Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Konstruert vaskulariserte Muscle Flap

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

Bukveggen defekter ofte oppstå etter alvorlige traumer, kreftbehandling, brannsår og fjerning av infisert mesh. Disse feilene ofte innebære betydelig vevstap, krever kompliserte kirurgiske prosedyrer og presentere en stor utfordring for plast gjenoppbygging kirurger 1-4. Tissue engineering forskere som søker nye kilder for kunstig vev har utforsket ulike materialer, celle kilder og vekstfaktorer. Vellykkede restaureringer i forskjellige vev, slik som 5,6 trachea, blære 7, 8 hornhinne, bein 9 og 10 hud, ved implantering av konstruerte vev ble tidligere rapportert. Men fabrikasjon av en tykk vascularized konstruert vev, spesielt for rekonstruksjon av store mangler, er fortsatt en betydelig utfordring i tissue engineering.

En av de viktigste faktorene som begrenser tykkelsen av et levedyktig vev konstruksjon er kontroll av oksygentilførselen til sine ulempertituent celler. Ved å stole på diffusjon, konstruere tykkelse er begrenset til den for et meget tynt sjikt. Den maksimale avstanden mellom oksygen- og nærings leverer blodkar in vivo er omtrent 200 mikrometer, som korrelerer med diffusjon grensen for oksygen 11,12. Utilstrekkelig vaskularisering kan resultere i vev iskemi og eskalere til vev resorpsjon eller nekrose 13.

I tillegg må det ideelle materialet som brukes for vev rekonstruksjon være biokompatible og ikke-immunogene. Det må også være istand til å fremme ytterligere integrering av vertsceller med biomateriale, og opprettholde strukturell integritet. Ulike biologiske 14-16 og syntetiske 1,17,18 matriser har tidligere blitt undersøkt for vev rekonstruksjon, men deres bruk fortsatt begrenset på grunn av mangel på effektive blodtilførsel, infeksjoner eller utilstrekkelig vev styrke.

I denne studien ble en biokompatibel, celle-embedded stillas består av Food and Drug Administration (FDA) -godkjent poly L-melkesyre (PLLA) / poly melkesyre-co-glykolsyre (PLGA), ble implantert rundt femoral arterie og vene (AV) fartøy av en naken mus og atskilt fra omkringliggende vev, som sikrer vaskularisering fra AV-bare kar. En uke etter implantasjon, pode var levedyktig, tykt og godt vaskularisert. Dette tykke vaskularisert vev med AV-fartøy, ble deretter overført som en pedicled klaff til en abdominal full tykkelse defekt i samme mus. En uke etter overføring, klaffen var levedyktig, vaskularisert og godt integrert med den omkringliggende vev, bærer tilstrekkelig styrke til å støtte abdominal viscera. Dermed blir konstruert tykk, vaskularisert vev klaff, som bærer en autolog pedicle, presenterer en ny fremgangsmåte for reparasjon av full tykkelse bukveggen defekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier ble godkjent av Committee of Ethics of Animal Experiments av Technion. For denne prosedyren, ble atymiske nakne mus brukes for å unngå immunologisk avvisning. Hvis du bruker en annen type mus, bør musene barberes før det kirurgiske inngrepet og administrasjon av ciklosporin (eller en annen anti-avvisning innbytter) anbefales.

