Summary
دي نوفو تكون الدهون وحمض أكسدة β الدهنية تشكل المسارات الأيضية الأساسية في الكبدية، الممرات التي يتم مضطرب في العديد من الاضطرابات الأيضية، بما في ذلك مرض الكبد الدهني. نحن هنا لشرح عزل خلايا الكبد الأولية الماوس ووصف الكمي للأكسدة الأحماض الدهنية-β وتكون الدهون.
Protocol
وينبغي إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للوائح المحلية والاتحادية وبموافقة من إدارة IACUC والسلامة من الإشعاع المؤسسية.
1. إعداد
- عدة أيام قبل الفحص، ذوبان الجليد في زجاجة 500 مل من الكبد دايجست متوسط (LDM) واعادة تجميد ~ 35 مل قسامات في أنابيب مخروطية 50 مل. تخزين في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- قبل يوم واحد للفحص، قبل تعقيم أدوات تشريح النظيفة الأوتوكلاف.
- في يوم الفحص، علاج المبلغ اللازم لوحات ثقافة 24-جيدا مع الكولاجين.
- مزيج 1 جزء من 3 ملغ / مل ذيل فأر الكولاجين مع 50 أجزاء من برنامج تلفزيوني. إضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 24-جيدا واحتضان لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة الكولاجين والسماح لوحة في الهواء الجاف في غطاء محرك السيارة. كرر وقت إضافي واحد على الأقل.
ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها الكولاجين طلاء تصل إلى أسبوع واحد في الإعلانفانس ولوحات تخزين عند 4 درجات مئوية مختومة في غلاف بلاستيكي.
- مزيج 1 جزء من 3 ملغ / مل ذيل فأر الكولاجين مع 50 أجزاء من برنامج تلفزيوني. إضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 24-جيدا واحتضان لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة الكولاجين والسماح لوحة في الهواء الجاف في غطاء محرك السيارة. كرر وقت إضافي واحد على الأقل.
- إعداد LDM للفحص: ذوبان LDM ودافئة إلى 37 درجة مئوية، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 N KOH. تصفية باستخدام 0.2 ميكرون تصفية المحاقن والمكان في إعادة تدوير 42 ° C حمام الماء.
- الدافئة 25 مل من الكبد الإرواء متوسطة إلى 42 درجة مئوية في إعادة تدوير مياه الاستحمام.
- إعداد السيليكا الغروية 90٪ المغلفة مع حل بوفيدون: إضافة 1 مل من 10X DPBS إلى 9 مل من السيليكا الغروية المغلفة مع بوفيدون. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. ابحث مع العقيمة 0.2 ميكرون تصفية المحاقن. تخزين في RT.
- دافئ تصفيح متوسطة إلى 37 ° C.
2. عزل الابتدائية ماوس خلايا الكبد
- انشاء مضخة تحوي، وأنابيب، وطاولة التشريح: تعقيم الأنابيب عن طريق تنظيف مع 5 مل 70٪ من الإيثانول في الماء المقطر، تليها 10 مل من الماء المعقم. وضع أنابيب في الكبد الإرواء المتوسطة ومضخة تشغيل لملءطول الأنبوب.
- التضحية الماوس عن طريق أسلوب افق مؤسسيا.
- تشريح فتح تجويف البطن: رش البطن الماوس تحرري مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص حادة نهاية، وجعل شق خط الوسط من خلال الأدمة طول البطن وتعكس أفقيا. جعل شق مماثل في الصفاق لفضح الأحشاء.
- باستخدام أداة حادة، تهجير بلطف الأمعاء لفضح الأوعية الدموية في البطن حدد موقع البطن الوريد الأجوف السفلي (IVC) ووضع خياطة تحت الأوعية الدموية، البعيدة إلى الوريد الكلوي
- القاصي إلى خياطة، ضع إبرة والقسطرة في IVC، والنهوض إلى ما وراء مستوى خياطة. مع الإبرة لا تزال في مكانها، ربط الخيط حول القسطرة ليثبت في مكانه. إزالة الإبرة بعناية. إذا فعلت بشكل صحيح، والدم مع تدفق من خلال القسطرة.
