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Bioengineering

Engineered Vaskularisierte Muskellappen

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

Bauchwanddefekte entstehen oft nach schweren Traumata, Krebsbehandlung, Verbrennungen und Entfernung infizierter mesh. Diese Fehler beinhalten häufig erhebliche Gewebeverlust, komplizierte chirurgische Eingriffe und präsentiert eine große Herausforderung für die plastische Wiederherstellung Chirurgen 1-4. Tissue Engineering Forscher der Suche nach neuen Quellen für künstliche Gewebe haben unterschiedliche Materialien, Zellquellen und Wachstumsfaktoren untersucht. Erfolgreiche Restaurationen aus verschiedenen Geweben, wie zum Beispiel 5,6 Trachea, der Blase 7, 8 Kornea, Knochenhaut 9 und 10 durch Implantation von technischen Geweben wurden bereits berichtet. Jedoch die Herstellung einer dicken vaskularisierten technisch hergestellte Gewebe, insbesondere zur Rekonstruktion von großen Defekten, bleibt eine große Herausforderung im Tissue Engineering.

Eine der wichtigsten Faktoren, die die Dicke eines lebensfähigen Gewebekonstrukt wird die Steuerung der Sauerstoffversorgung auf seine Nachteiletituent Zellen. Beim Rückgriff auf Diffusion konstruieren Dicke ist auf der von einer sehr dünnen Schicht. Der maximale Abstand zwischen Sauerstoff- und Nährstoff-Zufuhr Kapillaren in vivo etwa 200 um, die mit der Diffusionsgrenzsauerstoff 11,12 korreliert. Unzureichende Vaskularisierung in Gewebeischämie führen und zu eskalieren zu Gewebeabbau oder Nekrose 13.

Darüber hinaus müssen die für die Geweberekonstruktion verwendet ideales Material biokompatibel und nicht-immunogen sein. Es muss auch in der Lage, die weitere Integration von Wirtszellen mit dem Biomaterial und die strukturelle Integrität zu gewährleisten. Verschiedene biologische 14-16 und synthetische 1,17,18 Matrizen wurden zuvor zum Wiederaufbau von Gewebe untersucht, aber ihre Verwendung bleibt wegen des Mangels an wirksamen Blutversorgung, Infektionen oder unzureichende Gewebefestigkeit begrenzt.

In dieser Studie wurde ein biokompatibles, zell embedded Gerüst der Food and Drug Administration (FDA) -zugelassene Poly-L-Milchsäure (PLLA) / Polymilchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) umfasste, wurde um die Arteria und Vena femoralis (AV) Schiffe mit einer nackten Maus implantiert und getrennt von dem umgebenden Gewebe, wodurch Vaskularisierung nur aus den AV Gefäße. Eine Woche nach der Implantation war das Transplantat lebensfähigen, dick und gut vaskularisiert. Diese dicke vaskularisiertes Gewebe mit den AV Gefäße, wurde dann als gestielten Lappen zu einer Bauch voller Dicke Defekt in der gleichen Maus übertragen. Eine Woche nach der Übertragung wurde die Klappe lebensfähigen, vaskularisiert und gut mit dem umgebenden Gewebe integriert, wobei eine ausreichende Festigkeit, um Bauchorgane zu unterstützen. Somit ist die technisch stark, vaskularisierten Gewebelappen, wobei eine autologe Stiel, stellt ein neues Verfahren für die Reparatur von voller Dicke Bauchwanddefekte.

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Protocol

Alle tierexperimentellen Studien wurden vom Ausschuss der Ethik der Tierversuche des Technion genehmigt. Für dieses Verfahren wurden athymischen nackten Mäusen verwendet, um eine immunologische Abstoßung zu vermeiden. Bei Verwendung eines anderen Typs von Maus sollten die Mäuse rasiert vor dem chirurgischen Eingriff und Verabreichung von Cyclosporin (oder eines anderen anti-Abstoßung Ersatz) empfohlen werden.