1. Bygge Forberedelse og Cell Inkludering

  1. Forbered stillas består av 1: 1-blanding av poly-L-melke-syre (PLLA) og polymelkesyre-ko-glykolsyre-(PLGA), på følgende måte:
    1. Oppløs 500 mg av PLLA og 500 mg av PLGA i 10 ml kloroform.
    2. Legg 0,24 ml av polymerløsning til 0,4 g natriumklorid-partikler samles i en teflonstøpeformer. Bruk en salt diameter på 212-600 mikrometer. La kloroform for å fordampe O / N.
    3. Lekke saltet ut med destillert vann fører til sammenhengende porøse 3D stillaser.
    4. Skjær polymer brikkerved hjelp av en saks, og deretter synke ned i 70% etanol (v / v) i 30 minutter og vaskes 3 ganger i PBS i 2 min før bruk.
  2. Tilbered en tri-kultur av disse cellene i 1: 1 endotelceller medium (EGM-2 supplert med komponentene i sine kulesett og muskelcellemedium (Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS ), 2,5% HEPES-buffer, 100 U / ml penicillin og 0,1 mg / ml streptomycin (Pen-Strep løsning).
    1. Bruke 0,5 x 10 6 C2C12 myoblaster, 0,9 x 10 6 Menneske umbilikalvene endotelceller (HUVECs) og 0,2 x 10 6 Normale humane dermale fibroblaster (NHDF).
  3. Bland cellene sammen i et mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 200 xg i 4 min, aspirere mediet og re-suspendere pelleten i en blanding av 4 mL iskald ekstracellulær matriseoppløsning og 4 pl cellemedium.
  4. Klipp et stykke 10 mm x 7 mm x 1 mm (lengde x bredde x tykkelse) PLLA / PLGEt stillas og frø cellesuspensjonen i en 6-brønns plate, tillate den ekstracellulære matriseoppløsningen for å størkne (30 min, 37 ° C, 5% CO2) før tilsetning av 4 ml cellemedium.
  5. Inkuber stillasene for ti dager før implantasjon og erstatte medium annenhver dag.

2. Før Starte Kirurgisk prosedyre

  1. Forbered og sterilisere (autoklav) følgende kirurgiske verktøy: en liten, fine, rette saks, en våren saks, en rett, fin-tipped tang, en taggete tang og en nål holder.
  2. Fremstille en blanding av ketamin: xylazin oppløsning i et mikrosentrifugerør ved å blande 425 ul ketamin og xylazin 75 pl i en 1 ml sprøyte.
  3. Fortynn 0,3 mg / ml buprenorfin i sterilt saltvann (01:20).

3. Flap Anlegg (Graft Implantasjon)

  1. Ved anvendelse av en insulinsprøyte, bedøve mus ved en intraperitoneal injeksjon av ketamin: xylazin (35 ul per20 g kroppsvekt).
  2. Subkutant injisere buprenorfin (endelig konsentrasjon på 0,05 til 0,1 mg / kg) før opperation.
  3. Plassere musen på en scene oppvarmet til 37 ° C, for å sikre normal kroppstemperatur, og deretter feste mus ved hjelp av en klebende bandasje.
  4. Ved hjelp av bomull tips, administrere smørende øyesalve til musens øyne (for å unngå dehydrering).
  5. Ved hjelp av bomull tips, rent innsnitt området med jod og deretter med 70% etanol, for å etablere en aseptisk arbeidsfelt.
  6. Ved hjelp av små sakser og pins, gjør et snitt gjennom huden, fra nivået for kneet til inguinale ligament, parallelt med de femorale fartøyene, til femoral arterie og vene (AV) fartøy er utsatt for.
  7. Hold huden ned ved hjelp av et festepunkt, for å få bedre tilgang til vevet.
  8. Bruke våren saks og pinsett, isolere nøye lårarterie og vene fartøy fra omkringliggende vev. Start fra nivået av lyske ligAment til forgreningen av superior epigastrica fartøy. La profunda urørt, for å opprettholde blodstrømmen til benet og hindre etterfølgende ischemi.
  9. Brett pode (§ 1) rundt eksponert lårbens AV, under profunda og over delinger til tibial og proneal AV, og bli med endene bruker 8-0 silkesuturer.
  10. For å sikre implantat vaskularisering av kapillærene spirende fra femoral AV bare kar, vikle et stykke sterilisert latex rundt pode, og sutur med 6-0 sting.
  11. Lukk liggende huden ved hjelp av 4-0 silkesuturer.
  12. Overvåke musen tett til bedring av bedøvelsen, og hver dag etterpå, til pode er overført som en klaff. Subkutant injisere buprenorfin (endelig konsentrasjon på 0,05-0,1 mg / kg) to ganger daglig i 2-3 dager.
    MERK: Bruk saltvann i ethvert stadium, for å unngå dehydrering av eksponert vev.

