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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Conçu vascularisé Muscle Flap

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

Les défauts de la paroi abdominale surviennent souvent à la suite de traumatismes graves, le traitement du cancer, des brûlures et l'enlèvement de maille infecté. Ces défauts impliquent souvent la perte de tissu importante, nécessitant des interventions chirurgicales complexes et présentant un défi majeur pour les chirurgiens de reconstruction plastique 1-4. Les chercheurs de l'ingénierie tissulaire qui cherchent de nouvelles sources de tissus artificiels ont exploré différents matériaux, sources de cellules et facteurs de croissance. Restaurations réussies de divers tissus, tels que le 5,6 trachée, de la vessie 7, 8 cornée, os 9 et de la peau 10, par implantation d'ingénierie de tissus ont été précédemment rapportés. Cependant, la fabrication d'une ingénierie tissulaire vascularisé épaisse, en particulier pour la reconstruction de gros défauts, demeure un défi important dans l'ingénierie tissulaire.

L'un des principaux facteurs limitant l'épaisseur d'une construction de tissu viable est le contrôle de l'approvisionnement en oxygène à ses inconvénientstituent des cellules. Lorsqu'ils se fient à la diffusion, construire épaisseur est limitée à celle d'une couche très mince. La distance maximale entre l'oxygène et en éléments nutritifs capillaires fournir in vivo est d'environ 200 pm, qui est en corrélation avec la limite de diffusion de l'oxygène 11,12. Vascularisation insuffisante peut entraîner une ischémie tissulaire et grimper à la résorption du tissu ou de nécrose 13.

En outre, le matériau idéal utilisé pour la reconstruction tissulaire doit être biocompatible et non immunogène. Il doit aussi être capable de favoriser une plus grande intégration de cellules hôtes avec le biomatériau et le maintien de l'intégrité structurelle. Divers biologiques 14-16 et synthétiques 1,17,18 matrices ont déjà été explorées pour la reconstruction des tissus, mais leur utilisation reste limitée à cause du manque d'approvisionnement en sang efficaces, les infections ou la force insuffisante des tissus.

Dans cette étude, une cellule-emb biocompatibleéchafaud edded composé de la Food and Drug Administration (FDA) poly -approuvé acide L-lactique (PLLA) / poly acide lactique-co-glycolique (PLGA), a été implanté autour des vaisseaux artère et la veine fémorales (AV) d'une souris nude et séparée du tissu environnant, en assurant la vascularisation des vaisseaux AV uniquement. Une semaine après l'implantation, la greffe était viable, épais et bien vascularisé. Ce tissu vascularisé épais avec les vaisseaux AV, a ensuite été transféré comme un lambeau pédiculé à un défaut de pleine épaisseur abdominale chez la même souris. Une semaine après le transfert, le volet était viable, vascularisé et bien intégré avec le tissu environnant, la force portante suffisante pour supporter viscères abdominaux. Ainsi, le rabat de l'ingénierie tissulaire vascularisé épais, portant un pédicule autologue, présente une nouvelle méthode pour réparer des défauts de pleine épaisseur paroi abdominale.

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Protocol

Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par le Comité de l'éthique des expériences sur animaux du Technion. Pour cette procédure, les souris nude athymiques ont été utilisés pour éviter le rejet immunologique. Si l'on utilise un autre type de souris, les souris doivent être rasées avant l'intervention chirurgicale et l'administration de la cyclosporine (ou un autre anti-rejet de remplacement) est recommandée.

1. Préparation Échafaudages et Cell Embedding

  1. Préparer des échafaudages constitués de mélange 1: 1 de poly-L-lactique-acide (PLLA) et de polylactique-co-glycolique-acide (PLGA), de la manière suivante:
    1. Dissoudre 500 mg de PLLA et de 500 mg de PLGA dans 10 ml de chloroforme.
    2. Ajouter 0,24 ml de solution de polymère à 0,4 g de particules de chlorure de sodium recueillies dans un moule en téflon. Utilisez un diamètre de sel de 212 à 600 um. Laisser le chloroforme pour évaporer O / N.
    3. Leach le sel à l'aide d'eau distillée conduisant à des échafaudages 3D poreuses interconnectés.
    4. Couper des morceaux de polymèreen utilisant une paire de ciseaux, puis tremper dans 70% d'éthanol (v / v) pendant 30 minutes et laver 3 fois dans du PBS pendant 2 min avant utilisation.
  2. Préparer une tri-culture des cellules suivantes en 1: milieu cellulaire une endotheliale (EGM-2 complété avec les composants de son kit de balle et moyen de cellules de muscle (milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM), complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS ), de tampon HEPES 2,5%, 100 U / ml de pénicilline et 0,1 mg / ml de streptomycine (Pen-Strep Solution).
    1. Utiliser 0,5 x 10 6 C2C12 de myoblastes, 0,9 x 10 6 cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), et 0,2 x 10 6 fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF).
  3. Mélanger les cellules ensemble dans un tube de microcentrifugation et centrifuger à 200 x g pendant 4 minutes, aspirer le milieu et remettre en suspension le culot dans un mélange de 4 ul de solution glacée de la matrice extracellulaire et 4 pi de milieu cellulaire.
  4. Coupez un morceau de 10 mm x 7 mm x 1 mm (longueur x largeur x épaisseur) PLLA / PLGUn échafaudage et de semences de la suspension cellulaire dans une plaque à 6 puits, permettre à la solution de la matrice extracellulaire se solidifier (30 min, 37 ° C, 5% de CO 2) avant d'ajouter 4 ml de milieu cellulaire.
  5. Incuber les échafaudages pendant dix jours avant l'implantation et remplacer le milieu tous les deux jours.

2. Avant de commencer la procédure chirurgicale

  1. Préparer et stériliser (autoclave) les outils chirurgicaux suivants: une petite, fine, ciseaux droits, un ressort ciseaux, une pince droites, à pointe fine, une pince dentelées et un porte-aiguille.
  2. Préparer un mélange de kétamine: xylazine solution dans un tube de microcentrifugation en mélangeant 425 ul de kétamine et de xylazine 75 ul dans une seringue de 1 ml.
  3. Diluer 0,3 mg / ml dans une solution saline stérile buprénorphine (1:20).

3. Flap Construction (implantation du greffon)

  1. En utilisant une seringue d'insuline, anesthésier les souris par une injection intraperitoneale de kétamine: xylazine (35 ul par20 g de poids corporel).
  2. Injecter en sous-cutané de la buprénorphine (concentration finale de 0,05 à 0,1 mg de / kg) avant la opperation.
  3. Placer la souris sur une platine chauffée à 37 ° C, pour assurer la température corporelle normale et la fixer à la souris en utilisant un pansement adhésif.
  4. En utilisant des pointes de coton, administrer lubrification pommade ophtalmique aux yeux de la souris (pour éviter la déshydratation).
  5. En utilisant des pointes de coton, nettoyer le site de l'incision avec de l'iode et puis avec 70% d'éthanol, afin d'établir un champ de travail aseptique.
  6. L'utilisation de petits ciseaux et des pinces, faire une incision à travers la peau, à partir du niveau du genou du ligament inguinal, parallèlement aux vaisseaux fémoraux, jusqu'à ce que l'artère et la veine fémorales (AV) les navires sont exposés.
  7. Maintenez la peau vers le bas en utilisant un enrouleur, pour obtenir un meilleur accès au tissu.
  8. Avec des ciseaux et des pinces à ressort, isoler soigneusement les vaisseaux et des artères fémorales de la veine des tissus environnants. Commencez par le niveau de la lig inguinaleament à la bifurcation des vaisseaux épigastriques supérieurs. Laissez la profonde intacte, afin de préserver le flux sanguin à la jambe et à prévenir l'ischémie ultérieure.
  9. Pliez la greffe (de la section 1) autour de l'AV fémorale exposé, en dessous de la profonde et au-dessus de la bifurcation de l'artère tibiale et AV proneal, et de rejoindre ses extrémités à l'aide 8-0 sutures de soie.
  10. Pour assurer la vascularisation implant par les capillaires qui poussent à partir des vaisseaux fémoraux AV seulement, enroulez un morceau de latex stérilisés autour de la greffe, et de suture avec 6-0 points de suture.
  11. Fermez la peau sus-jacente en utilisant 4-0 sutures de soie.
  12. Surveiller étroitement la souris jusqu'à la récupération de l'anesthésie et chaque jour par la suite, jusqu'à ce que le greffon est transféré comme un rabat. Injecter en sous-cutané de la buprénorphine (concentration finale de 0,05 à 0,1 mg de / kg) deux fois par jour pendant 2-3 jours.
    REMARQUE: Utilisez une solution saline dans un stade, pour éviter la déshydratation du tissu exposé.

4. Transfert Flap

  1. À une oudeux semaines après l'implantation, anesthésier la souris par une injection intraperitoneale de kétamine: xylazine (35 pl / 20 g), en utilisant une seringue à insuline.
  2. Injecter en sous-cutané de la buprénorphine (concentration finale de 0,05 à 0,1 mg de / kg) avant la opperation.
  3. Placer la souris sur une platine chauffée à 37 ° C, pour assurer la température corporelle normale et la fixer à la souris en utilisant un pansement adhésif.
  4. En utilisant des pointes de coton, appliquer lubrification pommade ophtalmique aux yeux de la souris (pour éviter la déshydratation).
  5. En utilisant des pointes de coton, nettoyer le site de l'incision (de la région du genou à l'abdomen) avec de l'iode et ensuite avec 70% d'éthanol, afin d'établir un champ de travail aseptique.
  6. En utilisant une paire de ciseaux et des pinces, ouvrir soigneusement les sutures de la peau et, en utilisant une paire de ciseaux, faire une incision à travers la peau parallèlement au ligament inguinal, continue à travers la peau ventrale.
  7. Retirez délicatement la pièce de latex avec une pince et d'exposer le volet vascularisé.
  8. Utilisation d'un Scissors et forceps, disséquer le lambeau de tissu du tissu environnant.
  9. En utilisant une pince et un porte-aiguille, ligaturer l'extrémité distale de l'AV fémorale avec 8-0 sutures de soie pour prévenir les saignements de l'AV. Ensuite, l'AV cautériser au niveau du genou, de manière distale vers le tissu implanté pliée et les sutures 8-0.
  10. Transférer doucement le AV fémorale enveloppé par la greffe, vers la paroi abdominale ventrale, en évitant d'endommager l'artère, afin de déterminer à quelle distance du défaut de pleine épaisseur doit être faite.
    ATTENTION: Tirer l'artère trop endommager l'artère.
  11. En utilisant une amende ciseaux, faire une incision dans la paroi abdominale ventrale.
  12. Utilisant un ressort ciseaux, faire une incision dans le muscle grand droit de l'abdomen. Supprimer un environ 1 cm x 0,8 cm segment du rectus abdominus muscle avec la peau sus-jacente.
  13. Transférer le AV fémorale, enveloppé par le greffon vascularisé, comme un volet axiale, au défaut de pleine épaisseur dans le abdom ventraleparoi Inal.
  14. Suturer le lambeau de tissu musculaire environnant, en utilisant des sutures en soie 8-0, pour empêcher hernie.
  15. Pour éviter de suturer les organes internes, soulever le muscle avec une pince lors de la suture le volet pour le muscle abdominal. Laissez la peau ventrale exposée à imiter l'effet d'un défaut complet de la paroi abdominale.
  16. Couvrir la plaie dans la peau avec de la gaze iodé et un pansement stérile pour éviter la contamination de la zone exposée.
  17. Suturer la peau de la jambe en utilisant des sutures en soie 4-0.
  18. Surveiller étroitement la souris jusqu'à ce que la récupération de l'anesthésie et par la suite tous les jours, jusqu'à ce que la récupération du volet. Injecter en sous-cutané de la buprénorphine (concentration finale de 0,05 à 0,1 mg de / kg) deux fois par jour pendant 2-3 jours.
  19. REMARQUE: Utilisez une solution saline dans un stade pour éviter la déshydratation du tissu exposé.

5. Ultrason Détermination de perfusion vasculaire du greffon

NOTE: Avant le transfert, la perfusion vasculaire of le greffon est mesurée à une et deux semaines après l'implantation, par échographie.

  1. Anesthésier la souris en utilisant 2% d'isoflurane.
  2. Placer la souris sur une platine mobile chauffé à 38 ° C, pour assurer la température corporelle normale et la fixer à la souris en utilisant un pansement adhésif.
  3. Trouver l'artère et la veine fémorale navires avec transducteur non linéaire définie sur le mode B.
  4. Examiner la perméabilité des vaisseaux fémoraux du greffon à l'aide du capteur fixé sur le mode Doppler couleur.
  5. Préparer un agent de contraste non ciblée selon les instructions du fabricant.
  6. Connecter un cathéter dans la veine caudale (12 cm de tube avec une aiguille de 27 G) à une seringue de 1 ml remplie de sérum physiologique. Fixer la seringue à côté de la souris sur l'étape de chauffage (pour éviter tout mouvement de la seringue).
  7. Branchez le cathéter à la queue de souris veine et fixer l'aiguille.
  8. Injecter un peu de la solution saline à la fois à assurer que les injections sont faites dans la veine et de remplirla tubulure avec une solution saline (pour éviter les bulles d'air).
  9. Remplir une seringue de 1 ml avec 70 pi d'agent de contraste et remplacer la seringue de la seringue avec une solution saline de l'agent de contraste.
  10. Mettre en place les ultrasons à l'injection de l'image de l'agent de contraste. Dans les propriétés de la mode non-linéaire configurer le nombre d'images à 1500 et l'impulsion de la perturbation à 30% des cadres.
    REMARQUE: Après l'impulsion d'interruption, les microbulles re-remplir les récipients à une vitesse qui dépend de la vitesse des microbulles dans les capillaires d'écoulement et est indépendante de la vitesse des microbulles d'injection. Le nombre d'images peut être modifié en fonction du temps de remplissage 19,20.
  11. Injecter lentement l'agent de contraste dans la veine de la queue.
  12. Capturer des images dans le mode de contraste non linéaire du système d'échographie à haute résolution.
  13. Analyser les résultats en utilisant le logiciel, comme décrit précédemment 19,20.
    1. Dessinez une région d'intérêt (ROI) sur l'image obtenue immédiatement après l'impulsion d'interruption dans le mode de contraste. Le retour sur investissement devrait décrire la zone remplie par l'agent de contraste seulement.
    2. Calculer le pic enrichissement (PE), qui est le rapport de l'intensité moyenne du signal non linéaire après l'injection des microbulles par rapport après l'impulsion d'interruption, et est une mesure du volume de perfusion.
    3. Calculer la vitesse d'écoulement, qui est déterminée à partir du temps (T) écoulé jusqu'à ce que le signal de crête (P).

6. Détermination de l'étendue de la vascularisation du greffon

NOTE: L'étendue de la vascularisation greffe de tissu est déterminée une ou deux semaines après l'implantation.

  1. En utilisant une seringue d'insuline, anesthésier les souris par une injection intraperitoneale de kétamine: xylazine (35 pl / 20 g).
  2. En utilisant une seringue de 1 ml, injecter par voie intraveineuse 200 pi de 10 mg / ml de dextrane fluorescéine isothiocyanate de conjugué (FITC-dextrane, PM = 500 000) dans la veine caudale. </ li>
  3. Dix secondes après la fin de l'injection, l'euthanasie souris par dislocation cervicale.
  4. Ouvrez la jambe de la souris et d'exposer le greffon.
  5. Laver la zone de greffe avec du tampon phosphate salin (PBS) et d'appliquer 10% du formol tamponné neutre.
  6. L'image de la greffe dans la patte de la souris, en utilisant un microscope confocal.
  7. Quantifier la densité des vaisseaux fonctionnels (FVD).
    1. Isoler le canal vert (excitation = 488 nm) des images microscopiques confocale.
    2. Passez les images obtenues à travers un filtre passe-haut, afin d'accentuer les structures à contraste élevé.
    3. Utilisez un filtre en éliminant le bruit pour supprimer le bruit qui pourrait avoir été amplifié par le filtre passe-haut.
    4. Mettre en place la valeur de seuil sur l'image résultante; la valeur de seuil est réglée de telle sorte que les caractéristiques et les structures dans l'image d'origine sont visibles dans l'image binaire.
    5. Appliquer une taille-seuil de sorte que seuls les groupes de pixels connectés plus grandes que la SIZ définie seuil de rester dans l'image binaire.
    6. Décrire le squelette des navires dans le greffon en utilisant l'algorithme de Zhang-Suen 21.
    7. Calculer la FVD en additionnant les longueurs de la ligne médiane de chaque récipient et en divisant le résultat par la superficie de la ROI.

7. immunohistologique et histologiques de coloration de la greffe

  1. La coloration immunohistochimique
    1. Après l'imagerie confocale, récupérer le greffon en utilisant un petit ciseaux et des pinces. On dissèque les vaisseaux AV dans les deux extrémités de la greffe et récupérer la greffe.
    2. Fixer les greffes à 10% du formol tamponné neutre pendant 30 min - 2 h.
    3. Placez les greffes dans des cassettes d'histologie et de stocker dans 70% d'éthanol jusqu'à ce que l'inclusion en paraffine.
    4. Incluez dans de la paraffine à l'aide d'une fixation standard et intégrant le protocole 22 et couper les tissus de paraffine dans 5 um tranches en utilisant un microtome. Couper le tissu entier perpendiculairement à l'AVnavires.
    5. Déparaffiner les coupes incluses dans la paraffine par immersion dans du xylène à 100% deux fois, pendant 10 min chacun.
    6. Disposer les lames dans un pot en plastique de 250 ml de Coplin.
    7. Réhydrater par immersion en série dans des concentrations décroissantes d'éthanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% et de l'eau doublement distillée (DDW)) pendant 3 minutes chacun.
    8. Préparer la solution de démasquage antigénique par dilution de 2,35 ml de solution de démasquage antigénique avec 250 ml de DDW. Chauffer la solution de démasquage antigène pendant 2 min dans un four micro-ondes mis à 95 ° C.
    9. Insérer les diapositives dans la solution démasquage antigénique préchauffé et chauffer à nouveau pendant 3 min dans un four micro-ondes mis à 95 ° C. Refroidir les diapositives à 50 ° C.
    10. Chauffer à nouveau pendant 2 min, puis refroidir à la température ambiante.
    11. Incuber les lames dans 3,3% de H 2 O 2 en solution de methanol pendant 10 min, à la température ambiante pour étancher l'activité de la peroxydase endogène, puis rincer deux fois dans du PBS.
    12. Préparer une chambre d'incubation: lieu humide absofeuilles de rbent l'intérieur d'une boîte de l'histologie et sécher les lames à l'aide d'essuie-glaces tâche délicate.
    13. Encerclez la zone de la tranche sur la diapositive à l'aide d'un stylo hydrophobe et incuber pendant 30 min à température ambiante, avec environ 50 pi de sérum de chèvre de solution de blocage (2%, préparée dans du PBS) par tranche.
    14. Diluer le lapin anti-CD31 anticorps à 1:50 dans la solution de blocage, appliquer environ 50 anticorps ul par tranche et incuber O / N, à 4 ° C. Rincer 3 fois avec du PBS, 5 minutes à chaque fois.
    15. Diluer la chèvre biotinylé anti-lapin anticorps secondaire 1: 400 dans du PBS, déroule sur diapositives environ 50 pi d'anticorps par tranche et incuber pendant 30 min à température ambiante.
    16. Rincer 3 fois avec du PBS, 5 minutes à chaque fois.
    17. Diluer streptavidine-peroxydase 1: 400 dans du PBS, appliquer environ 50 pi par tranche et incuber avec toboggans pendant 30 min, à la température ambiante. Rincer 3 fois avec du PBS, 5 minutes à chaque fois.
    18. Appliquer environ 50 pi de aminoéthylcarbazole (AEC) substrat par tranche, selon le fabricant et le #8217; s instructions. Plonger les lames dans DDW pour arrêter la réaction.
    19. Colorer les noyaux en bleu en immergeant les sections dans environ 50 pi de la solution d'hématoxyline de Mayer pendant 2 min. Rincer délicatement dans l'eau, puis couvrir les sections avec un milieu de montage.
    20. Quantifier coloration de CD31-positifs en utilisant une approche à double insu. CD31 coloration apparaît comme une tache brune. Choisissez 4-5 domaines différents dans un champ de visualisation grossissement 40X sous un microscope binoculaire. Comptez le nombre de lumens de CD31-positif.
      1. Calculer le nombre moyen de CD31-positif lumens par échafaudage en divisant le nombre total de lumens comptés avec le nombre de champs et de la fieldarea (selon les données binoculaires).
        REMARQUE: Le volume de réactif appliquée doit être suffisante pour couvrir l'intégralité de la tranche indiqué.
  2. Coloration histologique
    1. Fixer greffes dans 10% du formol tamponné neutre.
    2. Greffes Intégrer dans la paraffine en utilisant la normefixation et des procédures d'enrobage.
    3. Retirer la paraffine à partir des sections de paraffine par immersion dans du xylène à 100% deux fois pendant 10 min.
    4. Lavage jeûne deux fois pour la réhydratation dans 100% d'isopropanol.
    5. Lavage jeûne deux fois 95% d'éthanol.
    6. Laver trois fois dans l'eau du robinet.
    7. Plongez dans l'univers Hematoxylin pendant 10 min.
    8. Laver trois fois dans l'eau du robinet.
    9. Immere dans éosine pendant 2 min.
    10. Lavage rapide déshydrater deux fois dans 95% d'éthanol.
    11. Rapide lavage isopropanol à 100% deux fois.
    12. Rapide lavage 100% xylène deux fois.
    13. Couvrir avec de la colle DPX avec le verre de 1,5 mm d'épaisseur de couverture.
    14. Image en utilisant un microscope à un grossissement de 40X.

8. Propriétés mécaniques évaluation

  1. Récupérer le greffon en utilisant un petit ciseaux et des pinces.
  2. Rincer la greffe dans PBS.
  3. Mesurer la largeur et l'épaisseur de la greffe et calculer la surface en coupe transversale que la largeur multipliée par l'épaisseur.
  4. Nouse l'instrument de test pour générer une courbe contrainte-déformation des greffes hydratés.
    1. Montez la greffe entre les mâchoires de traction du système et de mesurer la longueur finale entre les deux poignées (c.-à-longueur initiale).
    2. Appliquer un taux de 0,01 mm / sec souche, jusqu'à la rupture.
    3. Notez la force et le déplacement développé en utilisant le protocole du fabricant.
    4. Générer une courbe contrainte-déformation dans Matlab.
      1. Calculer souche selon déplacement divisée par la longueur initiale. Le stress est calculée comme la force mesurée divisée par la surface en coupe transversale.
      2. Déterminer la raideur comme la pente de la région linéaire de la courbe contrainte-déformation et le point maximum de la courbe est la résistance à la rupture.

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Representative Results

La vascularisation du greffon et de la perfusion in vivo

Les greffons ont été implantées une ou deux semaines avant leur transfert comme volets axiaux. À une et deux semaines après l'implantation, l'observation brut de la zone de greffe révélé greffes de tissus viables et vascularisées. Ces greffes se sont avérées hautement vascularisé, tel que déterminé par immuno-coloration de CD31 positive (Figure 1A), et très perfusé, comme en témoigne injection veine caudale et les mesures ultrasonores FITC-dextrane. De nombreux navires ont déjà été observés à une semaine post-implantation, un nombre qui a augmenté de façon significative après une semaine supplémentaire dans le voisinage des vaisseaux AV. Détermination de la densité des vaisseaux fonctionnels (FVD) (figure 1B) basée FITC-dextran a montré que la greffe a été très vascularisé à une semaine après l'implantation et que pas de changements significatifs ont eu lieu dans la semaine supplémentaire in vivo. La perméabilité du navire et de la perfusion ont été démontréespar imagerie par ultrasons (la FVD était de 5,71 mm - 1 ± 0,51 mm - 1 et 10,28 mm - 1 ± 2,71 mm - 1, une et deux semaines après l'implantation, respectivement) figure 1C confirmé hôte fémorale perméabilité des vaisseaux et de l'intégrité après implantation du greffon. . De plus, l'examen échographique a révélé perfusion dans la zone de greffe, ce qui est légèrement supérieur à deux semaines après l'implantation, par rapport à une semaine après l'implantation (figure 1D).

Propriétés à rabat

L'examen macroscopique des volets une semaine après-transfert a révélé un tissu viable, vascularisé et bien intégré. Les volets ont subi ferme attachement à leur environnement. Lorsque l'on compare les volets, intégré de cellules pré-vascularisées pour contrôler acellulaire, les greffes non vascularisée, l'ancien a montré des propriétés mécaniques supérieures, qui se manifeste par une augmentation de rigidité et de résistance (

Figure 1
Figure 1. Graft vascularisation. (A) La densité des vaisseaux CD31-positif, mesuré à une et deux semaines après l'implantation par rapport au groupe de contrôle. Toutes les valeurs sont normalisées par rapport à la zone de greffe (mm 2). * = T-test de p <0,05. (B) la densité vasculaire fonctionnelle (FVD) à une et deux semaines après l'implantation. Aucune différence significative n'a été observée, p = 0,08 (T-test). (C) les navires de AV de brevet que imagé en utilisant des ultrasons dans le mode Doppler couleur. Bleu et représen rougest le débit sanguin dans la greffe. Le quadrant jaune délimite la zone de greffe. (D) Graft perfusion à une et deux semaines après l'implantation. (E et F) coloration H & E des volets intégrés avec le tissu hôte: Black Point de l'artère viable de flèche; flèches blanches indiquent les fibres musculaires abdominaux; flèches jaunes pointent échafaudage restes. (G et H) la distribution de dextrane FITC comme illustré par des images de microscopie confocale. Pour toutes les déterminations, la taille de l'échantillon était n ≥ 3 et toutes les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Les propriétés mécaniques du volet 1 semainepost-transfert. (A) La rigidité et (B) de la résistance à la rupture (UTS) des volets. Contrôle signifie une greffe vide sans cellules, les cellules se dresse greffes tri-culture. * = Test T p <0,05, n = 3. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Les progrès de l'ingénierie tissulaire ont été atteints avec une demande croissante pour les tissus de substitution pour la reconstruction de divers types de tissus. Une variété de 1,17,18 synthétiques et biologiques 14-16 matériaux ainsi que les méthodes de fabrication ont été évalués pour leur capacité à répondre à ces demandes. Cependant, malgré les progrès dans les soins cliniques et en ingénierie tissulaire, la restauration des défauts de pleine épaisseur paroi abdominale reste un défi. Un tissu adaptée pour la reconstruction de ces défauts massifs doit être (1) d'épaisseur et (2) vascularisée, et démontrer (3) intégrité mécanique, et (4) la viabilité dans le temps 23.

Ici, nous présentons un protocole détaillé étape par étape pour créer un lambeau de tissu épais, viable et vascularisée, qui peut servir comme une alternative aux rabats de tissu autologue. Le volet fabriqué a été construit en deux étapes: (1) Un échafaudage PLLA / PLGA a été implanté autour des vaisseaux AV du mouse patte arrière et séparé du tissu environnant pour permettre la vascularisation par ces navires AV uniquement. (2) Le vascularisé, lambeau de tissu épais créé a ensuite été transféré avec les vaisseaux AV, qui a servi son pédicule, dans un défaut de pleine épaisseur paroi abdominale.

Rabat bonne vascularisation est essentiel pour son intégration réussie dans le 17,18,24 hôte. Diverses approches pour créer l'ingénierie tissulaire vascularisé afin d'améliorer l'alimentation en oxygène et la diffusion dans les tissus épais, ont été discutés dans la littérature. Parmi ceux-ci étaient des procédés impliquant l'ensemencement de cellules endotheliales (EC) sur les différents types d'échafaudage 13,20,25-30, différentes techniques pour fournir des facteurs angiogéniques au site d'implantation (soit par administration directe par injection, l'utilisation de cellules transformées exprimant des facteurs 31 -34 libération lente ou à partir de différents échafaudages 35,36), l'utilisation de bioréacteurs pour assurer la perfusion de l'ingénierie tissulaire 37 38,39. Ici, la greffe de tissu vascularisé est in vivo, par l'exploitation des navires autologues. La greffe, qui a prouvé viable, vascularisé et perfusé, a ensuite été transféré comme un lambeau de tissu épais pour réparer un défaut de pleine épaisseur paroi abdominale. Une semaine après le transfert, le volet était viable et a présenté une résistance mécanique suffisante pour soutenir les viscères abdominaux. Ici, nous avons utilisé des souris nude athymiques, qui portent une déficience du système immunitaire; l'utilisation de tout autre type de souris ou un autre animal, la possibilité de réactions immunitaires doit être prise en considération (en particulier lors de l'ensemencement des échafaudages avec des cellules). Autres limites de cette technique incluent (1) le transfert de navires AV fémorales, qui alimentent le flux sanguin vers le postérieur. Cependant, la technique laisse la profonde et les vaisseaux fémoraux profonds intact et aucune ischémie des membres postérieurs a été observée après le transfert de lambeau. En outre, dans de plus grands animaux et chez l'homme, l'utilisation devaisseaux périphériques seront conseillés car ils sont redondants dans le corps; (2) le temps nécessaire pour atteindre la vascularisation adéquate avant de battre le transfert, peut être un facteur limitant dans les cas urgents; et (3) la création d'rabat est effectuée in vivo, ce qui peut limiter sa pertinence chez l'homme. Dans l'avenir, nous visons à développer un moyen de créer ce volet ex vivo. L'avantage de la méthode présentée réside dans la capacité à améliorer la formation d'un tissu autologue (avec des cellules autologues) autour de l'échafaud. Le tissu résultant présente une alternative appropriée à un lambeau de tissu autologue. En outre, l'échafaudage peut être ensemencé avec des cellules autologues avant l'implantation, pour améliorer encore la vascularisation du greffon et l'intégration dans le tissu hôte. L'utilisation de cellules autologues et un échafaudage biodégradable et biocompatible, peut contourner le risque substantiel de réactions immuno-rejet et de présenter une alternative aux rabats autologues tout en évitant la récolte et post-opératoire scarification.

Le procédé décrit peut traduit en expériences dans les grands animaux et élargi à des essais cliniques chez les humains. En outre, il peut être traduit de réparer divers tissus endommagés dans le corps. Chez l'homme et chez les gros animaux, les rabats peuvent être générés autour des vaisseaux périphériques à la place des sur les vaisseaux fémoraux AV.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

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References

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Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

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