1. Gerüst Vorbereitung und Handy Einbetten

  1. Vorbereitung Gerüste bestehend aus 1: 1-Mischung von Poly-L-Milchsäure (PLLA) und Polymilchsäure-co-Glykolsäure (PLGA), in der folgenden Weise:
    1. Auflösen 500 mg PLLA und 500 mg PLGA in 10 ml Chloroform.
    2. Hinzufügen 0,24 ml Polymerlösung zu 0,4 g Natriumchlorid-Teilchen in einer Teflonformen gesammelt. Verwenden Sie einen Salzmesser von 212 bis 600 & mgr; m. Lassen Sie das Chloroform zu O / N verdampfen.
    3. Leach das Salz unter Verwendung von destilliertem Wasser führt zu vernetzten porösen 3D-Gerüsten.
    4. Geschnitten Polymerstückemit einer Schere, dann in 70% Ethanol (v / v) einweichen für 30 Minuten und waschen 3 Mal in PBS für 2 Minuten vor der Verwendung.
  2. Vorbereitung einer tri-Kultur der folgenden Zellen in 1: 1 Endothelzellmedium (EGM-2 mit den Komponenten seiner Kugel Kit und Muskelzellmedium (Dulbeccos minimal essential medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS ), 2,5% HEPES-Puffer, 100 U / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin (Pen-Strep-Lösung).
    1. Verwenden 0,5 x 10 6 C2C12 Myoblasten, 0,9 × 10 6 menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) und 0,2 x 10 6 normale humane Hautfibroblasten (NHDF).
  3. Mischen der Zellen miteinander in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 4 min, saugt den mittleren und Resuspendieren des Pellets in einer Mischung von 4 ul eiskaltem extrazellulären Matrixlösung und 4 ul Zellmedium.
  4. Schneiden Sie ein Stück von 10 mm x 7 mm x 1 mm (Länge x Breite x Dicke) PLLA / PLGEin Gerüst und Samen der Zellsuspension in einer Platte mit 6 Vertiefungen, lassen die extrazelluläre Matrix-Lösung zu verfestigen (30 min, 37 ° C, 5% CO 2) vor der Zugabe von 4 ml Zellmedium.
  5. Vor der Implantation die Gerüste für zehn Tage inkubieren, und ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag.

2. Vor dem Start des chirurgischen Eingriffs

  1. Vorzubereiten und zu sterilisieren (Autoklav) folgende chirurgische Instrumente: eine kleine, feine, gerade Schere, eine Feder Schere, gerade, spitzen Pinzette, einer gezahnten Pinzette und einem Nadelhalter.
  2. Vorbereitung einer Mischung aus Ketamin: Xylazin Lösung in einem Mikrozentrifugen-Röhrchen hergestellt, indem 425 ul Ketamin und Xylazin 75 ul in einer 1 ml-Spritze.
  3. Verdünnte 0,3 mg / ml Buprenorphin in steriler Kochsalzlösung (1,20).

3. Flap Construction (Graft-Implantation)

  1. Verwendung einer Insulinspritze, betäuben die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin: Xylazin (35 ul pro20 g Körpergewicht).
  2. Subkutan injizieren Buprenorphin (Endkonzentration von 0,05-0,1 mg / kg) vor dem direkten Betrieb.
  3. Platzieren Sie die Maus auf einer Bühne auf 37 ° C erhitzt, auf die normale Körpertemperatur zu gewährleisten, und befestigen Sie dann die Maus mit einem Klebstoff Bandage.
  4. Verwenden Baumwollspitzen, zu verwalten Schmieraugensalbe, um die Augen der Maus (um Austrocknung zu vermeiden).
  5. Verwenden Baumwollspitzen, sauber die Einschnittstelle mit Jod und dann mit 70% Ethanol, um eine aseptische Arbeitsfeld zu etablieren.
  6. Mit Hilfe von kleinen Schere und Pinzette, einen Einschnitt durch die Haut, von der Höhe der Knie bis zum Leistenband, parallel zu den Schenkelgefäße, bis der Arteria und Vena femoralis (AV) Gefäße ausgesetzt sind.
  7. Halten Sie die Haut nach unten mit einem Aufroller, um einen besseren Zugang zu dem Gewebe zu gewinnen.
  8. Verwendung von Feder Schere und Pinzette, sorgfältig isolieren die Arteria und Vena femoralis Gefäße aus dem umgebenden Gewebe. Starten Sie von der Ebene des Leisten ligAment zu der Bifurkation der überlegenen epigastrischen Gefäße. Verlassen Sie die profunda unberührt, um den Blutfluss in dem Bein zu erhalten und zu verhindern nachfolgende Ischämie.
  9. Falten Sie das Transplantat (von Abschnitt 1) ​​um den freiliegenden Schenkel AV, unter dem profunda und oberhalb der Bifurkation in die Tibia und proneal AV, und kommen Sie mit seinen Enden mit 8-0 Seidenfäden.
  10. Implantatdurchblutung durch die Kapillaren sprießen aus nur den Oberschenkel AV Schiffe zu gewährleisten, wickeln Sie ein Stück sterilisiert Latex um das Transplantat, und Naht mit 6-0 Nähten.
  11. Schließen Sie die darüber liegende Haut mit 4-0 Seidenfäden.
  12. Überwachen Sie die Maus, bis eng Erholung von der Anästhesie und jeden Tag danach, bis das Transplantat als Klappe übertragen. Subkutan injizieren Buprenorphin (Endkonzentration von 0,05-0,1 mg / kg) zweimal täglich für 2-3 Tage.
    HINWEIS: Verwenden Sie Kochsalzlösung in jeder Phase, um eine Austrocknung des freiliegenden Gewebes zu vermeiden.

4. Flap Überweisung

  1. An einem oderzwei Wochen nach der Implantation, zu betäuben die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin: Xylazin (35 ul / 20 g) unter Verwendung einer Insulinspritze.
  2. Subkutan injizieren Buprenorphin (Endkonzentration von 0,05-0,1 mg / kg) vor dem direkten Betrieb.
  3. Platzieren Sie die Maus auf einer Bühne auf 37 ° C erhitzt, auf die normale Körpertemperatur zu gewährleisten, und befestigen Sie dann die Maus mit einem Klebstoff Bandage.
  4. Verwenden Baumwollspitzen, gelten Schmieraugensalbe, um die Augen der Maus (um Austrocknung zu vermeiden).
  5. Verwenden Baumwollspitzen, reinigen Sie die Einschnittstelle (von der Kniebereich auf den Bauch) mit Jod und dann mit 70% Ethanol, um eine aseptische Arbeitsfeld zu etablieren.
  6. Mit einer Schere und Pinzette, öffnen Sie vorsichtig die Fäden in der Haut und, mit einer Schere, einen Einschnitt durch die Haut parallel zum Leistenband, weiter durch die Bauchhaut.
  7. Das Latex Stück mit einer Pinzette vorsichtig entfernen und setzen die vaskularisierten Lappen.
  8. Mit Hilfe eines SCISSors und Pinzetten, sezieren die Gewebelappen aus dem umgebenden Gewebe.
  9. Mit einer Pinzette und einen Nadelhalter, zu ligieren, das distale Ende des Oberschenkel AV mit 8-0 Seidennähten Blutungen aus dem AV zu vermeiden. Dann Kauterisieren des AV auf der Höhe des Knies, distal in die gefaltete implantierte Gewebe und dem 8-0 Nähte.
  10. Übertragen Sie leicht den Oberschenkel AV durch das Transplantat umgeben, in Richtung des ventralen Abdominalwand, Vermeidung von Schäden an der Arterie, um zu bestimmen, an dem der Abstand der volle Dickenfehler vorgenommen werden sollen.
    ACHTUNG: Ziehen Sie die Arterie zu weit wird die Arterie beschädigt werden.
  11. Mit einer feinen Schere, einen Einschnitt in der ventralen Bauchwand.
  12. Verwendung einer Feder Schere, einen Einschnitt in der Rektusabdominis Muskel. Entfernen Sie eine ca. 1 cm x 0,8 cm Segment der Rektusabdominis Muskeln mit der darüberliegenden Haut.
  13. Übertragen Sie die Oberschenkel AV, durch die gefäß Graft eingehüllt, als axiale Klappe, in die gesamte Dicke Defekt in der Bauch Abdominal Wand.
  14. Naht der Klappe zu dem umgebenden Muskelgewebe, mit 8-0 Seidenfäden, um Bruch zu verhindern.
  15. Um Nähen die inneren Organe zu vermeiden, heben Sie den Muskel mit einer Pinzette, wenn Vernähen der Klappe an der Bauchmuskulatur. Verlassen Sie die Bauchhaut, um den Effekt einer vollständigen Bauchwanddefekt imitieren ausgesetzt.
  16. Abdeckung der Wunde in der Haut mit iodierten Gaze und einem sterilen Verband, um eine Verunreinigung der freiliegenden Bereich zu verhindern.
  17. Naht der Haut des Beines mit 4-0 Seidenfäden.
  18. Überwachen Sie die Maus, bis eng Erholung von der Anästhesie und jeden Tag danach, bis zum Abruf der Klappe. Subkutan injizieren Buprenorphin (Endkonzentration von 0,05-0,1 mg / kg) zweimal täglich für 2-3 Tage.
  19. HINWEIS: Verwenden Sie Kochsalzlösung in jedem Stadium zur Dehydratisierung der freiliegenden Gewebes zu vermeiden.

5. Ultraschall Bestimmung des Gefäßdurchblutung der Graft

HINWEIS: Vor dem Transfer, Gefäßperfusion of das Transplantat bei einer und zwei Wochen nach der Implantation mit Ultraschall gemessen.

  1. Betäuben die Maus mit 2% Isofluran.
  2. Platzieren Sie die Maus auf einer beweglichen Bühne auf 38 ° C erhitzt, auf die normale Körpertemperatur zu gewährleisten, und befestigen Sie dann die Maus mit einem Klebstoff Bandage.
  3. Finden Sie die Arteria und Vena femoralis Gefäße mit nicht-linearen Wandler auf dem B-Modus eingestellt.
  4. Überprüfen Sie die Durchgängigkeit der Femoralgefäße des Transplantats unter Verwendung des Wandlers auf der Farb-Doppler-Modus eingestellt.
  5. Vorbereitung nicht-spezifischer Kontrastmittel nach den Anweisungen des Herstellers.
  6. Verbinden einer Schwanzvenenkatheter (12 cm Schlauch mit einer 27 G-Nadel) in eine 1 ml Spritze, die mit Kochsalzlösung gefüllt. Sichern die Spritze neben der Maus auf dem Heiztisch (um eine Bewegung der Spritze zu vermeiden).
  7. Verbinden Sie den Katheter an die Maus Schwanzvene und sichern Sie die Nadel.
  8. Spritzen Sie etwas von der Kochsalzlösung, um sowohl sicherzustellen, dass Injektionen werden in die Vene und zu füllen gemachtder Schlauch mit Kochsalzlösung (um Luftblasen zu vermeiden).
  9. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 70 ul von Kontrastmittel und ersetzen Sie die Kochsalzlösungsspritze mit dem Kontrastmittel-Spritze.
  10. Einrichten der Ultraschall zur Bild Injektion des Kontrastmittels. In Eigenschaften des nicht-linearen Modus Einrichten der Anzahl von Rahmen bis 1500 und die Störung Puls bis 30% der Aufnahmen.
    HINWEIS: Nach der Unterbrechung Impulses die Mikrobläschen erneut füllen die Behälter mit einer Geschwindigkeit, die der Fließgeschwindigkeit der Mikrobläschen in den Kapillaren abhängt und unabhängig von der Einspritzrate der Mikrobläschen. Die Anzahl der Rahmen kann nach der Füllzeit 19,20 verändert werden.
  11. Spritzen Sie das Kontrastmittel in die Schwanzvene.
  12. Machen Sie Bilder in der nichtlinearen Kontrastmodus der hochauflösenden Ultraschallsystem.
  13. Analysieren Sie die Ergebnisse mit Hilfe der Software, wie zuvor beschrieben, 19,20.
    1. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) auf dem erhaltenen Bild imunmittelbar nach der Unterbrechung Impuls in der Kontrastmodus. Der ROI ist die Fläche nur durch das Kontrastmittel gefüllt zu skizzieren.
    2. Berechnung der Überhöhungs (PE), welches das Verhältnis der mittleren Intensität des nicht-linearen Signals nach dem Einspritzen der Mikrobläschen gegenüber nach der Unterbrechung Impuls und ist ein Maß für die Durchblutungsvolumens.
    3. Berechnung der Durchflussmenge, die aus der Zeit (T), die bis zum Peak-Signal (P) verstreicht, bestimmt wird.

6. Bestimmung des Ausmaßes der Graft Vaskularisation

HINWEIS: Das Ausmaß der Gewebetransplantat Vaskularisation ist ein oder zwei Wochen nach der Implantation bestimmt.

  1. Verwendung einer Insulinspritze, betäuben die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin: Xylazin (35 ul / 20 g).
  2. Verwendung von 1-ml-Spritze, intravenös zu injizieren 200 ul 10 mg / ml Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Dextran (FITC-Dextran, MG = 500.000) in die Schwanzvene. </ li>
  3. Zehn Sekunden nach der Beendigung der Injektion euthanize die Maus durch zervikale Dislokation.
  4. Öffnen Sie das Bein der Maus und setzen das Transplantat.
  5. Mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Waschen Sie die Transplantatbereich und gelten 10% neutral gepuffertem Formalin.
  6. Bild das Transplantat in der Maus Bein, mit einem konfokalen Mikroskop.
  7. Quantifizierung funktionellen Gefäßdichte (FVD).
    1. Isolieren Sie den grünen Kanal (Anregung = 488 nm) der konfokalen mikroskopischen Bildern.
    2. Leitet die resultierenden Bilder, die durch ein Hochpassfilter, um die kontrastreiche Strukturen betonen.
    3. Verwenden ein Filter zum Entfernen von Flecken, um Geräusche, die durch das Hochpassfilter verstärkt worden sind, beseitigt werden.
    4. Richten Sie den Wert der Schwelle auf dem resultierenden Bild; der Schwellenwert wird so eingestellt, dass die Funktionen und Strukturen in dem Originalbild in dem binären Bild sichtbar sind.
    5. Tragen Sie eine Größe-Schwelle, so dass nur Gruppen von verbundenen Pixeln größer als der definierte size Schwelle bleiben in dem binären Bild.
    6. Skizzieren Sie das Skelett der Gefäße im Transplantat mit der Zhang-Suen Algorithmus 21.
    7. Errechnen FVD durch Summieren der Längen der Mittellinie des Schiffes übereinstimmen, und Dividieren des Ergebnisses durch die Fläche der ROI.

7. Immunhistologische und histologischen Färbung des Transplantats

  1. Immunhistologische Färbung
    1. Nach konfokale Bildgebung, Abrufen des Transplantats mit einem kleinen Schere und Pinzette. Sezieren die AV Gefäße in den beiden Enden des Transplantats und Abrufen des Transplantats.
    2. Befestigen Sie die Transplantate in 10% neutral gepuffertem Formalin für 30 min - 2 h.
    3. Legen Sie die Transplantate in der Histologie Kassetten und Store in 70% Ethanol, bis Paraffineinbettung.
    4. In Paraffin mit einem Standard-Fixierung und Einbettung Protokoll 22 einzubetten und in Scheiben in Paraffin eingebetteten Gewebe in 5 & mgr; m Schnitte mit einem Mikrotom. Schneiden Sie die ganze Gewebe senkrecht zu der AVSchiffe.
    5. Entparaffinieren in Paraffin eingebetteten Schnitten durch Eintauchen in 100% Xylol zweimal je 10 min.
    6. Die Objektträger in einem 250 ml Kunststoff Coplin-Gefäß.
    7. Rehydrieren durch serielle Immersionen in abnehmenden Konzentrationen von Ethanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% und doppelt destilliertem Wasser (DDW)) für jede 3 min.
    8. Vorbereitung Antigendemaskierung durch Verdünnen von 2,35 ml Antigendemaskierung Lösung mit 250 ml DDW. Erhitzen Sie die Antigen-Demaskierung Lösung für 2 Minuten in der Mikrowelle bis 95 ° C eingestellt.
    9. Legen Sie die Dias in den vorgeheizten Antigen Demaskierung Lösung und Wärme noch einmal für 3 Minuten in der Mikrowelle bis 95 ° C eingestellt. Kühlen Sie die Folien bis 50 ° C.
    10. Erhitzen Sie erneut 2 Minuten und dann auf RT abkühlen.
    11. Die Folien inkubieren in 3,3% H 2 O 2 in Methanol für 10 min bei RT, um die Aktivität der endogenen Peroxidase quenchen und dann zweimal in PBS spülen.
    12. Bereiten Sie eine Inkubationskammer: Ort nassen absorbent Blätter in einem histologischen Box und trocknen Sie die Folien mit heiklen Aufgabe Wischer.
    13. Kreisen Sie die Slice-Bereich auf dem Objektträger unter Verwendung einer hydrophoben Stift und Inkubation für 30 min bei RT, mit etwa 50 & mgr; l Ziegenserum Blockierungslösung (2%, in PBS) pro Scheibe.
    14. Verdünnen Sie die Kaninchen-Anti-CD31-Antikörpers 01.50 in Blockierungslösung, gelten etwa 50 & mgr; l Antikörper pro Scheibe und Inkubation O / N, bei 4 ° C. Spülen 3 mal mit PBS, je 5 min.
    15. Verdünnen Sie die biotinyliertem Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper 1: 400 in PBS, Platz über Folien etwa 50 & mgr; l Antikörper pro Scheibe und Inkubation für 30 min bei RT.
    16. Spülen 3 mal mit PBS, je 5 min.
    17. Verdünnte Streptavidin-Peroxidase-1: 400 in PBS, gelten etwa 50 & mgr; l pro Scheibe und Inkubation mit Rutschen für 30 min bei RT. Spülen 3 mal mit PBS, je 5 min.
    18. Übernehmen ungefähr 50 & mgr; l Aminoethylcarbazol (AEC) Substrat pro Scheibe, laut Hersteller & #8217; s-Anweisungen. Tauchen Sie die Folien in DDW, um die Reaktion zu stoppen.
    19. Färben die Kerne in blau durch Eintauchen der Abschnitte in etwa 50 ul Mayers Hämatoxylin-Lösung für 2 min. Sanft in Wasser abspülen und dann bedecken Sie die Abschnitte mit Eindeckmedium.
    20. Quantifizieren, CD31-positive Färbung mit Hilfe eines doppelblinden Ansatz. CD31-Färbung erscheint als ein brauner Fleck. Wählen Sie 4-5 verschiedene Felder in einem 40-facher Vergrößerung Sichtfeld unter einem Binokular. Zählen Sie die Anzahl der CD31-positiven Lumen.
      1. Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von CD31-positiven Lumen pro Gerüst durch Dividieren der Gesamtzahl der gezählten Lumen mit der Anzahl der Felder und dem fieldarea (nach den binokularen Daten).
        HINWEIS: Die aufgebrachte Reagenzienvolumen muss ausreichend sein, um die gesamte umrissen Scheibe decken.
  2. Histologischen Färbung
    1. Fix Transplantate in 10% neutral gepuffertem Formalin.
    2. Einbetten Transplantate in Paraffin unter Verwendung von StandardFixierung und Einbettung Verfahren.
    3. Entfernen des Paraffins aus der in Paraffin eingebetteten Schnitten durch Eintauchen in 100% Xylen zweimal 10 min.
    4. Schnelle Wäsche zweimal für Rehydrierung in 100% Isopropanol.
    5. Schnelle Wäsche zweimal 95% Ethanol.
    6. Dreimal mit Leitungswasser zu waschen.
    7. Tauchen Sie ein in Hämatoxylin für 10 min.
    8. Dreimal mit Leitungswasser zu waschen.
    9. Immere in Eosin für 2 min.
    10. Schnelle Wasch entwässern in 95% Ethanol zweimal.
    11. Schnelle Wäsche 100% Isopropanol zweimal.
    12. Schnelle Wäsche 100% Xylol zweimal.
    13. Deckel mit DPX Kleber mit Deckglas 1,5 mm dick.
    14. Bild mit Mikroskop in 40-facher Vergrößerung.

8. Mechanische Eigenschaften Beurteilung

  1. Abrufen des Transplantats mit einem kleinen Schere und Pinzette.
  2. Spülen Sie das Transplantat in PBS.
  3. Die Breite und Dicke des Transplantats und die Berechnung der Querschnittsfläche, wie durch die Dicke multipliziert Breite.
  4. Unse die Testinstrument, um eine Spannungs-Dehnungskurve von hydratisiertem Transplantate zu generieren.
    1. Montieren Sie das Transplantat zwischen den System Zug- Griffe und messen die endgültige Länge zwischen den beiden Griffen (dh Ausgangslänge).
    2. Tragen Sie eine Verformungsgeschwindigkeit von 0,01 mm / s, bis zum Versagen.
    3. Notieren Sie sich die entwickelte Kraft und mit dem Protokoll des Herstellers.
    4. Generieren Sie eine Spannungs-Dehnungskurve in Matlab.
      1. Berechnen Stamm nach Verschiebung, dividiert durch die ursprüngliche Länge. Stress als die gemessene Kraft dividiert durch die Querschnittsfläche berechnet.
      2. Bestimmen Steifigkeit als die Steigung des linearen Bereichs der Spannungs-Dehnungs-Kurve und dem Maximalpunkt der Kurve ist die Zugfestigkeit.