4. Flap Transfer

  1. På ett ellerto uker fostertap, bedøve mus ved en intraperitoneal injeksjon av ketamin: xylazin (35 mL / 20 g) under anvendelse av en insulinsprøyte.
  2. Subkutant injisere buprenorfin (endelig konsentrasjon på 0,05 til 0,1 mg / kg) før opperation.
  3. Plassere musen på en scene oppvarmet til 37 ° C, for å sikre normal kroppstemperatur, og deretter feste mus ved hjelp av en klebende bandasje.
  4. Ved hjelp av bomull tips, bruke smørende øyesalve til musens øyne (for å unngå dehydrering).
  5. Ved hjelp av bomull tips, rydde innsnitt området (fra kneet området til magen) med jod og deretter med 70% etanol, for å etablere en aseptisk arbeidsfelt.
  6. Ved hjelp av en saks og pinsett, nøye åpne sting i huden, og ved hjelp av en saks, gjør et snitt gjennom huden parallelt med lyskeligament, fortsetter gjennom ventral huden.
  7. Fjern forsiktig latex stykke med pinsett og utsett vascularized klaff.
  8. Ved hjelp av en scissORS og tang, dissekere vev klaff fra omkringliggende vev.
  9. Ved hjelp av en tang og en nåleholder, ligate den distale enden av den femorale AV med 8-0 silkesuturer for å forhindre blødning fra AV. Deretter cauterize AV ved nivået for kneet, distalt til den foldede implantert vev og 8-0 suturer.
  10. Forsiktig overføre femoral AV omsluttet av transplantatet, mot den ventrale bukveggen, unngå skade arterien, for å bestemme i hvilken avstand full tykkelse defekten bør gjøres.
    FORSIKTIG: Trekke arterien for langt vil skade arterien.
  11. Ved hjelp av en fin saks, gjør et snitt i den ventrale bukveggen.
  12. Ved hjelp av en våren saks, lage et snitt i rectus abdominus muskel. Fjern en ca 1 cm x 0,8 cm segment av rectus abdominus muskelen med den overliggende huden.
  13. Overfør femoral AV, omsluttet av vaskularisert transplantat, som en aksial klaff, til full-tykkelse defekt i den ventrale abdomInal veggen.
  14. Suturer klaffen til det omgivende muskelvev, ved hjelp av 8-0 silkesuturer, for å hindre brokk.
  15. For å unngå å sy de indre organer, øke muskel med en pinsett når sy klaffen til magemuskelen. La den ventrale huden utsettes for å etterligne virkningen av en full bukveggen defekt.
  16. Dekk såret i huden med joderte gasbind og en steril bandasje for å hindre forurensning av det utsatte området.
  17. Suturer huden på benet ved hjelp av 4-0 silkesuturer.
  18. Overvåke musen tett til bedring av bedøvelsen, og hver dag etterpå, før henting av klaff. Subkutant injisere buprenorfin (endelig konsentrasjon på 0,05-0,1 mg / kg) to ganger daglig i 2-3 dager.
  19. MERK: Bruk saltvann i ethvert stadium for å unngå dehydrering av eksponert vev.

5. Ultralyd Fastsettelse av Vaskulær perfusjon av Graft

MERK: Før overflytting, vaskulær perfusjon of pode måles ved en og to uker etter implantering, ved ultralyd.

  1. Anesthetize musen med 2% isofluran.
  2. Plasser musen på en bevegelig scene varmet opp til 38 ° C, for å sikre normal kroppstemperatur, og fest musen med et plaster.
  3. Finn lårarterie og vene fartøy med ikke-lineær svinger satt på B-mode.
  4. Undersøke åpenheten av de femorale fartøy av implantatet ved hjelp av svingeren innstilt på fargedoppler modus.
  5. Forbered ikke-målrettede kontrastmiddel i henhold til produsentens instruksjoner.
  6. Koble et halevenekateter (12 cm rør med en 27 G nål) i en 1 ml sprøyte fylt med saltvann. Sikre sprøyten ved siden av musen på oppvarmingstrinnet (for å unngå bevegelse av sprøyten).
  7. Koble kateteret til musehalevenen og feste nålen.
  8. Injisere noen av salt både for å sikre at injeksjoner blir gjort i venen, og til å fyllerøret med saltløsning (for å unngå luftbobler).
  9. Fyll en 1 ml sprøyte med 70 ul av kontrastmiddel og erstatte salt sprøyten med kontrastmidlet sprøyten.
  10. Sett opp ultralyd til bilde injeksjon av kontrastmiddel. I egenskapene til det ikke-lineær modus settes opp antallet rammer til 1500 og avbrudd puls til 30% av rammene.
    MERK: Etter avbrudd puls, mikrobobler på nytt fylle karene med en hastighet som avhenger av strømningshastigheten av mikroboblene i kapillærene, og er uavhengig av injeksjonshastighet på mikroboblene. Antall bilder kan endres i henhold til fyllet tiden 19,20.
  11. Sakte injisere kontrastmiddel inn i halevenen.
  12. Ta bilder i den ikke-lineære kontrast modus for høy oppløsning ultralydsystem.
  13. Analysere resultatene ved hjelp av programvaren, som tidligere beskrevet 19,20.
    1. Tegn en region av interesse (ROI) på bildet innhentet imdelbart etter avbrudd pulsen i kontrast-modus. ROI bør skissere området fylt av kontrastmiddelet bare.
    2. Beregn toppforsterkning (PE), som er forholdet mellom den midlere intensitet av den ikke-lineære signal etter injeksjonen av mikroboblene versus etter avbrudd puls, og er et mål for perfusjon volum.
    3. Beregn strømningshastighet, som bestemmes av den tid (T) som skal gå til toppen signal (P).

6. Fastsettelse av omfanget av Graft vaskularisering

MERK: Omfanget av vevet pode vaskularisering bestemmes én eller to uker etter implantasjon.

  1. Ved anvendelse av en insulinsprøyte, bedøve mus ved en intraperitoneal injeksjon av ketamin: xylazin (35 mL / 20 g).
  2. Ved hjelp av en ml sprøyte, intravenøst ​​injisere 200 ul 10 mg / ml fluorescein-isotiocyanat-konjugert dekstran (FITC-dekstran, MW = 500 000) i halevenen. </ li>
  3. Ti sekunder etter fullføring av injeksjonen, avlive mus ved cervikal dislokasjon.
  4. Åpne etappe av musen og utsett pode.
  5. Vask pode området med fosfatbufret saltvann (PBS) og anvende 10% nøytral bufret formalin.
  6. Bilde pode i mus ben, ved hjelp av et konfokalt mikroskop.
  7. Kvantifisere funksjonell fartøy tetthet (FVD).
    1. Isolere den grønne kanalen (eksitasjon = 488 nm) av konfokale mikroskopiske bilder.
    2. Passere de resulterende bildene gjennom et high-pass filter, for å fremheve strukturer med høy kontrast.
    3. Bruk en despeckling filter for å fjerne støy som kan ha blitt forsterket av høy-pass filter.
    4. Sett opp verdien av terskelen på det resulterende bildet; terskelverdien blir justert slik at funksjoner og strukturer i det originale bildet er synlige i det binære bildet.
    5. Påfør en størrelse-terskel, slik at bare grupper av tilkoblede piksler større enn den definerte size terskel forblir i det binære bildet.
    6. Skissere skjelettet av skipene i pode med Zhang-Suen algoritme 21.
    7. Beregn FVD ved å summere lengden av midtlinjen av hvert fartøy og dividere resultatet med arealet av avkastningen.

7. Immunohistologisk og Histologisk Farging av Graft

  1. Immunhistokjemi Farging
    1. Etter confocal bildebehandling, hente pode med en liten saks og pinsett. Dissekere AV fartøyene i de to endene av pode og hente pode.
    2. Fest grafts i 10% nøytral bufret formalin i 30 min - 2 timer.
    3. Plasser grafts i histologi kassetter og lagrer i 70% etanol til parafin innebygging.
    4. Bygge inn i parafin ved hjelp av en standard fiksering og embedding protokoll 22 og skjær parafininnebygd vev til 5 mikrometer skiver med en mikrotom. Skjær hele vev vinkelrett på AVfartøy.
    5. Deparaffinize det parafininnstøpte seksjoner ved neddykking i 100% xylen to ganger, i 10 minutter hver.
    6. Ordne lysbilder i en 250 ml plast Coplin krukke.
    7. Rehydrere av serielle dykk i avtagende konsentrasjoner av etanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% og dobbelt destillert vann (DDW)) i 3 minutter hver.
    8. Forbered antigen avsløring løsning ved å fortynne 2,35 ml antigen avsløring løsning med 250 ml DDW. Varm antigen avsløre løsningen i 2 minutter i en mikrobølgeovn innstilt på 95 ° C.
    9. Sett skinnene inn i den forvarmede antigen avmaskering oppløsning og varme igjen i 3 minutter i en mikrobølgeovn innstilt på 95 ° C. Kule lysbildene til 50 ° C.
    10. Varme igjen i 2 minutter og deretter avkjøles til romtemperatur.
    11. Inkuber objektglassene i 3,3% H 2 O 2 løsning i metanol i 10 min, ved romtemperatur for å stanse aktiviteten av endogen peroksidase og deretter skylles to ganger i PBS.
    12. Forbered en inkubasjon kammer: sted våt absorbent ark inne i en histologi boksen og tørk lysbilder ved hjelp av delikate oppgaven vindusviskere.
    13. Circle stykkeområdet på sleiden ved hjelp av en hydrofob penn og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur, med ca 50 ul av geit serum-blokkerende løsning (2%, fremstilt i PBS) per skive.
    14. Fortynn kanin-anti-CD31-antistoff 1:50 i blokkeringsløsning, anvende ca. 50 mL antistoff per skive og inkuberes O / N, ved 4 ° C. Skyll 3 ganger med PBS, 5 min hver.
    15. Fortynn biotinylert geit-anti-kanin-sekundært antistoff 1: 400 i PBS, sted over lysbildene ca. 50 ul av antistoff per skive og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur.
    16. Skyll 3 ganger med PBS, 5 min hver.
    17. Fortynn streptavidin-peroksidase 1: 400 i PBS, anvende omtrent 50 ul pr skive og inkuber med lysbilder i 30 min ved RT. Skyll 3 ganger med PBS, 5 min hver.
    18. Anvende ca. 50 ul aminoethylcarbazole (AEC) substrat per skive, i henhold til produsentens & #8217; s instruksjoner. Dypp lysbildene i DDW for å stoppe reaksjonen.
    19. Flekk kjernene i blått ved å dyppe delene i ca 50 mL av Mayers hematoksylin løsning for 2 min. Skyll forsiktig i vann og deretter dekke deler med monteringsmedium.
    20. Kvantifisere CD31-positiv farging ved hjelp av en dobbel-blind måte. CD31-farging vises som en brun flekk. Velg 4-5 forskjellige felt i en 40X forstørrelse synsfeltet under en kikkert mikroskop. Tell antall CD31-positive lumen.
      1. Beregne gjennomsnittlig antall CD31-positive lumen per stillaset ved å dividere totalt antall telte lumen med antall felt og fieldarea (i henhold til de binokulære data).
        MERK: anvendt reagensvolum må være tilstrekkelig til å dekke hele skissert skive.
  2. Histologisk Farging
    1. Fix grafts i 10% nøytral bufret formalin.
    2. Embed grafts i parafin ved hjelp av standardfiksering og embedding prosedyrer.
    3. Fjerne parafin fra parafininnstøpte seksjoner ved neddykking i 100% xylen to ganger i 10 min.
    4. Rask vask to ganger for rehydrering i 100% isopropanol.
    5. Rask vask to ganger 95% etanol.
    6. Vask tre ganger i vann fra springen.
    7. Fordyp deg i Hematoxylin i 10 min.
    8. Vask tre ganger i vann fra springen.
    9. Immere i Eosin for 2 min.
    10. Rask vask tørke i 95% etanol to ganger.
    11. Rask vask 100% isopropanol to ganger.
    12. Rask vask 100% xylen to ganger.
    13. Dekk med DPX lim med cover glass 1,5 mm tykk.
    14. Bilde ved hjelp av mikroskop i 40X forstørrelse.

8. Mekanisk Properties Assessment

  1. Hente pode med en liten saks og pinsett.
  2. Skyll pode i PBS.
  3. Måle bredden og tykkelsen av graftet og beregne tverrsnittsarealet som bredde multiplisert med tykkelse.
  4. Osse testinstrumentet for å generere en stress-belastningskurve av hydratiserte grafts.
    1. Monter pode mellom system strekk- grep og måle den endelige lengden mellom de to håndtak (dvs. opprinnelig lengde).
    2. Påfør en belastning på 0,01 mm / sek, til svikt.
    3. Spill den utviklede kraft og forflytning ved hjelp av produsentens protokoll.
    4. Generere en stress-belastningskurve i Matlab.
      1. Beregn stamme ifølge forskyvning dividert med den opprinnelige lengde. Stress er beregnet som den målte kraft dividert med tverrsnittsarealet.
      2. Bestem stivhet som helningen av den lineære-regionen i stress-belastningskurve og maksimumspunktet på kurven er den maksimale strekkfasthet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Graft vaskularisering og perfusjon in vivo

Grafts ble implantert en eller to uker før sin overføring som aksiale flaps. På en og to uker etter implantasjon, brutto observasjon av pode området avslørte levedyktige og vaskulariserte vev grafts. Disse grafts viste seg å være svært vaskularisert, som bestemmes av CD31 positive immunfarging (figur 1A), og meget perfusert, som gjenspeiles av FITC-dekstran halevene-injeksjon og ultralydmålinger. Mange skip som allerede er observert ved en uke etter implantasjon, et tall som økte vesentlig etter ytterligere en uke i nærheten av AV-fartøy. FITC-dekstran-basert bestemmelse av den funksjonelle fartøyet tetthet (FVD) (figur 1 B) viste at transplantatet var sterkt vaskularisert på en ukes fostertap, og at ingen signifikante forandringer fant sted i ytterligere en uke in vivo. Fartøyet åpenhet og perfusjon ble demonstrertved ultralydavbildning (den FVD var 5,71 mm - 1 ± 0,51 mm - 1 og 10,28 mm - 1 ± 2.71 mm - en, en og to uker etter implantasjon, henholdsvis) Figur 1C bekreftet verten femoral fartøy åpenhet og integritet etter pode implantasjon. . Videre undersøkelser viste ultrasonographic perfusjon i pode-området, som er noe høyere to uker etter implantasjon i forhold til en uke etter implantasjon (figur 1D).

Klaff eiendommer

Brutto undersøkelse av klaffene én uke etter overføring avdekket en levedyktig, vaskularisert og godt integrert vev. Klaffene gikk fast tilknytning til sine omgivelser. Når man sammenligner de pre-vaskulariserte, celle-embedded klaffer til å kontrollere acellulær, nonvascularized grafts, den tidligere viste overlegne mekaniske egenskaper, som manifestert ved økt stivhet og styrke (

Figur 1
Figur 1. Graft vaskularisering. (A) Tettheten til CD31-positive fartøy, målt ved en og to uker fostertap sammenlignet med kontrollgruppen. Alle verdier er normalisert til pode område (mm2). * = T-test p <0,05. (B) Funksjonell vaskulær tetthet (FVD) på en og to uker fostertap. Ingen signifikant forskjell ble observert, p = 0,08 (t-test). (C) Patent AV-fartøy som avbildes ved hjelp av ultralyd i fargedoppler modus. Blå og røde representertt blodstrømmen i pode. Den gule kvadranten skisserer pode området. (D) Graft perfusjon på en og to uker fostertap. (E og F) H & E farging av klaffene integrert med verten vev: svart pil punkt levedyktig arterie; hvite piler peker abdominal muskelfibre; gule piler peker stillas restene. (H og G) FITC-dekstran fordeling som vist ved mikroskopi konfokale bilder. For alle bestemmelser, utvalgsstørrelsen var n ≥ 3 og alle verdier er representert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Mekaniske egenskaper av klaffen en ukepost-transfer. (A) stivhet og (B) den maksimale strekkfasthet (UTS) av klaffene. Kontroll står en tom pode uten celler, står celler tri-kultur grafts. * = T-test p <0,05, n = 3. Verdier er representert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremskritt innen tissue engineering har blitt møtt med en økende etterspørsel etter erstatning vev for rekonstruksjon av ulike vevstyper. En rekke syntetiske 1,17,18 og biologiske 14-16 materialer samt fabrikasjon metoder har blitt testet for deres evne til å møte disse kravene. Men til tross for fremgang i klinisk arbeid og i tissue engineering, restaurering av full tykkelse bukveggen defekter er fortsatt en utfordring. En vev tilstrekkelig for rekonstruksjon av slike massive defekter må være (1) tykkelse, og (2) vaskularisert, og demonstrere (3) mekanisk integritet, og (4) levedyktighet over tid 23.

Her presenterer vi en trinn-for-trinn detaljert protokoll for å lage en tykk, levedyktig, og vaskularisert vev klaff, som kan tjene som et alternativ til autologe vev klaffer. Den fabrikkert klaff ble bygget i to trinn: (1) En PLLA / PLGA stillaset ble implantert omkring AV-karene i mouse bakben og atskilt fra det omgivende vev for å tillate vaskularisering av AV-bare kar. (2) Den opprettede vaskularisert, tykk vev klaff ble deretter overført med AV-fartøy, som fungerte som sin stilken, til en full-tykkelse bukveggen defekt.

Riktig klaff vaskularisering er avgjørende for sin vellykket integrering i verts 17,18,24. Forskjellige fremgangsmåter for å lage vaskularisert vev konstruert for å forbedre oksygentilførselen og diffusjon i tykt vev, er blitt omtalt i litteraturen. Blant disse var metoder som involverer seeding av endotelceller (ECS) på ulike stillastyper 13,20,25-30, ulike teknikker for å levere angiogeniske faktorer å implantasjonsstedet (enten ved direkte administrasjon ved injeksjon, bruk av transformerte celler uttrykker faktorer 31 -34 eller langsom frigjøring fra forskjellige stillaser 35,36), bruk av bioreaktorer for å sikre konstruert vevsperfusjon 37 38,39. Her ble vevet vaskularisert transplantat in vivo, ved utnytting av autologe fartøy. Transplantatet, som viste seg å være levedyktig, vaskularisert og perfusert, ble deretter overført som en tykk vev klaff for å reparere en full-tykkelse bukveggen defekt. En uke etter overføring, klaffen var levedyktig, og inneholdt tilstrekkelig mekanisk styrke til å støtte abdominal viscera. Her brukte vi atymiske hårløse mus, som bærer en svekket immunsystem; ved bruk av en hvilken som helst annen type mus eller andre dyr, må muligheten for immunreaksjoner må tas i betraktning (spesielt når utsåing av stillaser med celler). Andre begrensninger av denne teknikken inkluderer (1) overføring av femoral AV fartøy, som leverer blodstrømmen til bakben. Imidlertid går teknikken profunda og de dype femorale fartøyene urørt og ingen bakben ischemi ble observert etter klaff overføring. Videre, i større dyr og i mennesker, anvendelse avperifere kar vil bli informert etter hvert som de er overflødige i kroppen; (2) den tid som kreves for å oppnå tilfredsstillende vaskularisering før klaff overføringen, kan være en begrensende faktor i presserende tilfeller; og (3) klaff etableringen utføres in vivo, noe som kan begrense dets relevans i mennesker. I fremtiden ønsker vi å utvikle et middel til å skape denne klaff ex vivo. Fordelen med den presenterte fremgangsmåten ligger i evnen til å forsterke dannelsen av et autologt vev (med autologe celler) rundt stillaset. Den resulterende vev presenterer et egnet alternativ til et autologt vev klaff. Videre kan stillaset bli sådd med autologe celler før implantering, for ytterligere å forbedre pode vaskularisering og integrering i vertsvevet. Bruk av autologe celler og et biologisk nedbrytbart og biokompatibelt stillaset kan omgå betydelig risiko for immun-avvisning reaksjoner og presentere et alternativ til autologe klaffer samtidig unngå høsting og postoperativ scarifikasjon.

Den beskrevne metoden kan oversettes til eksperimenter i store dyr og ytterligere utvidet til kliniske studier på mennesker. Videre kan det oversettes til å reparere ulike skadede vev i kroppen. Hos mennesker og i store dyr, kan klaffene generert rundt perifere kar i stedet for på de femoral AV fartøy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12 (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32 (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69 (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18 (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28 (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193 (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27 (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. , Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7 (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).

Tags

Bioteknologi klaff tissue engineering stillas vaskularisering mus modell vaskularisert vev muskler
Konstruert vaskulariserte Muscle Flap
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman,… More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter