ble holdt tilbake etter fjerning fra defekten. Tidligere har vi bekreftet at porene langs kantene av den fjernede stillaset forble helt åpen til tross for berøring med formen 6.

Når målt ved strekkstyrte cyklisk-termisk mekanisk trykkprøver (figur 3), ideelle formhukommelses opptreden er karakterisert ved R f R og r verdier på 100%. For den beskrevne SMP stillaset, R f verdiene for sykluser 1 og 2 var litt> 100% 6. Rf er tidligere blitt observert å være svakt greater enn 100% 14,27 på grunn av en liten økning i trykk belastning under formen fiksering fra omkrystallisering av PCL-segmenter i mer kompakte strukturer 27 eller fra kompresjons-indusert omkrystallisering av PCL. I tillegg, r R økt fra en syklus til syklus 2 6. En økning i r r-verdier som tidligere er angitt for faste stoff 28,29,22 og porøs SMPS 13,14,23. Det er antatt at under den første syklus, blir restspenningene stammer fra bearbeiding fjernes slik at formen gjenvinning av økninger i den neste syklus 7.

Den beskrevne tissue engineering stillaset oppnår den spesifikke sett med egenskaper kritiske for vellykket behandling av CMF beinskader. Stillaset forventes å lette osseointegrasjonen gjennom sin evne til å "self-fit" innenfor en uregelmessig CMF bendefekten. Osteoconductivity er spådd basert på oppnådde pore tilkoblinger samtstillaset nedbrytbarhet. Til slutt, på grunn av polydopamine belegg, er stillaset bioaktive som indikert ved dannelsen av HA i løpet av in vitro tester (figur 4B). Dette bioaktivitet er spådd å lette integrering og bonding med omkringliggende benvev. Dermed representerer dette stillaset et alternativ til autografting og konvensjonelle bein substitutter for CMF bendefekten reparasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne takker Texas A & M University Engineering og Experiment Station (TEE) for økonomisk støtte til denne forskningen. Lindsay Nail erkjenner takknemlig støtte fra Texas A & M University Louis Stokes Alliance for minoritets Deltakelse (LSAMP) og National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP). Dawei Zhang takker Texas A & M University Dissertation fellesskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) Sigma-Aldrich 440752
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich D65100 Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma-Aldrich D5640
Triethylamine (Et3N) Sigma-Aldrich T0886
Acryloyl chloride Sigma-Aldrich A24109
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 319902
Potassium carbonate (K2CO3) Sigma-Aldrich 209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) Fisher M65
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) Sigma-Aldrich 196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409
Ethanol Sigma-Aldrich 459844
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502
Tris buffer (2mol/L) Fisher BP1759 Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve VWR 47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) UVP 95-0426-02
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) TA Instruments Q800
High Resolution Sputter Coater Cressington 208HR
Scanning Electron Microscope (SEM) FEI Quanta 600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
  2. Elsalanty, M. E., Genecov, D. G. Bone grafts in craniofacial surgery. Craniomaxillofac Trauma Reconstr. 2, 125-134 (2009).
  3. Hollister, S. J., et al. Engineering craniofacial scaffolds. Orthod Craniofacial Res. 8, 162-173 (2005).
  4. Albrektsson, T., Johansson, C. Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration. Eur Spine J. 10, S96-S101 (2001).
  5. Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
  6. Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
  7. Lendlein, A., Kelch, S. Shape-memory polymers. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2034-2057 (2002).
  8. Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
  9. Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
  10. Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
  11. Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
  12. Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
  13. Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
  14. Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
  15. Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
  16. Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
  17. Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
  18. Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
  19. Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
  20. Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
  21. Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
  22. Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
  23. Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
  24. Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
  25. Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
  26. Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
  27. Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
  28. Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
  29. Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).

Tags

Bioteknologi Shape minne polykaprolakton polydopamine stillas salt mal bioaktive bein healing
Fabrikasjon av et bioaktivt, PCL-baserte &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Stillas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nail, L. N., Zhang, D., Reinhard, J. … More

Nail, L. N., Zhang, D., Reinhard, J. L., Grunlan, M. A. Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold. J. Vis. Exp. (104), e52981, doi:10.3791/52981 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter