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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

इंजीनियर vascularized स्नायु फ्लैप

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

पेट की दीवार दोषों अक्सर गंभीर आघात, कैंसर का इलाज, जलता है और संक्रमित जाल को हटाने के बाद उत्पन्न होती हैं। इन दोषों अक्सर जटिल शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है और प्लास्टिक पुनर्निर्माण सर्जन 1-4 के लिए एक बड़ी चुनौती पेश, महत्वपूर्ण ऊतकों को नुकसान शामिल है। कृत्रिम ऊतकों के लिए नए स्रोतों की तलाश ऊतक इंजीनियरिंग शोधकर्ताओं विभिन्न सामग्रियों, सेल के सूत्रों और वृद्धि कारकों का पता लगाया है। ऐसे इंजीनियर ऊतकों का आरोपण से श्वासनली 5,6, मूत्राशय 7, कॉर्निया 8, हड्डी 9 और त्वचा 10, के रूप में विभिन्न ऊतकों के सफल पुनर्स्थापन पहले से सूचित किया गया। हालांकि, एक मोटी vascularized इंजीनियर ऊतक का निर्माण विशेष रूप से बड़े दोषों के पुनर्निर्माण के लिए, ऊतक इंजीनियरिंग में एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है।

एक व्यवहार्य ऊतक का निर्माण की मोटाई सीमित मुख्य कारकों में से एक अपने विपक्ष को ऑक्सीजन की आपूर्ति का नियंत्रण हैtituent कोशिकाओं। प्रसार पर भरोसा करते हैं, मोटाई एक बहुत पतली परत के उस तक सीमित है निर्माण। ऑक्सीजन और इन विवो में पोषक तत्वों की आपूर्ति केशिकाओं के बीच अधिकतम दूरी ऑक्सीजन 11,12 के प्रसार की सीमा के साथ संबद्ध है, जो लगभग 200 माइक्रोन है। अपर्याप्त vascularization ऊतक ischemia में परिणाम और ऊतक अवशोषण या नेक्रोसिस 13 को बढ़ा सकते हैं।

इसके अलावा, ऊतक पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल आदर्श सामग्री biocompatible और गैर immunogenic होना चाहिए। यह भी biomaterial के साथ मेजबान कोशिकाओं के आगे एकीकरण को बढ़ावा देने, और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में सक्षम होना चाहिए। विभिन्न जैविक 14-16 और सिंथेटिक 1,17,18 मेट्रिसेस पहले हालांकि उनके उपयोग प्रभावी रक्त की आपूर्ति, संक्रमण या अपर्याप्त ऊतक शक्ति की कमी के कारण सीमित रहते हैं, ऊतक पुनर्निर्माण के लिए पता लगाया गया है।

इस अध्ययन में, एक biocompatible, सेल EMBखाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुमोदित पाली एल लैक्टिक एसिड (PLLA) / लैक्टिक-सह-एसिड (पीएलजीए) पाली, के शामिल edded पाड़ एक नग्न माउस का और्विक धमनी और शिरा (ए वी) जहाजों के आसपास प्रत्यारोपित किया गया था और केवल ए वी वाहिकाओं से vascularization सुनिश्चित करने, आसपास के ऊतकों से अलग कर दिया। एक सप्ताह के बाद आरोपण, भ्रष्टाचार, व्यवहार्य मोटी और अच्छी तरह vascularized था। ए वी वाहिकाओं के साथ इस मोटी vascularized ऊतक, तो एक ही माउस में एक उदर पूर्ण मोटाई दोष करने के लिए एक pedicled फ्लैप के रूप में स्थानांतरित किया गया था। एक सप्ताह के बाद हस्तांतरण, फ्लैप, व्यवहार्य vascularized और अच्छी तरह से पेट की आंत का समर्थन करने के लिए पर्याप्त शक्ति असर, आसपास के ऊतक के साथ एकीकृत किया गया। इस प्रकार, एक ऑटोलॉगस डंडी असर इंजीनियर मोटी, vascularized ऊतक फ्लैप, पूर्ण मोटाई पेट की दीवार दोषों की मरम्मत के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करता है।

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Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन प्रणालियों के पशु प्रयोगों की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। इस प्रक्रिया के लिए, athymic नग्न चूहों प्रतिरक्षात्मक अस्वीकृति से बचने के लिए इस्तेमाल किया गया। माउस की एक अन्य प्रकार का उपयोग करते हैं, चूहों शल्य प्रक्रिया और cyclosporine के प्रशासन (या किसी अन्य विरोधी अस्वीकृति विकल्प) के लिए पहले की सिफारिश की है मुंडा किया जाना चाहिए।

1. पाड़ तैयारी और सेल एम्बेडिंग

  1. निम्नलिखित तरीके से पाली एल लैक्टिक एसिड (PLLA) और Polylactic-सह-glycolic एसिड (पीएलजीए) के एक मिश्रण,: 1 से बना मचान तैयार:
    1. PLLA के 500 मिलीग्राम और 10 मिलीग्राम क्लोरोफॉर्म में पीएलजीए के 500 मिलीग्राम भंग।
    2. एक Teflon के सांचे में एकत्र हुए सोडियम क्लोराइड कणों की 0.4 ग्राम के लिए बहुलक समाधान के 0.24 मिलीलीटर जोड़ें। 212-600 माइक्रोन का नमक व्यास का प्रयोग करें। क्लोरोफॉर्म हे / एन लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें।
    3. परस्पर झरझरा 3 डी मचानों के लिए अग्रणी आसुत जल का उपयोग कर बाहर नमक नमकीन पानी।
    4. बहुलक टुकड़े काटएक कैंची का उपयोग, फिर 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल (वी / वी) में लेना और उपयोग से पहले 2 मिनट के लिए पीबीएस में 3 बार धोएं।
  2. (1 endothelial सेल मध्यम (ईजीएम -2 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक अपनी बुलेट किट और पेशी सेल मध्यम (Dulbecco न्यूनतम आवश्यक मध्यम (DMEM), के घटकों के साथ पूरक एफबीएस: 1 में निम्नलिखित कोशिकाओं की एक त्रि-संस्कृति को तैयार ), 2.5% HEPES बफर, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 0.1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (कलम strep समाधान)।
    1. 0.5 x 10 6 C2C12 myoblasts, 0.9 एक्स 10 6 मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs), और 0.2 x 10 6 सामान्य मानव त्वचीय fibroblasts (NHDF) का प्रयोग करें।
  3. 4 मिनट के लिए 200 XG पर एक microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को एक साथ मिक्स मध्यम महाप्राण और सेल के माध्यम μl एक 4 μl बर्फ के ठंडे बाह्य मैट्रिक्स समाधान का मिश्रण है और 4 में गोली फिर से निलंबित।
  4. एक्स 7 मिमी x 1 मिमी (लंबाई x चौड़ाई x मोटाई) PLLA / PLG 10 मिमी का एक टुकड़ा काटएक पाड़ और 4 मिलीलीटर सेल के माध्यम जोड़ने से पहले (30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2), 6 अच्छी तरह से थाली में सेल निलंबन बीज बाह्य मैट्रिक्स समाधान जमना करने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. आरोपण से पहले दस दिनों के लिए scaffolds सेते हैं और मध्यम हर दूसरे दिन की जगह।

2. सर्जिकल प्रक्रिया शुरू करने से पहले

  1. (आटोक्लेव) निम्नलिखित सर्जिकल उपकरण तैयार है और बाँझ: एक छोटा सा है, ठीक है, सीधे कैंची, एक वसंत कैंची, एक सीधे, ठीक इत्तला दे दी संदंश, एक दाँतेदार संदंश और एक सुई धारक।
  2. 425 μl ketamine और 1 मिलीलीटर सिरिंज में 75 μl xylazine के मिश्रण से एक microcentrifuge ट्यूब में xylazine समाधान: एक ketamine के मिश्रण तैयार करें।
  3. बाँझ खारा (1:20) में 0.3 मिलीग्राम / एमएल buprenorphine पतला।

3. फ्लैप निर्माण (भ्रष्टाचार आरोपण)

  1. एक इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, ketamine के एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize: xylazine (35 μl प्रतिशरीर के वजन के 20 ग्राम)।
  2. Subcutaneously buprenorphine opperation से पहले (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा के अंतिम एकाग्रता) इंजेक्षन।
  3. सामान्य शरीर के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक मंच पर माउस रखें, और उसके बाद एक चिपकने वाली पट्टी का उपयोग कर माउस सुरक्षित है।
  4. कपास सुझावों का उपयोग करना, माउस की आँखें (निर्जलीकरण से बचने के लिए) के लिए आंख मरहम चिकनाई प्रशासन।
  5. एक सड़न रोकनेवाला काम कर क्षेत्र की स्थापना के लिए, कपास टिप्स, आयोडीन के साथ स्वच्छ चीरा साइट और फिर से 70% इथेनॉल का उपयोग करना।
  6. छोटे कैंची और संदंश का प्रयोग, और्विक धमनी और शिरा (ए वी) वाहिकाओं उजागर कर रहे हैं, जब तक ऊरु वाहिकाओं के समानांतर, वंक्षण बंधन को घुटने के स्तर से, त्वचा के माध्यम से एक चीरा बनाते हैं।
  7. ऊतक के लिए बेहतर उपयोग हासिल करने के लिए, एक प्रतिकर्षक का उपयोग त्वचा को दबाए रखें।
  8. वसंत कैंची और संदंश का प्रयोग, ध्यान से आसपास के ऊतकों से और्विक धमनी और शिरा वाहिकाओं को अलग। वंक्षण निम्न आय वर्ग के स्तर से शुरूबेहतर अधिजठर वाहिकाओं के विभाजन के लिए आमेंट। पैर में रक्त के प्रवाह को बनाए रखने और बाद ischemia रोकने के क्रम में, अछूता profunda छोड़ दें।
  9. Profunda नीचे और टिबियल और proneal ए वी के लिए विभाजन ऊपर, उजागर ऊरु ए वी के आसपास (1 खंड से) भ्रष्टाचार गुना, और 8-0 रेशम टांके का उपयोग कर अपने सिरों में शामिल हो।
  10. केवल ऊरु ए वी जहाजों से अंकुरण केशिकाओं से प्रत्यारोपण vascularization सुनिश्चित करने के लिए, 6-0 टांके के साथ एक भ्रष्टाचार के आसपास निष्फल लेटेक्स का टुकड़ा है, और सिवनी लपेटो।
  11. 4-0 रेशम टांके का उपयोग कर overlying त्वचा को बंद करें।
  12. भ्रष्टाचार एक फ्लैप के रूप में स्थानांतरित किया जाता है, जब तक संज्ञाहरण और उसके बाद हर दिन से वसूली तक बारीकी से माउस की निगरानी करें। Subcutaneously buprenorphine 2-3 दिनों के लिए दिन में दो बार (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा के अंतिम एकाग्रता) इंजेक्षन।
    नोट: उजागर ऊतक के निर्जलीकरण से बचने के लिए, किसी भी चरण में खारा का प्रयोग करें।

4. फ्लैप स्थानांतरण

  1. एक पर यादो सप्ताह postimplantation, ketamine के एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize: xylazine (35 μl / 20 ग्राम), एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग।
  2. Subcutaneously buprenorphine opperation से पहले (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा के अंतिम एकाग्रता) इंजेक्षन।
  3. सामान्य शरीर के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक मंच पर माउस रखें, और उसके बाद एक चिपकने वाली पट्टी का उपयोग कर माउस सुरक्षित है।
  4. कपास सुझावों का उपयोग करना, माउस की आँखें (निर्जलीकरण से बचने के लिए) के लिए आंख मरहम चिकनाई लागू होते हैं।
  5. कपास सुझावों का उपयोग करना, एक सड़न रोकनेवाला काम कर क्षेत्र की स्थापना के लिए, आयोडीन के साथ और फिर 70% इथेनॉल के साथ (पेट के लिए घुटने क्षेत्र से) चीरा साइट को साफ।
  6. ध्यान से एक कैंची का उपयोग, त्वचा में टांके खोलने के लिए और एक कैंची और संदंश का प्रयोग, उदर त्वचा के माध्यम से जारी है, वंक्षण बंध करने के लिए त्वचा के माध्यम से समांतर एक चीरा बनाते हैं।
  7. ध्यान से संदंश के साथ लेटेक्स टुकड़ा हटाने और vascularized फ्लैप का पर्दाफाश।
  8. एक sciss का प्रयोगओआरएस और संदंश, आसपास के ऊतकों से ऊतक फ्लैप काटना।
  9. एक संदंश और एक सुई धारक का उपयोग करना, ए वी से खून बह रहा रोकने के लिए 8-0 रेशम टांके के साथ ऊरु ए वी के बाहर का अंत ligate। फिर, distally मुड़ा प्रत्यारोपित ऊतक और 8-0 टांके के लिए, घुटने के स्तर पर ए वी दाग़ना।
  10. धीरे पूर्ण मोटाई दोष बनाया जाना चाहिए जो दूरी पर निर्धारित करने के लिए, धमनी को नुकसान से बचने, उदर पेट की दीवार की ओर, भ्रष्टाचार से छा ऊरु ए वी हस्तांतरण।
    चेतावनी: बहुत दूर धमनी पुलिंग धमनी को नुकसान होगा।
  11. एक ठीक कैंची का प्रयोग, उदर पेट की दीवार में एक चीरा बनाने।
  12. एक वसंत कैंची का प्रयोग, rectus abdominus मांसपेशियों में एक चीरा बनाने। Overlying त्वचा के साथ rectus abdominus मांसपेशियों की एक लगभग 1 सेमी x 0.8 सेमी खंड निकालें।
  13. उदर abdom में पूर्ण मोटाई दोष करने के लिए, एक अक्षीय फ्लैप के रूप में, vascularized भ्रष्टाचार से छा ऊरु ए वी, स्थानांतरणinal दीवार।
  14. हर्निया को रोकने के लिए, 8-0 रेशम टांके का उपयोग कर, आसपास के मांसपेशियों के ऊतकों को फ्लैप सीवन।
  15. पेट की मांसपेशियों को फ्लैप suturing जब आंतरिक अंगों suturing से बचने के लिए, एक संदंश के साथ मांसपेशियों को बढ़ाने के। एक पूर्ण पेट की दीवार दोष के प्रभाव की नकल के संपर्क में उदर त्वचा छोड़ दें।
  16. Iodinated धुंध और उजागर क्षेत्र के प्रदूषण को रोकने के लिए एक बाँझ पट्टी के साथ त्वचा में घाव को कवर किया।
  17. 4-0 रेशम टांके का उपयोग कर पैर की त्वचा सीवन।
  18. फ्लैप की बहाली तक, संज्ञाहरण और उसके बाद हर दिन से वसूली तक बारीकी से माउस की निगरानी करें। Subcutaneously buprenorphine 2-3 दिनों के लिए दिन में दो बार (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा के अंतिम एकाग्रता) इंजेक्षन।
  19. नोट: उजागर ऊतक के निर्जलीकरण से बचने के लिए किसी भी स्तर में खारा का प्रयोग करें।

भ्रष्टाचार के संवहनी छिड़काव 5. अल्ट्रासाउंड निर्धारण

नोट: हस्तांतरण से पहले, संवहनी छिड़काव ओच भ्रष्टाचार अल्ट्रासोनोग्राफी द्वारा, आरोपण के बाद एक और दो सप्ताह में मापा जाता है।

  1. 2% isoflurane का उपयोग माउस anesthetize।
  2. सामान्य शरीर के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए, 38 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक जंगम मंच पर माउस रखें, और उसके बाद एक चिपकने वाली पट्टी का उपयोग कर माउस सुरक्षित है।
  3. बी मोड पर सेट गैर रेखीय ट्रांसड्यूसर साथ और्विक धमनी और शिरा जहाजों का पता लगाएं।
  4. रंग डॉपलर मोड पर सेट ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर भ्रष्टाचार के ऊरु जहाजों की प्रत्यक्षता जांच करते हैं।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार गैर-लक्षित विपरीत एजेंट तैयार करें।
  6. खारा से भरा एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक पूंछ नस कैथेटर (एक 27 जी सुई के साथ 12 सेमी ट्यूबिंग) कनेक्ट करें। हीटिंग मंच पर माउस के बगल में सिरिंज सुरक्षित (सिरिंज के आंदोलन से बचने के लिए)।
  7. माउस पूंछ नस कैथेटर कनेक्ट और सुई सुरक्षित है।
  8. दोनों इंजेक्शन नस में और भरने के लिए प्रयास किए जा रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए नमक की कुछ इंजेक्षननमक के साथ ट्यूबिंग (हवा के बुलबुले से बचने के लिए)।
  9. इसके विपरीत एजेंट के 70 μl के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें और विपरीत एजेंट सिरिंज के साथ खारा सिरिंज की जगह।
  10. इसके विपरीत एजेंट की छवि को इंजेक्शन के लिए अल्ट्रासाउंड की स्थापना की। गैर रेखीय मोड के गुण में 1,500 फ्रेम की संख्या और फ्रेम के 30% के लिए व्यवधान नाड़ी की स्थापना की।
    नोट: व्यवधान नाड़ी के बाद, सूक्ष्मबुद्बुद केशिकाओं में सूक्ष्मबुद्बुद के प्रवाह की दर पर निर्भर करता है और सूक्ष्मबुद्बुद के इंजेक्शन दर से स्वतंत्र है कि एक दर पर जहाजों को फिर से भरने के लिए। फ्रेम की संख्या भरने समय 19,20 के हिसाब से बदला जा सकता है।
  11. धीरे धीरे पूंछ नस में विपरीत एजेंट इंजेक्षन।
  12. उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड प्रणाली की गैर रेखीय कंट्रास्ट मोड में छवियों पर कब्जा।
  13. पहले से 19,20 वर्णित के रूप में, सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण।
    1. छवि प्राप्त आईएम पर ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र ड्राmediately विपरीत मोड में व्यवधान नाड़ी के बाद। रॉय के ही विपरीत एजेंट द्वारा भरा क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करनी चाहिए।
    2. व्यवधान नाड़ी के बाद बनाम सूक्ष्मबुद्बुद के इंजेक्शन के बाद गैर रेखीय संकेत का मतलब तीव्रता का अनुपात है, और छिड़काव की मात्रा का एक उपाय है जो शिखर वृद्धि (पीई), गणना।
    3. शिखर संकेत (पी) जब तक बीतता उस समय (टी) से निर्धारित किया जाता है, जो प्रवाह की दर की गणना।

भ्रष्टाचार vascularization की हद तक की 6. निर्धारण

नोट: ऊतक भ्रष्टाचार vascularization की हद तक एक या दो सप्ताह के आरोपण के बाद चुना गया है।

  1. एक इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, ketamine के एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize: xylazine (35 μl / 20 ग्राम)।
  2. 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, नसों पूंछ नस में 10 मिलीग्राम / एमएल fluorescein आइसोथियोसाइनेट संयुग्मित dextran (FITC-dextran, = 500000 मेगावाट) के 200 μl इंजेक्षन। </ Li>
  3. दस सेकंड इंजेक्शन के पूरा होने के बाद, ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize।
  4. माउस के पैर खोलें और भ्रष्टाचार का पर्दाफाश।
  5. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ भ्रष्टाचार के क्षेत्र को धो लें और 10% तटस्थ बफर formalin लागू होते हैं।
  6. छवि एक confocal खुर्दबीन का उपयोग माउस पैर में भ्रष्टाचार,।
  7. कार्यात्मक पोत घनत्व (FVD) यों।
    1. कोंफोकल सूक्ष्म छवियों के ग्रीन चैनल (उत्तेजना = 488 एनएम) अलग।
    2. उच्च विपरीत संरचनाओं दबाव का चिह्न क्रम में, एक उच्च पास फिल्टर के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप छवियों से गुजरती हैं।
    3. उच्च पास फिल्टर से परिलक्षित किया गया हो सकता है कि शोर को दूर करने के लिए एक despeckling फिल्टर का प्रयोग करें।
    4. परिणामस्वरूप छवि पर सीमा के मूल्य को सेट करें; मूल छवि में सुविधाओं और संरचनाओं द्विआधारी छवि में दिखाई दे रहे हैं, ताकि सीमा मूल्य निकाला जाता है।
    5. एक आकार-सीमा लागू करें तो यह है कि परिभाषित siz से बड़ा जुड़ा पिक्सल का केवल समूहोंई दहलीज द्विआधारी छवि में रहते हैं।
    6. जांग-Suen एल्गोरिथ्म 21 का उपयोग कर भ्रष्टाचार में जहाजों के कंकाल को रेखांकित करें।
    7. प्रत्येक पोत के midline की लंबाई संक्षेप और रॉय के क्षेत्र द्वारा परिणाम विभाजित करके FVD गणना।

भ्रष्टाचार के 7. Immunohistological और histological धुंधला

  1. Immunohistological धुंधला
    1. Confocal इमेजिंग के बाद, छोटी कैंची और संदंश एक का उपयोग कर भ्रष्टाचार निकालते हैं। भ्रष्टाचार के दोनों सिरों में ए वी वाहिकाओं काटना और भ्रष्टाचार निकालते हैं।
    2. 30 मिनट के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में ग्राफ्ट ठीक - 2 घंटा।
    3. आयल एम्बेडिंग जब तक 70% इथेनॉल में ऊतक विज्ञान कैसेट में ग्राफ्ट और दुकान रखें।
    4. आयल एक मानक निर्धारण का उपयोग करते हुए और प्रोटोकॉल 22 embedding में एम्बेड और एक microtome का उपयोग कर 5 माइक्रोन स्लाइस में आयल एम्बेडेड ऊतकों टुकड़ा। ए वी के लंबवत पूरे ऊतक स्लाइसवाहिकाओं।
    5. 10 मिनट प्रत्येक के लिए, दो बार 100% xylene में विसर्जन के द्वारा आयल एम्बेडेड वर्गों Deparaffinize।
    6. एक 250 मिलीलीटर की प्लास्टिक Coplin जार में स्लाइड की व्यवस्था।
    7. 3 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल की सांद्रता (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% और डबल आसुत जल (DDW)) को कम करने में सीरियल immersions द्वारा rehydrate।
    8. DDW के 250 एमएल के साथ प्रतिजन अनमास्किंग समाधान के 2.35 मिलीलीटर गिराए द्वारा प्रतिजन अनमास्किंग समाधान तैयार है। 95 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक माइक्रोवेव में 2 मिनट के लिए प्रतिजन अनमास्किंग समाधान हीट।
    9. 95 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक माइक्रोवेव में 3 मिनट के लिए फिर से पूर्व गर्म प्रतिजन अनमास्किंग समाधान और गर्मी में स्लाइड डालें। 50 डिग्री सेल्सियस के लिए स्लाइड कूल।
    10. 2 मिनट के लिए फिर से गर्मी और आरटी के लिए तो अच्छा।
    11. अंतर्जात peroxidase की गतिविधि बुझा लेते हैं और फिर पीबीएस में दो बार कुल्ला करने के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए 3.3% एच में मेथनॉल में 2 2 हे समाधान स्लाइड सेते हैं।
    12. एक ऊष्मायन कक्ष तैयार: जगह गीला absoएक ऊतक विज्ञान बॉक्स के अंदर rbent चादरें और नाजुक काम वाइपर का उपयोग कर स्लाइड सूखी।
    13. सर्किल टुकड़ा प्रति (पीबीएस में तैयार 2%), अवरुद्ध समाधान बकरी सीरम के लगभग 50 μl के साथ एक हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते स्लाइड पर टुकड़ा क्षेत्र,।
    14. समाधान को रोकने में खरगोश विरोधी CD31 एंटीबॉडी 01:50 पतला, टुकड़ा के अनुसार लगभग 50 μl एंटीबॉडी लागू करते हैं और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन, सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला।
    15. स्लाइड पर जगह, पीबीएस में टुकड़ा प्रति एंटीबॉडी के लगभग 50 μl 400 और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते: biotinylated बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी 1 पतला।
    16. पीबीएस के साथ 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला।
    17. पीबीएस में 400, आरटी पर 30 मिनट के लिए स्लाइड के साथ टुकड़ा के अनुसार लगभग 50 μl लागू करते हैं और सेते: streptavidin-peroxidase 1 पतला। पीबीएस के साथ 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला।
    18. निर्माता & # के अनुसार, टुकड़ा के अनुसार लगभग aminoethylcarbazole के 50 μl (एईसी) सब्सट्रेट लागू करें8217; निर्देशों। प्रतिक्रिया को रोकने के DDW में स्लाइड्स डुबकी।
    19. 2 मिनट के लिए मेयर के hematoxylin समाधान के लगभग 50 μl में वर्गों डुबो कर नीले रंग में नाभिक दाग। धीरे पानी में कुल्ला और फिर बढ़ते मध्यम के साथ वर्गों को कवर किया।
    20. एक डबल अंधा दृष्टिकोण का उपयोग CD31 पॉजिटिव धुंधला यों। CD31 धुंधला एक भूरे रंग के दाग के रूप में प्रकट होता है। एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत एक 40x बढ़ाई देखने के क्षेत्र में 4-5 विभिन्न क्षेत्रों का चयन करें। CD31 पॉजिटिव lumens की संख्या की गणना।
      1. खेतों की संख्या और (दूरबीन के आंकड़ों के अनुसार) fieldarea के साथ गिना lumens की कुल संख्या से भाग दिया पाड़ प्रति CD31 पॉजिटिव lumens की औसत संख्या की गणना।
        नोट: लागू किया अभिकर्मक मात्रा पूरे उल्लिखित टुकड़ा कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  2. Histological धुंधला
    1. 10% तटस्थ बफर formalin में ग्राफ्ट को ठीक करें।
    2. आयल का उपयोग कर मानक में एम्बेड ग्राफ्टनिर्धारण और embedding प्रक्रियाओं।
    3. 10 मिनट के लिए दो बार 100% xylene में विसर्जन के द्वारा आयल एम्बेडेड वर्गों से आयल निकालें।
    4. 100% isopropanol में पुनर्जलीकरण के लिए दो बार तेजी से धोने।
    5. दो बार तेजी से धोने के 95% इथेनॉल।
    6. नल के पानी में तीन बार धोएं।
    7. 10 मिनट के लिए Hematoxylin में विसर्जित कर दिया।
    8. नल के पानी में तीन बार धोएं।
    9. 2 मिनट के लिए Eosin में Immere।
    10. फास्ट धोने दो बार 95% इथेनॉल में निर्जलीकरण।
    11. दो बार तेजी से धो 100% isopropanol।
    12. दो बार तेजी से धो 100% xylene।
    13. 1.5 मिमी मोटी कांच कवर के साथ dpx गोंद के साथ कवर।
    14. 40x बढ़ाई में माइक्रोस्कोप का उपयोग छवि।

8. यांत्रिक गुण आकलन

  1. छोटे कैंची और संदंश एक का उपयोग कर भ्रष्टाचार निकालते हैं।
  2. पीबीएस में भ्रष्टाचार कुल्ला।
  3. भ्रष्टाचार की चौड़ाई और मोटाई मापने और मोटाई से गुणा चौड़ाई के रूप में पार अनुभाग क्षेत्र की गणना।
  4. हमेंहाइड्रेटेड ग्राफ्ट की एक तनाव तनाव की अवस्था उत्पन्न करने के लिए परीक्षण यंत्र ई।
    1. सिस्टम तन्य पकड़ती के बीच भ्रष्टाचार के माउंट और दो ​​पकड़ती है (यानी, प्रारंभिक लंबाई) के बीच अंतिम लंबाई मापने।
    2. विफलता तक, 0.01 मिमी / सेकंड की एक नस्ल दर लागू करें।
    3. निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर विकसित बल और विस्थापन रिकॉर्ड।
    4. Matlab में एक तनाव तनाव की अवस्था उत्पन्न करता है।
      1. प्रारंभिक लंबाई से विभाजित विस्थापन के अनुसार तनाव की गणना। तनाव पार के अनुभागीय क्षेत्र से विभाजित मापा शक्ति के रूप में गणना की है।
      2. तनाव तनाव की अवस्था में रैखिक क्षेत्र की ढलान और वक्र की अधिकतम बिंदु के रूप में कठोरता का निर्धारण करते हैं परम तन्यता ताकत है।

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Representative Results

विवो में भ्रष्टाचार vascularization और छिड़काव

ग्राफ्ट से पहले अक्षीय फ्लैप के रूप में उनके स्थानांतरण के लिए एक या दो सप्ताह प्रत्यारोपित किया गया। एक और दो सप्ताह के बाद आरोपण में भ्रष्टाचार क्षेत्र का सकल अवलोकन व्यवहार्य और vascularized ऊतक ग्राफ्ट का पता चला। सकारात्मक CD31 immunostaining (चित्रा 1 ए) के द्वारा निर्धारित किया है, और अत्यधिक perfused रूप FITC-dextran पूंछ नस में इंजेक्शन और अल्ट्रासाउंड माप से सबूत के रूप में ये ग्राफ्ट, अत्यधिक vascularized साबित हुई। कई जहाजों पहले से ही एक सप्ताह के बाद आरोपण, ए वी वाहिकाओं के आसपास के क्षेत्र में एक अतिरिक्त सप्ताह के बाद काफी गुलाब कि एक नंबर पर मनाया गया। कार्यात्मक पोत घनत्व (FVD) (चित्रा 1 बी) के FITC-dextran आधारित दृढ़ संकल्प भ्रष्टाचार अत्यधिक एक सप्ताह postimplantation पर और कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन विवो अतिरिक्त सप्ताह में जगह ले ली कि vascularized था कि पता चला है। पोत प्रत्यक्षता और छिड़काव का प्रदर्शन किया गयाचित्रा 1C भ्रष्टाचार आरोपण के बाद मेजबान ऊरु पोत प्रत्यक्षता और अखंडता की पुष्टि अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा (क्रमश: 1, एक और दो ​​सप्ताह के बाद आरोपण, - 1 ± 2.71 मिमी - - 1 ± 0.51 मिमी - 1 और 10.28 मिमी FVD 5.71 मिमी) था। । इसके अलावा, ultrasonographic परीक्षा के एक सप्ताह के बाद आरोपण (चित्रा -1) की तुलना में दो सप्ताह के बाद आरोपण से थोड़ा अधिक था, जो भ्रष्टाचार के क्षेत्र के भीतर छिड़काव का पता चला।

फ्लैप गुण

फ्लैप एक सप्ताह के बाद हस्तांतरण की सकल परीक्षा एक व्यवहार्य vascularized और अच्छी तरह से एकीकृत ऊतक का पता चला। फ्लैप अपने आसपास के लिए फर्म लगाव कराना पड़ा। अकोशिकीय, nonvascularized ग्राफ्ट को नियंत्रित करने के लिए पूर्व vascularized, सेल एम्बेडेड फ्लैप जब तुलना में वृद्धि हुई है कठोरता और ताकत (द्वारा प्रकट रूप में, पूर्व, बेहतर यांत्रिक गुणों से पता चला

आकृति 1
समूह को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में postimplantation चित्रा 1. भ्रष्टाचार vascularization। (ए) CD31 पॉजिटिव वाहिकाओं के घनत्व, एक और दो ​​सप्ताह में मापा जाता है। सभी मूल्यों को भ्रष्टाचार क्षेत्र (2 मिमी) सामान्यीकृत कर रहे हैं। * = टी परीक्षण पी <0.05। (बी) के एक और दो ​​सप्ताह के postimplantation में कार्यात्मक संवहनी घनत्व (FVD)। कोई महत्वपूर्ण अंतर पी = 0.08 (टी परीक्षण), मनाया गया। (सी) के रूप में पेटेंट ए वी जहाजों रंग डॉपलर मोड में अल्ट्रासाउंड का उपयोग imaged। नीले और लाल प्रतिनिधिभ्रष्टाचार में रक्त के प्रवाह के लिए टी। पीले चतुर्थ भाग भ्रष्टाचार क्षेत्र की रूपरेखा। एक और दो ​​सप्ताह के postimplantation पर (डी) भ्रष्टाचार छिड़काव। (ई और एफ) मेजबान ऊतक के साथ एकीकृत फ्लैप के एच एंड ई धुंधला: काला तीर बिंदु व्यवहार्य धमनी; सफेद तीर पेट की मांसपेशी फाइबर बिंदु; पीले तीर पाड़ अवशेष इशारा करते हैं। (एच और जी) confocal माइक्रोस्कोपी छवियों के रूप में दिखाया FITC dextran वितरण। सभी निर्धारण के लिए, नमूना आकार n ≥ 3 था और सभी मूल्यों मतलब का मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2। फ्लैप एक सप्ताह के यांत्रिक गुणोंबाद के हस्तांतरण। (ए) जकड़न और (बी) फ्लैप के परम तन्य शक्ति (यूटीएस)। नियंत्रण कक्षों के बिना एक खाली भ्रष्टाचार खड़ा है, कोशिकाओं त्रिकोणीय संस्कृति ग्राफ्ट खड़ा है। * = टी परीक्षण पी <0.05, एन = 3. मूल्यों मतलब का मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में प्रगति के लिए विभिन्न प्रकार के ऊतकों के पुनर्निर्माण के लिए विकल्प के ऊतकों के लिए एक बढ़ती मांग के साथ मुलाकात की गई है। 1,17,18 सिंथेटिक और जैविक 14-16 सामग्री के साथ ही निर्माण विधियों की एक किस्म इन मांगों को संबोधित करने के लिए उनकी क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया है। हालांकि, चिकित्सीय देखभाल में और ऊतक इंजीनियरिंग में प्रगति के बावजूद, पूर्ण मोटाई पेट की दीवार दोषों की बहाली के लिए एक चुनौती बनी हुई है। इतने बड़े पैमाने पर दोष के पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त एक ऊतक मोटी और (2) vascularized (1) हो सकता है, और समय 23 से अधिक (3) यांत्रिक अखंडता, और (4) व्यवहार्यता का प्रदर्शन होगा।

यहाँ, हम ऑटोलॉगस ऊतक फ्लैप के लिए एक विकल्प के रूप में काम कर सकते हैं जो एक मोटी, व्यवहार्य, और vascularized ऊतक फ्लैप, बनाने के लिए एक कदम-दर-कदम विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। गढ़े फ्लैप दो चरणों में निर्माण किया गया था: (1) एक PLLA / पीएलजीए पाड़ समझौता ज्ञापन के ए वी जहाजों के आसपास प्रत्यारोपित किया गया थाएसई hindlimb और केवल ए वी जहाजों द्वारा vascularization अनुमति देने के लिए आसपास के ऊतकों से अलग कर दिया। (2) बनाया vascularized, मोटी ऊतक फ्लैप फिर एक पूर्ण मोटाई पेट की दीवार दोष में, इसकी डंडी रूप में सेवा की है, जो ए वी जहाजों, साथ स्थानांतरित किया गया था।

उचित फ्लैप vascularization मेजबान 17,18,24 के भीतर सफल एकीकरण के लिए आवश्यक है। मोटी ऊतकों में ऑक्सीजन की आपूर्ति और प्रसार में सुधार के क्रम में vascularized इंजीनियर ऊतक बनाने के लिए विभिन्न तरीकों, साहित्य में चर्चा की गई है। इनमें विभिन्न पाड़ प्रकार 13,20,25-30, आरोपण साइट के लिए वाहिकाजनक कारकों की आपूर्ति करने के लिए विभिन्न तकनीकों पर endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) के बोने से जुड़े तरीकों थे (या तो इंजेक्शन द्वारा प्रत्यक्ष प्रशासन द्वारा, बदल कोशिकाओं के उपयोग के कारकों 31 व्यक्त इंजीनियर ऊतक छिड़काव 37 सुनिश्चित करने के लिए अलग अलग मचानों 35,36), बायोरिएक्टर के उपयोग से -34 या धीमी गति से जारी 38,39 के रोजगार। इधर, ऊतक भ्रष्टाचार ऑटोलॉगस वाहिकाओं के शोषण से, विवो में vascularized था। vascularized, व्यवहार्य साबित हुई और भरकर रखा जाता है, जो भ्रष्टाचार है, तो एक पूर्ण मोटाई पेट की दीवार दोष की मरम्मत के लिए एक मोटी ऊतक फ्लैप के रूप में स्थानांतरित किया गया था। एक सप्ताह के बाद हस्तांतरण, फ्लैप व्यवहार्य था और पेट में आंत का समर्थन करने के लिए पर्याप्त यांत्रिक शक्ति विशेषताओं। यहाँ, हम एक भ्रष्ट प्रतिरक्षा प्रणाली को सहन जो athymic नग्न चूहों, इस्तेमाल किया; माउस या अन्य जानवर के किसी अन्य प्रकार का उपयोग करते समय (कोशिकाओं के साथ मचानों बोने खासकर जब), प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की संभावना को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस तकनीक की अन्य सीमाओं hindlimb में रक्त का प्रवाह जो आपूर्ति ऊरु ए वी वाहिकाओं, (1) के हस्तांतरण में शामिल हैं। हालांकि, तकनीक अछूता profunda और गहरी ऊरु वाहिकाओं को छोड़ देता है और कोई hindlimb ischemia के फ्लैप स्थानांतरण के बाद मनाया गया। इसके अलावा, बड़े जानवरों में और मानव में, का उपयोगवे शरीर में बेमानी हैं के रूप में परिधीय वाहिकाओं सलाह दी जाएगी; (2) पर्याप्त vascularization हस्तांतरण प्रालंब करने से पहले, तत्काल मामलों में एक सीमित कारक हो सकता है को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय; और (3) फ्लैप सृजन मानव में इसकी प्रासंगिकता सीमित कर सकते हैं, जो इन विवो में किया जाता है। भविष्य में, हम इस फ्लैप पूर्व vivo बनाने का एक साधन विकसित करने का लक्ष्य है। प्रस्तुत विधि का लाभ पाड़ के आसपास (ऑटोलॉगस कोशिकाओं के साथ) एक ऑटोलॉगस ऊतक के गठन को बढ़ाने के लिए क्षमता में निहित है। जिसके परिणामस्वरूप ऊतक एक ऑटोलॉगस ऊतक फ्लैप के लिए एक उपयुक्त विकल्प प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, पाड़ आगे मेजबान ऊतक के भीतर भ्रष्टाचार vascularization और एकीकरण में सुधार करने के लिए, दाखिल करने से पहले ऑटोलॉगस कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। ऑटोलॉगस कोशिकाओं और एक biodegradable और biocompatible पाड़ का प्रयोग करें, इम्युनो अस्वीकृति प्रतिक्रियाओं का काफी जोखिम को नाकाम और कटाई और पश्चात scarifi से परहेज करते हुए ऑटोलॉगस फ्लैप के लिए एक विकल्प पेश कर सकते हैंकेशन।

वर्णित विधि बड़े जानवरों में प्रयोगों के लिए अनुवाद किया है और आगे मनुष्यों में क्लिनिकल परीक्षण के लिए विस्तारित किया जा सकता है। इसके अलावा यह शरीर के भीतर विभिन्न क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए अनुवाद किया जा सकता है। मनुष्यों में और बड़े जानवरों में, फ्लैप परिधीय जहाजों के आसपास के बजाय ऊरु ए वी जहाजों पर उत्पन्न किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 107 फ्लैप ऊतक इंजीनियरिंग चबूतरा vascularization माउस मॉडल vascularized ऊतक मांसपेशियों
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Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

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