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Representative Results

Graft Vaskularisation und Perfusion in vivo

Die Transplantate wurden ein oder zwei Wochen vor ihrer Übertragung als axiale Klappen implantiert. Bei einer und zwei Wochen nach der Implantation, der groben Beobachtung des Transplantatbereich enthüllt lebensfähig und vaskularisierten Gewebetransplantate. Diese Transplantate nachgewiesen gefäß zu sein, wie durch positive Immunfärbung CD31 (1A) bestimmt ist, und stark durchbluteten, wie von FITC-Dextran-Injektion in die Schwanzvene und Ultraschallmessungen belegt. Viele Schiffe wurden bereits in einwöchigen nach der Implantation, eine Zahl, die wesentlich nach einer weiteren Woche in der Nähe der AV Gefäße stieg beobachtet. FITC-Dextran-basierte Bestimmung der funktionellen Gefäßdichte (FVD) (1B) zeigte, dass das Transplantat hoch in einwöchigen Implantation und dass keine wesentlichen Veränderungen erfolgte im weiteren Woche in vivo vaskularisiert. Gefäßdurchlässigkeit und Durchblutung wurden gezeigt,durch Ultraschall-Bildgebung (der FVD war 5,71 mm - 1 ± 0,51 mm - 1 und 10,28 mm - 1 ± 2,71 mm - 1, einer und zwei Wochen nach der Implantation, respectively) 1C bestätigt Host Oberschenkelgefäßdurchgängigkeit und Integrität nach Graft-Implantation. . Außerdem Ultraschalluntersuchung ergab, Perfusion innerhalb der Transplantatbereich, der im Vergleich zu einer Woche nach der Implantation (1D) etwas höher war 2 Wochen nach der Implantation.

Flap Eigenschaften

Gross Prüfung der Klappen 1 Woche nach der Übertragung ergeben, eine tragfähige, vaskularisiert und gut integriert Gewebe. Die Klappen unterzog feste Verbindung zu ihrer Umgebung. Beim Vergleich der pre-vaskularisierten, zell eingebettet Klappen azellulären, nonvascularized Transplantate Kontrolle zeigte der ehemalige legene mechanische Eigenschaften, wie durch eine erhöhte Steifigkeit und Festigkeit (manifestiert

Abbildung 1
Abbildung 1. Graft Vaskularisierung. (A) Die Dichte der CD31-positiven Gefäße, bei einer und zwei Wochen nach der Implantation gemessen Vergleich zur Kontrollgruppe. Alle Werte sind normalisiert auf das Pfropf-Fläche (mm 2). * = T-Test p <0,05. (B) funktionelle Gefäßdichte (FVD) bei einer und zwei Wochen nach der Implantation. Kein signifikanter Unterschied beobachtet, p = 0,08 (T-Test). (C) Patent AV Gefäße wie abgebildet mit Hilfe von Ultraschall in der Farb-Doppler-Modus. Blaue und rote Vertret die Durchblutung des Transplantats. Die gelbe Quadrant beschreibt die Transplantatbereich. (D) Graft Perfusion bei einer und zwei Wochen nach der Implantation. (E und F) H & E-Färbung der mit dem Wirtsgewebe integriert Klappen: schwarzer Pfeil Punkt tragfähige Arterie; weißen Pfeile zeigen Bauch Muskelfasern; gelben Pfeile zeigen Gerüstresten. (H und G) FITC-Dextran Verteilung, wie durch konfokale Mikroskopie Bilder gezeigt. Für alle Bestimmungen wurde die Stichprobengröße n ≥ 3 und alle Werte werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Mechanische Eigenschaften der Klappe 1 Wochenach der Übertragung. (A) Die Steifigkeit und (B) die Reißfestigkeit (UTS) der Klappen. Steuer steht eine leere Transplantat ohne Zellen, steht Zellen Tri-Kultur Transplantate. * = T-Test p <0,05, n = 3. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Fortschritte im Tissue Engineering haben mit einer wachsenden Nachfrage nach Ersatzgewebe für den Wiederaufbau von verschiedenen Gewebetypen erfüllt. Eine Vielzahl von synthetischen und biologischen 1,17,18 14-16 Materialien sowie Herstellungsverfahren wurden für ihre Fähigkeit, diesen Anforderungen gerecht beurteilt. Trotz der Fortschritte in der klinischen Versorgung und im Tissue Engineering, die Wiederherstellung der vollen Dicke Bauchwanddefekten bleibt jedoch eine Herausforderung. Ein Gewebe ausreichend für die Wiederherstellung solcher massiven Mängeln muss (1) dick und (2) vaskularisiert und zeigen (3) mechanische Integrität, und (4) Überlebensfähigkeit im Laufe der Zeit 23.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt detailliertes Protokoll zur Erzeugung von dichtem, lebensfähigen und vaskularisierten Gewebelappen, die als Alternative zur autologen Gewebelappen dienen kann. Die hergestellte Klappe wurde in zwei Schritten aufgebaut: (1) Eine PLLA / PLGA-Gerüst wurde um die AV Gefäße des mou implantiertse hindlimb und vom umgebenden Gewebe getrennt, um die Vaskularisierung von nur AV Gefäße ermöglichen. (2) Die erstellte vaskularisierten, dicke Gewebelappen wurde dann mit den AV Gefäße, die als Stiel serviert, zu einem Full-Dicke Bauchwanddefekt übertragen.

Proper Klappendurchblutung ist wichtig für die erfolgreiche Integration in das Wirts 17,18,24. Verschiedene Ansätze zur vaskularisierten technisch hergestellte Gewebe zur Verbesserung der Sauerstoffversorgung und Diffusion in dicke Gewebe zu erzeugen, sind in der Literatur diskutiert worden. Unter diesen waren Verfahren, die Aussaat von Endothelzellen (ECs) an verschiedenen Gerüsttypen 13,20,25-30 verschiedene Techniken zum angiogenen Faktoren zu der Implantationsstelle zu liefern (entweder durch direkte Verabreichung durch Injektion, die Verwendung von transformierten Zellen, die die Faktoren 31 -34 oder langsame Freisetzung aus verschiedenen Gerüsten 35,36), die Verwendung von Bioreaktoren entwickelt Gewebedurchblutung 37 sicherzustellen, 38,39. Hier wurde die Gewebetransplantat in vivo vaskularisiert durch Ausnutzung autologe Gefäße. Das Transplantat, das lebensfähige, vaskularisierten bewährt und durchströmt, wurde dann als eine dicke Gewebelappen übertragen, um ein Vollhautbauchwand Defekt zu reparieren. Eine Woche nach der Übertragung wurde die Klappe lebensfähig und funktions ausreichende mechanische Festigkeit, um die Bauchorgane zu unterstützen. Hier haben wir athymischen Nacktmäusen, die Störungen des Immunsystems zu tragen; als mit irgendeinem anderen Typ von Maus oder einem anderen Tier, sollte die Möglichkeit von Immunreaktionen in Betracht gezogen werden (insbesondere bei der Aussaat der Gerüste mit Zellen). Andere Beschränkungen dieser Technik umfassen (1) die Übertragung von AV Oberschenkelgefäße, die den Blutfluss in den Hinterlauf zuzuführen. Allerdings lässt die Technik der profunda und die tiefen Oberschenkelgefäße unberührt und keine Ischämie der Hintergliedmaßen wurde nach Klappentransfer beobachtet. Darüber hinaus ist in größeren Tieren als auch bei Menschen, die Verwendung vonperipheren Gefäße wird empfohlen, da sie redundante im Körper sind; (2) die erforderliche Zeit zur Erreichung ausreichender Vaskularisierung vor der Übertragung Klappe kann ein limitierender Faktor in dringenden Fällen zu sein; und (3) Klappe Schöpfung in vivo durchgeführt, die ihre Relevanz beim Menschen beschränken können. In Zukunft wollen wir ein Mittel zur Schaffung dieser Klappe ex vivo zu entwickeln. Der Vorteil des vorgestellten Verfahrens liegt in der Fähigkeit, die Bildung eines Eigengewebe (mit autologen Zellen) um das Gerüst zu verbessern. Das resultierende Gewebe stellt eine geeignete Alternative zu einem autologen Gewebelappen. Darüber hinaus kann das Gerüst mit autologen Zellen vor der Implantation ausgesät werden, um Transplantat-Vaskularisierung und Integration in das Wirtsgewebe weiter zu verbessern. Verwendung von autologen Zellen und einem biologisch abbaubaren und biokompatiblen Gerüst, die erhebliche Gefahr von Immunabstoßungsreaktionen zu umgehen und eine Alternative zur autologen Klappen unter Vermeidung der Ernte und postoperative scarifiKation.

Das beschriebene Verfahren kann um Experimente in großen Tieren übersetzt und auf klinische Studien am Menschen erweitert. Darüber hinaus kann sie übersetzt werden, um verschiedene beschädigte Gewebe im Körper zu reparieren. Bei Menschen und bei großen Tieren kann die Lappen rund peripheren Gefäßen statt auf dem Oberschenkel AV Gefäßen erzeugt werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

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References

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Bioengineering Heft 107 Klappe Tissue Engineering Gerüst Vaskularisation Maus-Modell vaskularisierten Gewebe Muskeln
Engineered Vaskularisierte Muskellappen
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Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

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