- باستخدام الماصة، وملء المساحة المتبقية في القسطرة مع نضح المتوسطة، وضمانأن لا الهواء موجود. مع عناية كبيرة، ونعلق أنابيب إلى القسطرة.
- تشريح فتح تجويف الرئة: تعكس بلطف فصوص الكبد متفوقة على فضح الحجاب الحاجز. ثقب بعناية الحجاب الحاجز مع مقص حاد الحافة، ثم إجراء شق الجانبي لفضح تجويف الجنبي، مع الحرص على تجنب المرارة والأوعية الدموية الجنبي. وضع المشبك البلدغ حول الصدري الوريد الأجوف السفلي فقط الداني إلى الوريد الكبدي.
- قطع الوريد البابي وتشغيل المضخة في 3-4 مل / دقيقة. يروي الكبد مع الكبد الإرواء متوسطة لمدة 5 دقائق باستخدام ما يقرب من 20 مل من نضح المتوسطة.
ملاحظة: الكبد يجب أن تتغير فورا من اللون الأحمر إلى اللون الرمادي / تان. إذا أجزاء من الكبد لا تزال حمراء، وهذا يدل على الأرجح ضعف التروية، وتقلص من احتمالات العزلة ناجحة إلى حد كبير. خلال التروية، وتوخي الحذر لضمان المتوسطة لا ينفد وأنه لا يوجد فقاعات إدخال الأنبوب. - بعد الحضانة مدة 5 دقائق، ووقفضخ ونقل الأنابيب إلى الكبد دايجست المتوسطة. إعادة تشغيل المضخة ويروي الكبد عن 10 آخرين - 15 دقيقة (حتى المتوسط هو استنفدت).
- في نهاية نضح، ووقف ضخ. وينبغي أن يكون الكبد على لون وردي وتظهر الموسع نوعا ما. استئصال الكبد عن طريق تشريح دقيق. إزالة المرارة ونقل الكبد لصحن 10 سم زراعة الأنسجة.
- في خزانة السلامة البيولوجية، إضافة 10 مل من الطلاء المتوسطة (الجدول 1) إلى الكبد. كشط بلطف الكبد باستخدام ملقط أو مشرط لإزالة خلايا الكبد. تصفية تعليق باستخدام مصفاة الخلية 100 ميكرون ونقل إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. غسل لوحة مع 10 مل إضافية من الطلاء المتوسطة وتجمع في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج، 4 ° C.
- نضح المتوسطة وبيليه resuspend في 10 مل من طلاء المتوسطة وإضافة 10 مل من 90٪ السيليكا الغروية المغلفة مع بوlyvinylpyrrolidone. المزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.11. بعد الطرد المركزي، وطبقة من الخلايا الميتة وسوف تطفو على أعلى خليط، في حين أن الخلايا الحية سوف بيليه إلى أسفل.
- نضح الخلايا الميتة والمتوسطة. غسل 2 مرات مع 20 مل من طلاء المتوسطة، الطرد المركزي كما هو الحال في 2.11.
- خلايا resuspend في 10 مل من طلاء متوسط. عدد الخلايا مع عدادة الكريات ووضع 9 × 10 4 خلايا / جيد في أطباق ثقافة 24-جيدا تعامل الكولاجين. احتضان في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 2 ساعة. كل لوحة يمكن أن تستخدم إما لفحص أكسدة الأحماض الدهنية أو مقايسة تكون الدهون.
- اختياريا، تغيير الآبار لصيانة المتوسطة (الجدول 1) والثقافة في 37 ° C. الخلايا يمكن تربيتها ل2-3 أيام دون التأثير على نتائج الفحص.
3. الأحماض الدهنية الأكسدة الفحص
تحذير: استخدام النشاط الإشعاعي يمكن أن تكون خطرة. جميع عمليات الشراء والتخزين والمناولة، وديوينبغي أن يتم sposal المواد المشعة وفقا المؤسسية، والدولة، واللوائح والمبادئ التوجيهية الاتحادية.
- 16-20 ساعة قبل الفحص، وغسل الخلايا 2 مرات مع PBS الدافئ. تغيير الخلايا لمصل تجويع متوسط خالية من المصل (الجدول 1) مع 20 نانومتر الجلوكاجون واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
ملاحظة: نظرا لأن المصل البقري الجنين يحتوي على تركيز غير معروف من هرمونات التمثيل الغذائي (مثل الانسولين، والجلوكاجون)، مصل تجويع الخلايا لإزالة أي آثار الخلط قد تترتب على هذا الفحص. خلايا قابلة للبقاء في المصل تجويع المتوسطة ل> 24 ساعة. ويستخدم العلاج الجلوكاجون لتحفيز أكسدة الأحماض الدهنية داخل خلايا الكبد. - في صباح يوم الفحص، وإعداد ما قبل الحضانة المتوسطة: و resuspend مبلغ مناسب من بالميتات الصوديوم في الماء عالى النقاء لجعل حل 100 ملم والحرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في هذه الأثناء، تعد الكمية المطلوبة (0.5 مل لكل بئر من 24 لوحة جيدا)من DMEM مع 25 ملي HEPES، 1٪ BSA جزء V، و 20 نانومتر الجلوكاجون. الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
- مرة واحدة solubilized، إضافة بالميتات إلى التركيز النهائي من 250 ميكرومتر إلى المتوسطة. تغيير خلايا الكبد إلى مرحلة ما قبل الحضانة المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. حجز بعض ما قبل الحضانة المتوسطة في 37 ° C لاستخدامها لاحقا.
- أثناء الحضانة، وتجف مبلغ مناسب من 14 C-بالميتات (0.5 μCi / جيد) عن طريق التبخر تحت غاز النيتروجين.
- على سبيل المثال، لقياس 24 عينة في 24 لوحة جيدا، ونقل 120 ميكرولتر من 0.1 μCi / مل 14 C-بالميتات إلى أنبوب 1.5 مل. تتبخر ببطء الإيثانول المذيبات التي تهب غاز النيتروجين على حل من مسافة 3-5 سم في غطاء الدخان. المذيب أن تتبخر في حوالي 30-40 دقيقة، وترك الجافة 14 C-بالميتات في الجزء السفلي من الأنبوب.
- ما يقرب من 15 دقيقة قبل نهاية الحضانة، resuspend و14C-بالميتات في 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم (12.5 ميكرولتر / μCi). احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة ثلاثة مجلدات باب الحارة ما قبل الحضانة المتوسطة ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- ارتفاع كل جيدا مع 25 ميكرولتر من المخفف 14 C-بالميتات. مزيج من قبل هزاز بلطف لوحة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. هذا هو الفحص اللوحة.
- أثناء الحضانة، وإعداد لوحة فلتر ورقة (الشكل 1).
- إزالة الغطاء من معقمة 24 لوحة جيدا. مكان واحد 2 سم × 2 سم قطعة من ورق الترشيح في الجزء السفلي من كل من الآبار. تراكب لوحة مع قطعة 4 "× 7" parafilm.
- استخدام كائن مستطيل كبير، مثل مربع طرف micropipettor، وفرك parafilm على الآبار لخرم في parafilm في الفتحات جيدا وإنشاء ختم على ما تبقى من لوحة. إزالة دوائر مثقوبة من parafilm تغطي الآن الآبار. الآن يجب أن تكون مشمولة لوحة بإحكام مع parafilm في جميع المجالات باستثناء البئر سpenings.
- 10 دقيقة قبل نهاية الحضانة، إضافة 200 ميكرولتر من 3 N هيدروكسيد الصوديوم إلى كل بئر من مرشح ورقة لوحة، والتأكد تمتص ورقة الترشيح كل من السائل.
- اختياريا قبل التجميد، ونقل على المديين المتوسط و24 لوحة جيدا جديدة. بعد غسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ليز الخلايا المتبقية في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك وحساب محتوى البروتين BCA الفحص.
- في نهاية الحضانة، والأداة الإضافية تجميد لوحة فحص في النيتروجين السائل. كن حذرا لضمان كل بئر يتم تجميد تماما قبل المتابعة.
- إضافة 100 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 70٪ على كل بئر من لوحة الفحص. تغطية مباشرة مع لوحة فلتر ورقة. وضع لوحات على شاكر المداري والصخور في السرعة المدارية من 80 دورة في الدقيقة في RT لمدة 2 ساعة.
- بعد الحضانة، ومعالجة العينات:
- لقياس نسبة CO 2، ونقل الساحات ورق الترشيح إلى 4 مل السائل السائل التلألؤ في التلألؤالقارورة وقياس 14 C الإشارة.
- لقياس المواد القابلة للذوبان الحمضية، ونقل 400 ميكرولتر من المتوسطة إلى أنبوب 1.5 مل microfuge. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة. إضافة 100 ميكرولتر من طاف الناتجة إلى 500 ميكرولتر من 2: 1 الكلوروفورم، الميثانول (ت / ت)، ودوامة لفترة وجيزة.
- إضافة 250 ميكرولتر من الماء إلى الخليط، ودوامة مرة أخرى. عينات الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3000 ز س. نقل 200 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى 4 مل السائل السائل التلألؤ في قارورة التلألؤ وقياس 14 C الإشارة.
4. تكون الدهون الفحص
- المساء قبل بداية الاختبار، وغسل الخلايا 2 مرات مع PBS الدافئ. تغيير خلايا الكبد لمصل تجويع المتوسطة مع 100 نيوتن متر الأنسولين. احتضان ليلا 37 درجة مئوية.
ملاحظة: نظرا لأن المصل البقري الجنين يحتوي على تركيز غير معروف من هرمونات التمثيل الغذائي (مثل الانسولين، والجلوكاجون)، مصل تجويع الخلايا لإزالة أي آثار الخلط قد تترتب على هذا الفحص. خلايا قابلة للبقاء في المصل تجويع المتوسطة ل> 24 ساعة. ويستخدم الأنسولين في هذا الاختبار لتحفيز تكون الدهون. - جعل تكون الدهون المتوسطة: مصل تجويع المتوسطة مع 100 نيوتن متر الأنسولين، 10 ميكرومتر خلات الباردة و 0.5 μCi 3 H-خلات لكل بئر. تغيير الخلايا لتكون الدهون المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تتضمن أي مركبات من الاهتمام لفحصها.
- بعد فترة الحضانة، وغسل الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني. الخلايا ليز عن طريق كشط في 120 ميكرولتر من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. الاحتياطي 10 ميكرولتر لفحص البروتين (تقييم من قبل BCA مقايسة)، ونقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مل microfuge.
- الدهون استخراج بإضافة 500 ميكرولتر من 2: 1 كلوروفورم الميثانول (ت / ت). دوامة لفترة وجيزة واحتضان في RT لمدة 5 دقائق. إضافة 250 ميكرولتر من المياه، دوامة واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق إضافية. الطرد المركزي عينات مدة 10 دقيقة في 3000 x ج، RT. بعنايةنقل المرحلة الدنيا إلى 4 مل السائل السائل التلألؤ في قارورة التلألؤ وقياس 3 H النشاط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العزلة الكبدية عادة يؤدي إلى 1-3 × 10 7 مجموع الخلايا. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، فإن الخلايا تظهر سداسية، وكثير منها سيتم binucleated (الشكل 2). يجب أن تكون الخلايا السليمة يخلو من التحبيب أو الفقاعات، والتي تدل على موت الخلايا.
بشكل عام، يتم تشغيل أكسدة الأحماض الدهنية فحص في 03:57 مكررات لكل اختبار المجمع. التهم لعينات CO 2 ما يقرب من خمس واحدة من تلك المستمدة من المواد القابلة للذوبان الحمضية. نحن عادة تحسب نسبة CO 2 إلى مواد قابلة للذوبان حمض كمقياس للأكسدة كاملة (أي كمية المؤكسد عبر دورة حمض الستريك). والمواد التي تعزز التنفس الخلوي، مثل الكربونيل السيانيد-4- (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP) تحول هذه النسبة نحو CO 2، مما يدل على مزيد من الأكسدة عن طريق دورة TCA. سوف مثبطات السلسلة التنفسية يقلل الأكسدة على وجه العموم(الشكل 3). عندما تجريب هذا الاختبار، فمن الأفضل لتشمل مراقبة أي خلية للتحقق من إجراءات تنتج نشاط الخلايا المحددة.
وتكون الدهون الفحص غالبا ما يتم مقارنة مع السيطرة صفر timepoint (خلايا تعامل مع الركيزة مباشرة قبل الحصاد). يجب خطية الفحص مقابل الوقت من خلال أربع ساعات على الأقل من الحضانة. والمركبات التي تعزز أكسدة الأحماض الدهنية، مثل FCCP، أو يقلل من ATP التوليف، مثل أوليغوميسين، والحد من النشاط شحمي المنشأ (الشكل 4).
الشكل 1: إعداد لوحة تصفية إعداد لوحة تصفية كما هو موضح في الخطوة 3.6، وإزالة الغطاء من معقمة 24 لوحة جيدا. وضع 2 سم × 2 سم قطعة من ورق الترشيح في قاعدة كل بئر. تراكب وحة كاملة مع 7 "س 4" قطعة من الفقرةفيلم، وفرك لوحة لاغلاق محكم الجزء العلوي من الآبار. هذا وسوف تولد دوائر مثقوبة من parafilm خلال فتحات الآبار، التي ينبغي إزالتها. بعد إضافة حمض البيركلوريك في الخطوة 3.9، ووضع لوحة فلتر ورقة بإحكام على الفحص لوحة لانتاج الختم.
الشكل 2: خلايا الكبد الأولية في الثقافة الطوري الصور من خلايا الكبد الماوس الأساسي صحية وغير صحية 16 ساعة بعد الطلاء في الكولاجين المغلفة 24 لوحات جيدة. شريط النطاق، 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: الأحماض الدهنية الأكسدة التي كتبها الابتدائية ماوس خلايا الكبد في الثقافة 14 C-بالميتات الأكسدة إلى (A) CO 2، المواد القابلة للذوبان (B) وحامض، و(C) نسبة CO 2 إلى مواد قابلة للذوبان حمض من خلايا الكبد الأولية حضنت مع السيارة، FCCP، أو أوليغوميسين. البيانات يعني ± SEM. * P <0.05، ** p <0.01 مقابل السيارة التي كتبها t-اختبار وحيد الطرف الطالب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: تكون الدهون في خلايا الكبد مثقف الابتدائي ماوس (A) النشاط اكتناز الشحم مقابل الوقت في خلايا الكبد الأولية تعامل مع 3 H-خلات و (B) النشاط شحمي المنشأ في وجود مركبة، أوليغوميسين، أو FCCP. البيانات يعني ± SEM. *** P <0.001 مقابل السيارة التي كتبها وحيد الطرف الطالب اختبار t ل.
| الجدول 1 | |||
| الثقافة وسائل الإعلام | |||
| الطلاء المتوسطة | |||
| DMEM | 500 مل | ||
| FBS | 10٪ | ||
| البيروفات الصوديوم | 2 مم | ||
| القلم / بكتيريا | 2٪ | ||
| ديكساميثازون | 1 ميكرومتر | ||
| الأنسولين | 0.1 ميكرومتر | ||
| صيانة المتوسطة | |||
| DMEM | 500 مل | BSA الكسر V | 0.2٪ |
| البيروفات الصوديوم | 2 مم | ||
| القلم / بكتيريا | 2٪ | ||
| ديكساميثازون | 0.1 ميكرومتر | ||
| الأنسولين | 1 نانومتر | ||
| المجاعة المتوسطة | |||
| DMEM | 500 مل | ||
| BSA الكسر V | 0.2٪ | ||
| البيروفات الصوديوم | 2 مم | ||
| القلم / بكتيريا | 2٪ | ||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الوقت من التضحية لنضح ينبغي أن يكون أقل من 3 دقائق للنضح المثالي وكولاجيناز هضم الكبد. مرة واحدة يبدأ نضح مع الإرواء المتوسطة، ينبغي أن الكبد على الفور تغيير مظهر لمن اللون الأحمر إلى شاحب. بعد حوالي 10 دقيقة من الحضانة مع LDM، فإن الكبد تظهر منتفخة والوردي. في حال أن نضح غير كاف، والكبد قد لا تظهر هذه التغييرات، وهذا سوف يؤدي عادة إلى انخفاض العائد الكبدية.
باتباع الخطوات الغسيل، وخلايا الكبد معزولة يمكن تخزينها لعدة ساعات في تعليق على الجليد قبل الطلاء. مرة واحدة مطلي، خلايا الكبد مثقف تتطلب عدة ساعات إلى التمسك بها وانتشرت. بعد 2 ساعة من الحضانة في تصفيح المتوسطة، فإن خلايا الكبد لا تزال صغيرة ومستديرة. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وخلايا الكبد تأخذ على مظهر أكثر سداسية مميزة، وكثير منها سيتم binucleated. إذا كان إعداد غير صحي، وجوملتعلمي اللغة اإلنكليزية يحمل العديد من التحبيب وblebbing بين الحين والآخر، مما يدل على موت الخلايا. من أجل الحفاظ على أفضل قابلية الثقافة والإعلام يجب تغيير كل 24 ساعة، مع توخي الحذر للحد من التعرض لفتح الهواء.
بالميتات الصوديوم هي غير قابلة للذوبان في الماء عند RT، ومع ذلك، وبعد الحضانة عند 70 درجة مئوية فإنه يجب أن يحل تماما. والتعرض لRT تسبب الدهون ليصلب بسرعة، وبالتالي لا بد من العمل بسرعة. مرة واحدة وقد تم حل بالميتات في مرحلة ما قبل الحضانة المتوسطة، فمن الأهمية بمكان الحفاظ على المتوسط عند 37 درجة مئوية من أجل الحفاظ على ذوبان الدهون.
كما ذكر أعلاه، لضمان تحقيق نتائج دقيقة من الفحص أكسدة الأحماض الدهنية، ويجب أن يكون وسيلة المجمدة تماما في النيتروجين السائل. هذا يمنع أي محاولة للهرب من CO 2 خلال إضافة حمض البيركلوريك إلى الآبار. مباشرة بعد إضافة حمض البيركلوريك إلى العينات المجمدة، ويجب أن تكون لوحة فحص بإحكام جovered من قبل مرشح ورقة لوحة، مع التأكد من مواءمة لوحات لنقل الغاز بين الآبار. منذ يتم استيعابه ورقة الترشيح مع وجود فائض من هيدروكسيد الصوديوم، رياضيات الكيمياء من رد فعل غير قادرة على التقاط صدر CO 2 كما NaHCO 3. تجارب بعد هذا البروتوكول قد ولدت نتائج استنساخه، مع مكررات نموذجية وجود٪ CV ≤ 10. إذا لزم الأمر، المواد القابلة للذوبان حمض من الأحماض الدهنية الأكسدة فحص أو المحللة خلية من فحص تكون الدهون هي قابلة للتخزين في -80 ° C ومعالجتها في وقت لاحق دون أي تأثير ملموس على النتائج. المقايسات المذكورة أعلاه تسمح لآلية فعالة وبسيطة نسبيا الوقت لتقييم ايض الدهون في خلايا الكبد الأولية المعزولة من كبد الفأر. من خلال استخدام الثقافة خارج الحي، وهذه الأساليب تسمح باختبار آثار عدة شروط على أكسدة الأحماض الدهنية وتكون الدهون. يمكن تكييف هذا البروتوكول لتقييم دور تغيرات جينية على هذه اإلجراءاتالمؤسسات الصغيرة الحجم، ومع ذلك، وعزل خلايا الكبد هو منظم للوقت وبالتالي في الجسم الحي تحليلات قد تكون أكثر ملاءمة للتحقيق في بعض النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. إذا تحليل الاستعدادات الكبدية متعددة ضروري، تطبيع القيم فحص لمستويات البروتين يمكن أن يؤديها كما هو موضح في الخطوة اختيارية 3.7.1 وتستخدم للتطبيع. ونحن نوصي أن تقارن فحوصات أجريت في التحضيرات متعددة كما التغيرات النسبية مقابل عنصر تحكم مناسبة.
وأخيرا، فإننا لم تستكشف خيار فترات أطول الثقافة، ولكن خلايا الكبد قد يحمل خصائص التمثيل الغذائي تعادل بعد عدة أيام في الثقافة. مع تعديل طفيف، يمكن تكييفها هذا البروتوكول للسماح لعدة علاجات يوم السابقة لتقييم آثار المركبات على التمثيل الغذائي للدهون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Perfusion Medium | Life Technologies | 17701038 | |
| Liver Digest Medium | Life Technologies | 17703034 | Aliquot and store at -20 °C |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10X DPBS | Corning | 46-013-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Life Technologies | 26140079 | |
| Collagen | Life Technologies | A1048301 | |
| Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone | GE Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |
| Penicillin / Streptomycin | Cellgro | 30-001-CI | |
| Insulin | Sigma | I0516-5ML | |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | |
| Albumin (BSA), Fraction V | MP Biomedicals | 103703 | |
| 24-Well Culture Dish | Corning Falcon | 353047 | |
| Tygon S3 Tubing | Cole Parmer | 06460-34 | |
| Male Leur Lock to 200 Barb Connectors | Cole Parmer | 45518-00 | |
| 24 G x 3/4" Catheter | SurFlo | SROX2419CA | |
| Perma-Hand Silk Suture | Ethicon | 683G | |
| Cell Strainer | Corning Falcon | 08-771-2 | |
| IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath | Fisher | 13-874-3 | |
| MasterFlex C/L Peristaltic Pump | MasterFlex | HV-77122-24 | |
| Microclamp | Roboz | RS-7438 | Pre-sterilize in autoclave |
| 5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors | Roboz | RS-6810 | Pre-sterilize in autoclave |
| 24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5130 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5137 | Pre-sterilize in autoclave |
| 60 ml Syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 50 ml conical tubes | Corning Falcon | 352070 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| CO2 Incubator | |||
| Serological pipets | |||
| 1,000, 200, 20 μl pipet and tips |
References
- Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).
- Lazo, M., et al. Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994. American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).
- Angulo, P. Nonalcoholic fatty liver disease. The New England journal of medicine. 346, 1221-1231 (2002).
- Adams, L. A., et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study. Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).
- Feldstein, A. E., et al. Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).
- Day, C. P., James, O. F. Steatohepatitis: a tale of two 'hits'. Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).
- Donnelly, K. L., et al. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).
- Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).
- Parks, E. J., Hellerstein, M. K. Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques. Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).
- Befroy, D. E., et al. Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy. Nature medicine. 20, 98-102 (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malaria journal. 6, 169 (2007).
