Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

المهندسة أوعية دموية العضلات رفرف

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

كثيرا ما تنشأ عيوب جدار البطن بعد الصدمة شديدة، علاج السرطان، والحروق وإزالة شبكة المصابة. هذه العيوب غالبا ما تنطوي على فقدان الأنسجة الهامة، والتي تتطلب عمليات جراحية معقدة وتمثل تحديا كبيرا للجراحين إعادة الإعمار البلاستيك 1-4. الباحثين هندسة الأنسجة البحث عن مصادر جديدة للأنسجة اصطناعية واستكشفت مواد مختلفة، ومصادر الخلايا وعوامل النمو. وقد ذكرت سابقا ترميم ناجحة من الأنسجة المختلفة، مثل 5،6 القصبة الهوائية، المثانة 7، 8 القرنية والعظام والجلد 9 10، عن طريق زرع الأنسجة المهندسة. ومع ذلك، تصنيع الأنسجة أوعية دموية سميكة هندسيا، وخاصة لإعادة الإعمار من عيوب كبيرة، لا يزال يشكل تحديا كبيرا في هندسة الأنسجة.

واحدة من العوامل الرئيسية التي تحد من سمك بناء أنسجة قابلة للحياة هو السيطرة على امدادات الاوكسجين الى سلبيات لهاخلايا tituent. عند الاعتماد على نشرها، بناء سمك يقتصر على أن من طبقة رقيقة جدا. المسافة القصوى بين الأكسجين والشعيرات الدموية-توريد المغذيات في الجسم الحي حوالي 200 ميكرون، الذي يرتبط مع الحد نشر الأكسجين 11،12. الأوعية الدموية غير كافية يمكن أن يؤدي إلى نقص تروية الأنسجة وتتصاعد لارتشاف الأنسجة أو نخر 13.

وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون المادة المثالية تستخدم لإعادة بناء الأنسجة حيويا وغير مناعة. كما يجب أن تكون قادرة على تعزيز مزيد من التكامل من الخلايا المضيفة مع مادة بيولوجية، والحفاظ على السلامة الهيكلية. تم مختلف البيولوجية 14-16 والاصطناعية 1،17،18 المصفوفات استكشاف سابقا لإعادة الإعمار الأنسجة، ولكن استخدامها لا يزال محدودا بسبب عدم وصول الدم فعالة، والتهابات أو عدم كفاية قوة الأنسجة.

في هذه الدراسة، وحيويا، خلية الإدارة الانتخابيةكان مزروع سقالة edded تتألف من إدارة الغذاء والدواء (FDA) بولي وافق عليها-L حمض اللاكتيك (PLLA) / بولي حامض اللبنيك في-CO-الجليكوليك (PLGA)، وحول الشريان الفخذي والوريد (AV) سفن ماوس عارية و فصلها عن الأنسجة المحيطة بها، وضمان الأوعية الدموية من أوعية AV فقط. ، وكان الكسب غير المشروع أسبوع واحد بعد زرع قابل للحياة، سميكة وأوعية دموية بشكل جيد. هذا النسيج أوعية دموية سميكة مع السفن AV، ثم تم نقلها كما رفرف pedicled إلى البطن عيب كامل سمك في نفس الماوس. كان رفرف أسبوع واحد بعد نقل قابل للحياة، أوعية دموية ودمجها بشكل جيد مع الأنسجة المحيطة بها، مع ما يكفي من القوة لدعم أحشاء البطن. وهكذا، فإن سميكة، ورفرف الأنسجة أوعية دموية هندسيا، واضعة في عنيق ذاتي، ويقدم طريقة جديدة لإصلاح عيوب جدار البطن كامل سماكة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية من لجنة أخلاقيات للتجارب على الحيوانات في التخنيون. لهذا الإجراء، استخدمت الفئران عارية athymic لتفادي الرفض المناعي. في حالة استخدام نوع آخر من الماوس، يجب حلق الفئران قبل إجراء العمليات الجراحية وإدارة السيكلوسبورين (أو آخر بديلا المضادة للرفض) ويوصى.

1. سقالة إعداد وخلية تضمين

  1. إعداد السقالات تتألف من 1: 1 خليط من بولي-L-اللبنيك حمض (PLLA) وpolylactic-CO-الجليكوليك، حمض (PLGA)، على النحو التالي:
    1. حل 500 ملغ من PLLA و 500 ملغ من PLGA في 10 مل الكلوروفورم.
    2. إضافة 0.24 مل من محلول البوليمر إلى 0.4 غرام من كلوريد الصوديوم الجسيمات تجمعوا في قوالب تفلون. استخدام قطره الملح من 212-600 ميكرون. السماح للكلوروفورم لتتبخر O / N.
    3. يتش الملح خارج باستخدام الماء المقطر مما يؤدي إلى مترابطة السقالات 3D التي يسهل اختراقها.
    4. قطع قطعة البوليمرباستخدام مقص، ثم نقع في الايثانول 70٪ (ت / ت) لمدة 30 دقيقة ويغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة قبل الاستخدام.
  2. إعداد ثقافة الثلاثية من الخلايا التالية في 1: 1 البطانية المتوسطة الخلية (EGM-2 تستكمل مع مكونات لها عدة رصاصة والمتوسطة الخلايا العضلية (الحد الأدنى من المتوسط ​​Dulbecco وضروري (DMEM)، على أن تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS )، و 2.5٪ HEPES العازلة، 100 U / مل البنسلين، و 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين (القلم بكتيريا الحل).
    1. استخدام 0.5 × 10 6 C2C12 myoblasts، 0.9 × 10 6 خلايا الإنسان الوريد السري البطانية (HUVECs)، و 0.2 × 10 6 عادي الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (NHDF).
  3. مزيج من الخلايا معا في أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 4 دقائق، ونضح على المدى المتوسط ​​وإعادة تعليق بيليه في خليط من 4 ميكرولتر الجليد الباردة حل المصفوفة خارج الخلية و 4 ميكرولتر المتوسطة الخلية.
  4. قطع قطعة من 10 ملم × 7 ملم × 1 ملم (طول × عرض × سماكة) PLLA / PLGسقالة والبذور تعليق خلية في لوحة 6 جيدا، تسمح للحل المصفوفة خارج الخلية ليصلب (30 دقيقة، 37 ° C، 5٪ CO 2) قبل أن يضيف 4 مل المتوسطة الخلية.
  5. احتضان السقالات لمدة عشرة أيام قبل زرع واستبدال المتوسط ​​كل يوم.

2. قبل بدء العملية الجراحية

  1. إعداد وتعقيم (الأوتوكلاف) الأدوات الجراحية التالية:، ودفع غرامة، مقص صغير على التوالي، مقص الربيع، على التوالي، ملقط غرامة ذات الرؤوس، ملقط مسنن وحامل الإبرة.
  2. إعداد خليط من الكيتامين: حل زيلازين في أنبوب microcentrifuge عن طريق خلط 425 ميكرولتر الكيتامين و 75 زيلازين ميكرولتر في حقنة 1 مل.
  3. تمييع 0،3 ملغ / مل البوبرينورفين في ملحي معقم (01:20).

3. رفرف البناء (الكسب غير المشروع غرس)

  1. باستخدام حقنة الأنسولين، تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين: زيلازين (35 ميكرولتر في20 غرام من وزن الجسم).
  2. تحت الجلد حقن البوبرينورفين (تركيز النهائي من 0،05-،1 ملغم / كغم) قبل opperation.
  3. ضع الماوس على مرحلة ساخنة إلى 37 درجة مئوية، لضمان درجة حرارة الجسم الطبيعية، ومن ثم تأمين الماوس باستخدام ضمادة لاصقة.
  4. نصائح باستخدام القطن، إدارة التشحيم مرهم العين لعيون الماوس، (لتجنب الجفاف).
  5. نصائح باستخدام القطن، نظيفة موقع شق مع اليود ثم مع الايثانول 70٪، لإنشاء مجال العمل العقيم.
  6. باستخدام مقص صغير وملقط، وجعل شق طريق الجلد، من مستوى الركبة في الرباط الإربي، موازية للسفن الفخذ، حتى يتعرض (AV) سفن شريان الفخذ والوريد.
  7. عقد الجلد أسفل باستخدام ضام، للحصول على أفضل الوصول إلى الأنسجة.
  8. باستخدام مقص الربيع وملقط، عزل بعناية الشريان والوريد الفخذي السفن من الأنسجة المحيطة بها. نبدأ من مستوى دوري الدرجة الإربيأهبل إلى التشعب في الأوعية شرسوفية متفوقة. مغادرة العميقة دون أن تمس، من أجل الحفاظ على تدفق الدم في الساق ومنع نقص التروية لاحق.
  9. أضعاف الكسب غير المشروع (من القسم 1) حول AV الفخذ المكشوفة، وتحت العميقة وفوق التشعب إلى عظام الساق وAV proneal، والانضمام إلى أهدافها باستخدام خيوط الحرير 8-0.
  10. لضمان الأوعية الدموية زرع عن طريق الشعيرات الدموية التي نبتت من أوعية AV الفخذ فقط، والتفاف قطعة من المطاط تعقيم حول الكسب غير المشروع، وخياطة مع 6-0 الغرز.
  11. إغلاق الجلد المغطي باستخدام خيوط الحرير 4-0.
  12. مراقبة الماوس عن كثب حتى الشفاء من التخدير وبعد ذلك كل يوم، حتى يتم نقل الكسب غير المشروع كما رفرف. تحت الجلد حقن البوبرينورفين (تركيز النهائي من 0،05-،1 ملغ / كلغ) مرتين يوميا لمدة 2-3 أيام.
    ملاحظة: استخدام المياه المالحة في أي مرحلة، لتجنب جفاف الأنسجة المكشوفة.

4. التحويل رفرف

  1. في واحدة أوأسبوعين postimplantation، تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين: زيلازين (35 ميكرولتر / 20 غرام)، وذلك باستخدام حقنة الأنسولين.
  2. تحت الجلد حقن البوبرينورفين (تركيز النهائي من 0،05-،1 ملغم / كغم) قبل opperation.
  3. ضع الماوس على مرحلة ساخنة إلى 37 درجة مئوية، لضمان درجة حرارة الجسم الطبيعية، ومن ثم تأمين الماوس باستخدام ضمادة لاصقة.
  4. نصائح باستخدام القطن، وتطبيق التشحيم مرهم العين لعيون الماوس، (لتجنب الجفاف).
  5. نصائح باستخدام القطن، وتنظيف موقع شق (من منطقة الركبة في البطن) مع اليود ثم مع الايثانول 70٪، لإنشاء مجال العمل العقيم.
  6. باستخدام مقص وملقط، فتح بعناية الغرز في الجلد، وباستخدام مقص، وجعل شق طريق موازية الجلد إلى الرباط الإربي، والاستمرار من خلال الجلد البطني.
  7. إزالة بعناية قطعة المطاط مع ملقط وفضح رفرف أوعية دموية.
  8. باستخدام scissالأملاح والملقط، تشريح رفرف نسيج من الأنسجة المحيطة بها.
  9. باستخدام ملقط وحامل إبرة، ligate نهاية البعيدة للAV الفخذ مع خيوط الحرير 8-0 لمنع النزيف من AV. ثم، يكوي AV على مستوى الركبة، وبشكل أقصى للأنسجة المزروعة مطوية والغرز 8-0.
  10. بلطف نقل AV الفخذ يلفها من الكسب غير المشروع، نحو جدار البطن بطني، وتجنب الأضرار التي لحقت الشريان، لتحديد المسافة التي ينبغي الخلل سمك الكامل.
    تنبيه: سوف سحب الشريان بعيدا جدا تلف الشريان.
  11. باستخدام مقص غرامة، وجعل شق في جدار البطن بطني.
  12. باستخدام مقص الربيع، وجعل شق في العضلات عضلة البطن المستقيمة. إزالة شريحة حوالي 1 سم × 0.8 سم من عضلة البطن المستقيمة العضلات مع الجلد المغطي.
  13. نقل AV الفخذ، يلفها من الكسب غير المشروع أوعية دموية، باعتبارها رفرف المحوري، إلى خلل كامل سماكة في abdom بطنيجدار إينال.
  14. خياطة رفرف إلى الأنسجة العضلية المحيطة، وذلك باستخدام خيوط الحرير 8-0، لمنع فتق.
  15. لتجنب خياطة الأعضاء الداخلية، ورفع العضلات مع ملقط عندما خياطة رفرف لعضلات البطن. ترك الجلد البطني تتعرض لمحاكاة تأثير عيب جدار البطن الكامل.
  16. تغطية الجرح في الجلد مع الشاش معالجتها باليود وضمادة معقمة لمنع التلوث من المنطقة المكشوفة.
  17. خياطة الجلد في الساق باستخدام خيوط الحرير 4-0.
  18. مراقبة الماوس عن كثب حتى الشفاء من التخدير وبعد ذلك كل يوم، حتى استرجاع رفرف. تحت الجلد حقن البوبرينورفين (تركيز النهائي من 0،05-،1 ملغ / كلغ) مرتين يوميا لمدة 2-3 أيام.
  19. ملاحظة: استخدام المياه المالحة في أي مرحلة لتجنب جفاف الأنسجة المكشوفة.

5. الموجات فوق الصوتية تحديد الأوعية الدموية الإرواء من الكسب غير المشروع

ملاحظة: قبل نقل، نضح الأوعية الدموية سو يتم قياس الكسب غير المشروع في أسبوع وأسبوعين بعد الزرع، من خلال الموجات فوق الصوتية.

  1. تخدير الماوس باستخدام 2٪ الأيزوفلورين.
  2. ضع الماوس على مرحلة المنقولة تسخينها إلى 38 درجة مئوية، لضمان درجة حرارة الجسم الطبيعية، ومن ثم تأمين الماوس باستخدام ضمادة لاصقة.
  3. العثور على الشريان والوريد الأوعية الفخذ مع محول غير الخطية تعيين على B-الوضع.
  4. دراسة المباح للسفن الفخذ من الكسب غير المشروع باستخدام محول تعيين على وضع اللون دوبلر.
  5. إعداد وكيل غير المستهدفة المقابل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  6. توصيل قسطرة الوريد الذيل (12 سم أنابيب بإبرة 27 G) إلى حقنة 1 مل مليئة المالحة. تأمين حقنة المقبلة على الماوس على مرحلة التسخين (لتجنب حركة الحقنة).
  7. ربط القسطرة على الماوس الوريد الذيل وتأمين إبرة.
  8. ضخ بعض المياه المالحة على حد سواء ضمان أن تبذل الحقن في الوريد وملءأنابيب بمحلول ملحي (لتجنب فقاعات الهواء).
  9. ملء حقنة 1 مل مع 70 ميكرولتر من عامل تباين واستبدال حقنة المالحة مع حقنة وكيل التباين.
  10. إعداد الموجات فوق الصوتية لحقن صورة من وكيل التباين. في خصائص وضع غير الخطية إعداد عدد من الإطارات إلى 1500 ونبض تعطل 30٪ من الإطارات.
    ملاحظة: بعد نبض اضطراب، وmicrobubbles إعادة ملء السفن بمعدل ذلك يعتمد على معدل تدفق microbubbles في الشعيرات الدموية ومستقلة عن معدل حقن microbubbles. يمكن تغيير عدد من إطارات وفقا للوقت ملء 19،20.
  11. حقن ببطء عامل تباين في الوريد الذيل.
  12. التقاط الصور في وضع التباين غير الخطي للنظام الموجات فوق الصوتية عالية الدقة.
  13. تحليل النتائج باستخدام البرنامج، كما هو موضح سابقا 19،20.
    1. رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) على الصورة التي تم الحصول عليها ايمبتوسط بعد نبض اضطراب في المقابل وضع. العائد على الاستثمار يجب أن يحدد المنطقة شغل من قبل وكيل النقيض فقط.
    2. حساب تعزيز الذروة (PE)، وهي نسبة كثافة يعني إشارة غير الخطية بعد حقن microbubbles مقابل بعد نبض اضطراب، وهو مقياس لحجم الارواء.
    3. حساب معدل التدفق، والتي يتم تحديدها من الزمن (T) المنقضية حتى إشارة الذروة (P).

6. تحديد مدى الكسب غير المشروع الأوعية الدموية

ملاحظة: يتم تحديد مدى الكسب غير المشروع أنسجة الأوعية الدموية بعد أسبوع أو أسبوعين الزرع.

  1. باستخدام حقنة الأنسولين، تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين: زيلازين (35 ميكرولتر / 20 ز).
  2. باستخدام حقنة 1 مل، حقن في الوريد 200 ميكرولتر من 10 ملغ / مل فلوريسئين-ثيوسيانات مترافق ديكستران (FITC-ديكستران، MW = 500،000) في الوريد الذيل. </ لى>
  3. عشرة ثانية بعد الانتهاء من الحقن، والموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
  4. فتح الساق من الفأرة وفضح الفساد.
  5. غسل المنطقة الكسب غير المشروع مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتطبيق 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة.
  6. صورة الكسب غير المشروع في ساقه الماوس، وذلك باستخدام المجهر متحد البؤر.
  7. قياس كثافة السفينة وظيفية (FVD).
    1. عزل قناة الخضراء (الإثارة = 488 نانومتر) من الصور المجهرية مبائر.
    2. تمرير الصور الناتجة من خلال مرشح تمريرة عالية، من أجل التأكيد على هياكل عالية التباين.
    3. استخدام عامل تصفية despeckling لإزالة الضوضاء التي قد تم تضخيمها من قبل مرشح تمريرة عالية.
    4. إعداد قيمة عتبة على الصورة الناتجة عن ذلك؛ يتم تعديل قيمة العتبة بحيث الميزات والهياكل في الصورة الأصلية واضحة في الصورة الثنائية.
    5. تطبيق عتبة حجم ذلك أن الجماعات الوحيدة من بكسل متصلة أكبر من حجمها المعرفةلا تزال عتبة الإلكترونية في الصورة الثنائية.
    6. الخطوط العريضة لهيكل عظمي من السفن في الكسب غير المشروع باستخدام خوارزمية تشانغ-سوين البالغ عددهم 21.
    7. حساب FVD بجمع أطوال خط الوسط من كل سفينة وقسمة الناتج على منطقة ROI.

7. Immunohistological والنسيجية تلطيخ من الكسب غير المشروع

  1. تلطيخ Immunohistological
    1. بعد التصوير متحد البؤر، استرداد الكسب غير المشروع باستخدام مقص صغير وملقط. تشريح الأوعية AV في طرفي الكسب غير المشروع واسترداد الكسب غير المشروع.
    2. إصلاح الطعوم في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لمدة 30 دقيقة - 2 ساعة.
    3. وضع الطعوم في أشرطة الأنسجة وتخزينها في الايثانول 70٪ حتى البارافين التضمين.
    4. تضمينها في البارافين باستخدام التثبيت القياسية وتضمينها بروتوكول 22 و شريحة البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة إلى 5 ميكرون شرائح باستخدام مشراح. شريحة النسيج كله عموديا على AVأوعية.
    5. Deparaffinize الأقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين عن طريق الغمر في 100٪ الزيلين مرتين، لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    6. ترتيب الشرائح في 250 مل Coplin جرة بلاستيكية.
    7. ترطيب بواسطة الغمر التسلسلية في خفض تركيزات الإيثانول (100٪، 96٪، 90٪، 80٪، 70٪، 50٪، 30٪ والماء المقطر مزدوجة (أحواض دبي الجافة العالمية)) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
    8. إعداد مستضد حل إماطة اللثام عن طريق تمييع 2.35 مل من مستضد حل إماطة اللثام مع 250 مل من أحواض دبي الجافة العالمية. تسخين حل مستضد فضح لمدة 2 دقيقة في الميكروويف لتعيين 95 ° C.
    9. إدراج الشرائح في مرحلة ما قبل ساخنة حل مستضد فضح والحرارة مرة أخرى لمدة 3 دقائق في الميكروويف لتعيين 95 ° C. تبريد الشرائح إلى 50 درجة مئوية.
    10. تسخين مرة أخرى لمدة 2 دقيقة ثم بارد لRT.
    11. احتضان الشرائح في 3.3٪ H 2 O 2 حل في الميثانول لمدة 10 دقيقة، في RT لإرواء نشاط البيروكسيديز الذاتية ثم شطف مرتين في برنامج تلفزيوني.
    12. إعداد غرفة الحضانة: مكان abso الرطبأوراق rbent داخل مربع الأنسجة وتجفيف الشرائح باستخدام ممسحات مهمة حساسة.
    13. دائرة مساحة الشريحة على الشريحة باستخدام قلم مسعور واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT، مع ما يقرب من 50 ميكرولتر من مصل الماعز عرقلة الحل (2٪، أعدت في PBS) لكل شريحة.
    14. تمييع أرنب مكافحة CD31 الضد 01:50 في عرقلة الحل، وتطبيق ما يقرب من 50 ميكرولتر الأجسام المضادة لكل شريحة واحتضان O / N، في 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات مع PBS، 5 دقائق لكل منهما.
    15. تمييع المعقدة البيروكسيديز الماعز المضادة للأرنب الضد الثانوية 1: 400 في برنامج تلفزيوني، على مدى ما يقرب من الشرائح 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة لكل شريحة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    16. شطف 3 مرات مع PBS، 5 دقائق لكل منهما.
    17. تمييع-streptavidin البيروكسيد 1: 400 في برنامج تلفزيوني، وتطبيق ما يقرب من 50 ميكرولتر لكل شريحة واحتضان مع الشرائح لمدة 30 دقيقة، في RT. شطف 3 مرات مع PBS، 5 دقائق لكل منهما.
    18. تطبيق ما يقرب من 50 ميكرولتر من aminoethylcarbazole (AEC) الركيزة لكل شريحة، وفقا لالصانع & #8217؛ ق التعليمات. تراجع الشرائح في أحواض دبي الجافة العالمية لوقف التفاعل.
    19. وصمة عار على نوى في الزرقاء عن طريق غمر المقاطع في ما يقرب من 50 ميكرولتر من حل الهيماتوكسيلين ماير لمدة 2 دقيقة. شطف بلطف في الماء ثم تغطية الفروع مع تصاعد المتوسط.
    20. تحديد-CD31 إيجابي تلطيخ باستخدام نهج مزدوجة التعمية. يبدو CD31 تلطيخ بمثابة وصمة عار البني. اختيار 4-5 مجالات مختلفة في مجال رؤية التكبير 40X تحت المجهر مجهر. حساب عدد شمعة-CD31 إيجابي.
      1. حساب متوسط ​​عدد شمعة-CD31 إيجابي في سقالة بقسمة العدد الكلي للشمعة تحصى مع عدد الحقول وfieldarea (وفقا لبيانات مجهر).
        ملاحظة: يجب أن يكون حجم كاشف تطبيقها كافية لتغطية شريحة المبينة بأكملها.
  2. تلطيخ النسيجي
    1. إصلاح الطعوم في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة.
    2. الطعوم تضمينها في البارافين باستخدام معيارتثبيت والإجراءات التضمين.
    3. إزالة البارافين من المقاطع جزءا لا يتجزأ من البارافين عن طريق الغمر في 100٪ الزيلين مرتين لمدة 10 دقيقة.
    4. غسل سريع مرتين لمعالجة الجفاف في 100٪ الأيزوبروبانول.
    5. غسل سريع مرتين 95٪ من الإيثانول.
    6. يغسل ثلاث مرات فى ماء الصنبور.
    7. تزج في الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقيقة.
    8. يغسل ثلاث مرات فى ماء الصنبور.
    9. Immere في يوزين لمدة 2 دقيقة.
    10. غسل سريع يذوى في 95٪ من الإيثانول مرتين.
    11. سريع غسل 100٪ الأيزوبروبانول مرتين.
    12. سريع غسل 100٪ الزيلين مرتين.
    13. مع تغطية DPX الغراء مع غطاء زجاجي 1.5 مم.
    14. الصورة باستخدام المجهر في 40X التكبير.

8. تقييم الخواص الميكانيكية

  1. استرداد الكسب غير المشروع باستخدام مقص صغير وملقط.
  2. شطف الكسب غير المشروع في برنامج تلفزيوني.
  3. قياس عرض وسمك من الكسب غير المشروع وحساب مساحة المقطع العرضي كما عرض الفتحة مضروبا سمك.
  4. لناالبريد اختبار أداة لتوليد منحنى الإجهاد والانفعال الطعوم المائية.
    1. جبل الكسب غير المشروع بين نظام السيطرة الشد وقياس الطول النهائي بين قبضة اثنين (أي طول الأولي).
    2. تطبيق معدل سلالة من 0.01 ملم / ثانية، حتى الفشل.
    3. تسجيل القوة المتقدمة والتشريد باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
    4. إنشاء منحنى الإجهاد والانفعال في Matlab.
      1. حساب سلالة وفقا للنزوح مقسوما على طول الأولي. يتم احتساب الإجهاد كقوة قياس مقسوما على مساحة المقطع العرضي.
      2. تحديد صلابة كما المنحدر من هذه المنطقة الخطية في منحنى الإجهاد والانفعال وأقصى نقطة من المنحنى هو في نهاية المطاف قوة الشد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الكسب غير المشروع الأوعية الدموية ونضح في الجسم الحي

تم زرع الطعوم واحد أو أسبوعين قبل نقلهم كما اللوحات المحورية. في أسبوع وأسبوعين بعد الزرع، والمراقبة الجسيمة لمنطقة الكسب غير المشروع كشفت ترقيع الأنسجة القابلة للحياة وأوعية دموية. هذه الطعوم ثبت أن أوعية دموية للغاية، على النحو الذي يحدده المناعية CD31 إيجابي (الشكل 1A)، وperfused للغاية، كما يتضح من القياسات حقن الوريد الذيل والموجات فوق الصوتية FITC-ديكستران. وقد لوحظت العديد من السفن بالفعل في أسبوع واحد بعد الزرع، وهو الرقم الذي ارتفع بشكل ملحوظ بعد أسبوع إضافي في محيط الأوعية AV. أظهر تقرير ديكستران المستندة FITC لكثافة السفينة وظيفية (FVD) (الشكل 1B) أن الكسب غير المشروع وأوعية دموية للغاية في أسبوع واحد postimplantation والتي لم تتخذ أي تغييرات هامة في أسبوع إضافي في الجسم الحي. وقد أثبتت المباح السفينة ونضحبواسطة التصوير بالموجات فوق الصوتية (كان FVD 5.71 مم - 1 ± 0.51 ملم - 1 و 10.28 مم - 1 ± 2.71 ملم - 1، أسبوع وأسبوعين بعد الزرع، على التوالي) أكد الشكل 1C المضيف الفخذ المباح السفينة وسلامة بعد الكسب غير المشروع الزرع. . وعلاوة على ذلك، كشف الفحص بالأشعة فوق الصوتية نضح داخل منطقة الكسب غير المشروع، والذي كان أعلى قليلا أسبوعين بعد الزرع بالمقارنة مع أسبوع واحد بعد زرع (1D الشكل).

خصائص رفرف

الفحص الإجمالي من اللوحات أسبوع واحد بعد نقل-كشف أنسجة قابلة للحياة، أوعية دموية ومتكاملة بشكل جيد. خضعت اللوحات الالتزام الراسخ محيطهم. عند مقارنة، اللوحات جزءا لا يتجزأ من الخلية قبل أوعية دموية للسيطرة على اخلوي، الطعوم nonvascularized، أظهر السابق الخصائص الميكانيكية الفائقة، كما يتضح من زيادة صلابة وقوة (

الشكل 1
الشكل 1. الكسب غير المشروع الأوعية الدموية. (A) كثافة السفن CD31 إيجابي، قاس في أسبوع وأسبوعين postimplantation مقارنة بالمجموعة الضابطة. كل القيم هي طبيعية إلى منطقة الكسب غير المشروع (مم 2). * = T-اختبار ف <0.05. (B) وظيفية كثافة الأوعية الدموية (FVD) في أسبوع وأسبوعين postimplantation. لم يلاحظ أي اختلاف كبير، ص = 0.08 (T-اختبار). (C) سفن براءات AV كما تصويرها باستخدام الموجات فوق الصوتية في وضع لون دوبلر. الأزرق وتمثيلا الحمراءر تدفق الدم في الكسب غير المشروع. ويبين رباعي الأصفر منطقة الكسب غير المشروع. (D) الكسب غير المشروع نضح في واحد وأسبوعين postimplantation. (E و F) H & E تلطيخ من اللوحات المتكاملة مع الأنسجة المضيف: نقطة السهم الأسود الشريان قابلة للحياة. السهام البيضاء تشير ألياف العضلات في منطقة البطن. الأسهم الصفراء تشير بقايا سقالة. (H وG) توزيع ديكستران FITC كما يتضح من الصور المجهري مبائر. لجميع قرارات، كان حجم العينة ن ≥ 3 ويتم تمثيل كل القيم كما يعني الخطأ ± المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الرقم 2. الخواص الميكانيكية للرفرف أسبوع واحدبعد النقل. (A) وتصلب و(B) قوة الشد في نهاية المطاف (UTS) من اللوحات. السيطرة تقف والكسب غير المشروع فارغة دون الخلايا، خلايا تقف الطعوم الثقافة الثلاثية. * = T-اختبار ف <0.05، ن = تتمثل 3. القيم كما يعني الخطأ ± المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد التقى التقدم في هندسة الأنسجة مع الطلب المتزايد على الأنسجة بديلا عن إعادة الإعمار من أنواع الأنسجة المختلفة. وقد تم تقييم مجموعة متنوعة من الاصطناعية 1،17،18 والبيولوجية 14-16 المواد وكذلك أساليب التصنيع لقدرتها على التصدي لهذه المطالب. ومع ذلك، على الرغم من التقدم في مجال الرعاية السريرية وهندسة الأنسجة، واستعادة عيوب جدار البطن كامل سماكة لا تزال تشكل تحديا. يجب أن تكون الأنسجة كافية لإعادة بناء مثل هذه العيوب الضخمة (1) سميكة و(2) أوعية دموية، وإظهار (3) السلامة الميكانيكية، و (4) الجدوى مع مرور الوقت 23.

هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة مفصل لإنشاء سميكة، وقابلة للحياة، وأوعية دموية رفرف الأنسجة، والتي يمكن أن تكون بمثابة بديل لاللوحات النسيج ذاتي. شيد رفرف ملفقة في خطوتين: (1) تم زرعها سقالة PLLA / PLGA حول الأوعية AV مذكرة التفاهمحد ذاته hindlimb وفصلها عن الأنسجة المحيطة بها للسماح الأوعية الدموية عن طريق الأوعية AV فقط. (2) ثم نقل خلق أوعية دموية، رفرف نسيج سميك مع السفن AV، الذي شغل منصب عنيق لها، إلى وجود خلل جدار البطن كامل سماكة.

رفرف السليم الأوعية الدموية ضروري لنجاح التكامل في غضون 17،18،24 المضيف. الطرق المختلفة لخلق الأنسجة المهندسة أوعية دموية من أجل تحسين امدادات الاوكسجين ونشرها في الأنسجة السميكة، وقد نوقشت في الأدب. ومن بين هذه الأساليب التي تنطوي على زرع الخلايا البطانية (ECS) على أنواع مختلفة سقالة 13،20،25-30، تقنيات مختلفة لتوفير عوامل عائية إلى الموقع زرع (إما عن طريق الإدارة مباشرة عن طريق الحقن، واستخدام الخلايا تحولت يعبرون عن العوامل 31 الإفراج -34 أو بطيئة من السقالات مختلفة 35،36)، واستخدام المفاعلات الحيوية لضمان الأنسجة المهندسة نضح 37 38،39. هنا، كان أوعية دموية الكسب غير المشروع الأنسجة في الجسم الحي، من خلال استغلال السفن ذاتي. الكسب غير المشروع، والتي أثبتت قابلة للحياة، وأوعية دموية perfused، ثم تم نقلها كما رفرف نسيج سميك لإصلاح الخلل جدار البطن كامل سماكة. كان أسبوع واحد بعد نقل-رفرف قابلة للحياة وظهرت قوة ميكانيكية كافية لدعم أحشاء البطن. هنا، كنا الفئران عارية athymic، التي تحمل نظام المناعة وضعف. عند استخدام أي نوع آخر من الماوس أو حيوان آخر، ينبغي أن تؤخذ في إمكانية التفاعلات المناعية في الاعتبار (وخصوصا عندما بذر السقالات مع الخلايا). وتشمل القيود الأخرى لهذه التقنية (1) نقل السفن AV الفخذ، التي تزود تدفق الدم إلى hindlimb. ومع ذلك، فإن تقنية يترك العميقة والأوعية الفخذية العميقة دون أن تمس ولم يلاحظ وجود نقص التروية hindlimb بعد نقل رفرف. وعلاوة على ذلك، في الحيوانات الكبيرة والإنسان، واستخداموسيتم إبلاغ الأوعية الطرفية لأنها زائدة في الجسم. (2) الوقت اللازم لتحقيق الأوعية الدموية كاف قبل رفرف نقل، يمكن أن يكون عاملا محددا في الحالات العاجلة. و (3) يتم تنفيذ إنشاء رفرف في الجسم الحي، والتي يمكن أن تحد من أهميتها في البشر. في المستقبل، ونحن نهدف إلى تطوير وسيلة لخلق هذا رفرف خارج الحي. الاستفادة من طريقة عرض تكمن في القدرة على تعزيز تشكيل الأنسجة ذاتي (مع خلايا ذاتي) حول السقالة. تقدم الأنسجة الناتجة بديل مناسب لرفرف نسيج ذاتي. وعلاوة على ذلك، يمكن المصنف السقالة مع الخلايا ذاتي قبل الزرع، لزيادة تحسين الأوعية الدموية الكسب غير المشروع والتكامل داخل النسيج المضيف. استخدام الخلايا ذاتي وسقالة القابلة للتحلل وحيويا، يمكن التحايل على خطر كبير من التفاعلات المناعية الرفض ويقدم بديلا لاللوحات ذاتي مع تجنب الحصاد وscarifi بعد العملية الجراحيةالأيونات الموجبة.

الطريقة الموصوفة يمكن أن تترجم إلى التجارب في الحيوانات الكبيرة وزيادة توسيع إلى التجارب السريرية على البشر. وعلاوة على ذلك يمكن أن يترجم إلى إصلاح الأنسجة التالفة المختلفة داخل الجسم. في البشر والحيوانات في كبيرة، يمكن أن تتولد اللوحات حول الأوعية المحيطية بدلا من الأوعية AV الفخذ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12 (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32 (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69 (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18 (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28 (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193 (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27 (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. , Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7 (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 107، رفرف، هندسة الأنسجة، سقالة، الأوعية الدموية، نموذج الفأر والأنسجة أوعية دموية، والعضلات
المهندسة أوعية دموية العضلات رفرف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman,… More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter