Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Udviklet vaskulariserede Muskel Flap

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

Bugvæggen defekter ofte opstår efter alvorlige traumer, kræftbehandling, forbrændinger og fjernelse af inficeret mesh. Disse defekter involverer ofte betydelige tab væv, der kræver komplicerede kirurgiske procedurer og præsentere en stor udfordring for plastik genopbygning kirurger 1-4. Tissue engineering forskere, der søger nye kilder til kunstige væv har udforsket forskellige materialer, celle kilder og vækstfaktorer. Succesfulde restaureringer af forskellige væv, såsom luftrøret 5,6, blære 7, 8 cornea, bone 9 og huden 10, ved implantation af industrielt væv blev tidligere rapporteret. Men fabrikation af en tyk vaskulariseret manipuleret væv, især til ombygning af store defekter, er fortsat en stor udfordring i tissue engineering.

En af de vigtigste faktorer, der begrænser tykkelsen af ​​et levedygtigt væv konstruktion er kontrol af iltforsyning til sine ulempertituent celler. Når afhængige af diffusion, konstruere tykkelse er begrænset til den af ​​et meget tyndt lag. Den maksimale afstand mellem ilt- og næringsstof-forsyning kapillærer in vivo er ca. 200 um, hvilket korrelerer med diffusion grænse for ilt 11,12. Utilstrækkelig vaskularisering kan resultere i vævsiskæmi og eskalerer væv resorption eller necrosis 13.

Desuden skal det ideelle materiale anvendes til vævsrekonstruktion være biokompatibelt og ikke-immunogene. Det skal også være i stand til at fremme yderligere integration af værtsceller med biomateriale, og opretholdelse af strukturel integritet. Forskellige biologiske 14-16 og syntetiske 1,17,18 matricer er tidligere blevet undersøgt for vævsrekonstruktion dog deres anvendelse begrænses på grund af mangel på effektiv blodtilførsel, infektioner eller utilstrækkelig væv styrke.

I denne undersøgelse, en biokompatibel, celle-embedded stillads bestående af Food and Drug Administration (FDA) -godkendt poly-L-mælkesyre (PLLA) / poly mælke-co-glycolsyre (PLGA), blev implanteret omkring femoral arterie og vene (AV) fartøjer med en nøgen mus og adskilt fra det omgivende væv, hvilket sikrer vaskularisering fra AV kun skibe. En uge post-implantation, transplantatet var levedygtig, tyk og godt vaskulariseret. Denne tykke vaskulariseret væv med AV fartøjer, blev derefter overført som en pedicled klap til en abdominal fuld tykkelse defekt i samme mus. En uge efter indsættelse, flappen var levedygtig, vaskulariseret og godt integreret med det omgivende væv, idet tilstrækkelig styrke til at understøtte indvolde fra bughulen. Således konstruerede tyk, vaskulariseret væv flap, der bærer et autologt stilken, præsenterer en ny fremgangsmåde til reparation af fuld tykkelse bugvæggen defekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af udvalget for den etiske af dyreforsøg i Technion. Til denne fremgangsmåde blev athymiske nøgne mus anvendes til at undgå immunologisk afstødning. Hvis du bruger en anden type mus, bør musene skal barberes anbefales før den kirurgiske procedure og administration af cyclosporin (eller andet anti-afvisning stedfortræder).

1. Stillads Forberedelse og Cell Embedding

  1. Forbered stilladser sammensat af 1: 1-blanding af poly-L-mælkesyre (PLLA) og polymælkesyre-co-glycol-syre (PLGA), på følgende måde:
    1. Opløs 500 mg af PLLA og 500 mg af PLGA i 10 ml chloroform.
    2. Tilføj 0,24 ml polymeropløsning til 0,4 g natriumchlorid partikler indsamlet i en Teflon forme. Brug et salt diameter på 212-600 um. Lad chloroform fordampe O / N.
    3. Sive saltet ud med destilleret vand, der fører til indbyrdes forbundne porøse 3D-stilladser.
    4. Skær polymerstykkerneved hjælp af en saks, derefter lægges i blød i 70% ethanol (v / v) i 30 min og vask 3 gange i PBS i 2 minutter før brug.
  2. Der fremstilles en tri-kultur af følgende celler i 1: 1 endotelcelle medium (EGM-2 suppleres med komponenter i sin bullet kit og muskelceller medium (Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS ), 2,5% HEPES-buffer, 100 U / ml penicillin og 0,1 mg / ml streptomycin (Pen-Strep Solution).
    1. Brug 0,5 x 10 6 C2C12 myoblaster, 0,9 x 10 6 Humane navleveneendotelceller (HUVEC'er), og 0,2 x 10 6 Normale humane dermale fibroblaster (NHDF).
  3. Bland cellerne sammen i et mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 200 xg i 4 minutter, aspireres mediet og resuspender pelleten i en blanding af 4 pi iskold ekstracellulære matrix-opløsning og 4 pi cellemedium.
  4. Klip et stykke 10 mm x 7 mm x 1 mm (længde x bredde x tykkelse) PLLA / PLGEn stillads og frø cellesuspensionen i en 6-brønds plade, tillader den ekstracellulære matrix opløsningen at størkne (30 min, 37 ° C, 5% CO 2) før tilsætning af 4 ml cellemedium.
  5. Inkubér stillads til ti dage før implantation og erstatte mediet hver anden dag.

2. Før start den kirurgiske procedure

  1. Forberede og sterilisere (autoklave) følgende kirurgiske værktøjer: en lille, fine, lige saks, en fjeder saks, en straight, spids pincet, en savtakket pincet og en nål holder.
  2. Klargør en blanding af ketamin: xylazin opløsning i et mikrocentrifugerør ved at blande 425 pi ketamin og 75 pi xylazin i en 1 ml sprøjte.
  3. Fortynd 0,3 mg / ml buprenorphin i sterilt saltvand (1:20).

3. Flap Construction (Graft implantation)

  1. Ved anvendelse af en insulinsprøjte, bedøver musen ved en intraperitoneal injektion af ketamin: xylazin (35 pi pr20 g legemsvægt).
  2. Subkutant injicere buprenorphin (slutkoncentration på 0,05-0,1 mg / kg) før opperation.
  3. Placer musen på en scene opvarmet til 37 ° C, for at sikre normal kropstemperatur, og fastgør musen ved hjælp af et plaster.
  4. Ved hjælp af bomuld tips, administrere smørende øjensalve til musens øjne (for at undgå dehydrering).
  5. Brug bomuld tips, ren incisionssted med jod og derefter med 70% ethanol, for at etablere en aseptisk arbejdsmiljø felt.
  6. Brug af en lille saks og pincet, lave et snit gennem huden, fra niveauet for knæet til lyskeligamentet, parallelt med de femorale fartøjer, indtil den femorale arterie og vene (AV) fartøjer er udsat for.
  7. Hold huden ned med en retraktor, for at få bedre adgang til vævet.
  8. Brug af foråret saks og pincet, omhyggeligt isolere de femorale arterie og vene fartøjer fra det omgivende væv. Start fra niveauet for den ingvinal ligAment til forgreningen af ​​de overlegne epigastriske fartøjer. Lad dybtliggende uberørt, for at bevare blodtilførslen til benet og forhindre efterfølgende iskæmi.
  9. Fold transplantatet (fra afsnit 1) omkring den udsatte femoralis AV, under profunda og over forgreningen til tibiale og proneal AV, og deltag enderne ved hjælp af 8-0 silkesuturer.
  10. For at sikre implantat vaskularisering af kapillærer spiring fra femorale AV kun skibe, wrap et stykke steriliseret latex omkring transplantatet, og sutur med 6-0 suturer.
  11. Luk overliggende hud under anvendelse af 4-0 silkesuturer.
  12. Overvåg musen tæt indtil bedring fra anæstesi og hver dag derefter, indtil transplantatet overføres som en klap. Subkutant injicere buprenorphin (slutkoncentration på 0,05-0,1 mg / kg) to gange dagligt i 2-3 dage.
    BEMÆRK: Brug saltvand i enhver fase, for at undgå dehydrering af den udsatte væv.

4. Flap Transfer

  1. På et ellerto uger efter implantation, bedøver musen ved en intraperitoneal injektion af ketamin: xylazin (35 pl / 20 g) ved anvendelse af en insulinsprøjte.
  2. Subkutant injicere buprenorphin (slutkoncentration på 0,05-0,1 mg / kg) før opperation.
  3. Placer musen på en scene opvarmet til 37 ° C, for at sikre normal kropstemperatur, og fastgør musen ved hjælp af et plaster.
  4. Ved hjælp af bomuld tips, gælder smørende øjensalve til musens øjne (for at undgå dehydrering).
  5. Ved hjælp af bomuld tips, rengøre incisionssted (fra knæet område til maven) med jod og derefter med 70% ethanol, for at etablere en aseptisk arbejdsmiljø felt.
  6. Ved hjælp af en saks og pincet, forsigtigt åbne suturerne i huden og ved hjælp af en saks, lave et snit gennem huden parallelt lyskeligamentet, fortsætter gennem den ventrale huden.
  7. Fjern forsigtigt latex stykke med pincet og eksponere vaskulariserede klap.
  8. Ved hjælp af en scissors og pincet, dissekere vævslap fra det omgivende væv.
  9. Ved hjælp af en pincet og en nåleholder, ligere den distale ende af den femorale AV med 8-0 silkesuturer at forhindre blødning fra AV. Derefter ætse AV på niveauet af knæet, distalt til den foldede implanteret væv og 8-0 suturer.
  10. Overføre forsigtigt femorale AV omsluttet af implantatet, mod den ventrale abdominale væg, så man undgår beskadigelse af arterien, for at bestemme, i hvilken afstand den fulde tykkelse defekt skal foretages.
    ADVARSEL: Trække arterien for langt vil skade arterien.
  11. Med en fin saks, lave et snit i den ventrale abdominale væg.
  12. Ved hjælp af en fjeder saks, lave et snit i rectus abdominus musklen. Fjerne en ca. 1 cm x 0,8 cm segment af rectus abdominus musklen med overliggende hud.
  13. Overfør den femorale AV, omsluttet af vaskulariseret transplantat, som en aksial flap, til fuld tykkelse defekt i den ventrale abdomginal væg.
  14. Sy flappen til det omgivende muskelvæv, ved hjælp af 8-0 silkesuturer, for at forhindre brok.
  15. For at undgå at sy de indre organer, hæve musklen med en pincet når suturering flappen til den abdominale muskler. Efterlad den ventrale hud, der udsættes for at efterligne virkningen af ​​en fuld bugvæggen defekt.
  16. Dække såret i huden med ioderet gaze og en steril forbinding for at forhindre forurening af det udsatte område.
  17. Sy huden på benet ved hjælp af 4-0 silkesuturer.
  18. Overvåg musen tæt indtil bedring fra anæstesi og hver dag derefter, indtil hentning af klappen. Subkutant injicere buprenorphin (slutkoncentration på 0,05-0,1 mg / kg) to gange dagligt i 2-3 dage.
  19. BEMÆRK: Brug saltvand i hvilket som helst tidspunkt for at undgå dehydrering af den udsatte væv.

5. Ultralyd Bestemmelse af vaskulær perfusion af transplantatet

BEMÆRK: Før overførsel, vaskulær perfusion of implantatet måles ved en og to uger efter implantering af ultralydsscanning.

  1. Bedøver musen under anvendelse af 2% isofluran.
  2. Placer musen på en bevægelig platform opvarmet til 38 ° C, for at sikre normal kropstemperatur, og fastgør musen ved hjælp af et plaster.
  3. Find de femorale arterie og vene fartøjer med ikke-lineære transducer indstillet på B-mode.
  4. Undersøg åbenheden af ​​femorale kar i implantatet ved hjælp af transduceren indstillet på farven Dopplerbilleddannelse.
  5. Forbered ikke-målrettet kontrastmiddel ifølge producentens anvisninger.
  6. Tilslut en halevenen kateter (12 cm slange med en 27 G nål) til en 1 ml sprøjte fyldt med saltvand. Fastgør sprøjten ved siden af ​​musen på opvarmningstrinnet (for at undgå bevægelse af sprøjten).
  7. Tilslut kateteret til musen halevene og fastgør nålen.
  8. Tilføre nogle af saltvand både for at sikre, at injektioner bliver lavet i venen og udfyldeslangen med saltvand (for at undgå luftbobler).
  9. Fyld en 1 ml sprøjte med 70 pi kontrastmiddel og erstatte saltvand sprøjte med sprøjten kontrastmidlet.
  10. Opsætning af ultralyd til billedet injektion af kontrastmidlet. I egenskaber af ikke-lineær tilstand nedsat antallet af frames til 1500 og forstyrrelser impuls til 30% af optagelserne.
    BEMÆRK: Efter afbrydelsen puls, mikroboblerne re-fill skibene med en hastighed, der afhænger af strømningshastigheden af ​​mikrobobler i kapillærerne og er uafhængig af injektionen sats af mikrobobler. Antallet af billeder kan ændres i henhold til fyldet tid 19,20.
  11. Injicer langsomt kontrastmidlet i halevenen.
  12. Tage billeder i den ikke-lineære kontrast tilstand af høj opløsning ultralydssystemet.
  13. Analysere resultaterne ved hjælp af softwaren, som tidligere beskrevet 19,20.
    1. Tegn et område af interesse (ROI) på billedet opnåede imbart efter afbrydelsen pulsen i kontrast-tilstand. ROI bør skitsere området fyldt af kontrasten eneste agent.
    2. Beregn peak enhancement (PE), som er forholdet mellem den gennemsnitlige intensitet af den ikke-lineære signal efter injektionen af ​​mikroboblerne versus efter afbrydelse puls, og er et mål for perfusion volumen.
    3. Beregn strømningshastighed, som bestemmes ud fra den tid (T), der forløber indtil peak signal (P).

6. Bestemmelse af omfanget af Graft Vaskularisering

BEMÆRK: Omfanget af vævstransplantat vaskularisering bestemmes en eller to uger efter implantation.

  1. Ved anvendelse af en insulinsprøjte, bedøver musen ved en intraperitoneal injektion af ketamin: xylazin (35 pl / 20 g).
  2. Anvendelse af 1 ml sprøjte, intravenøst ​​injicere 200 pi 10 mg / ml fluoresceinisothiocyanat-konjugeret dextran (FITC-dextran, MW = 500.000) i halevenen. </ li>
  3. Ti sekunder efter afslutningen af ​​injektionen, aflive musen ved cervikal dislokation.
  4. Åbn ben af ​​musen og eksponere graften.
  5. Vask implantatet med phosphatbufret saltvand (PBS) og anvende 10% neutral bufret formalin.
  6. Billede implantatet i musen ben, ved hjælp af et konfokalt mikroskop.
  7. Kvantificere funktionelle kardensitet (FVD).
    1. Isoler den grønne kanal (excitation = 488 nm) af de konfokal mikroskopiske billeder.
    2. Pass de resulterende billeder gennem et højpasfilter, med henblik på at fremhæve de høj kontrast strukturer.
    3. Brug et prikker filter til at fjerne støj, der kunne have været forstærket af high-pass filter.
    4. Indstil værdien af ​​tærsklen på det resulterende billede op; tærskelværdien indstilles således, at de funktioner og strukturer i det oprindelige billede er synlige i det binære billede.
    5. Påfør en størrelse-tærskel, så kun grupper af indbyrdes forbundne pixel større end den definerede size tærsklen forbliver i det binære billede.
    6. Skitsere skelettet af skibene i transplantatet ved hjælp af Zhang-Suen algoritme 21.
    7. Beregn FVD som summen af ​​længderne af midterlinien af ​​hver beholder og dividere resultatet med det område af ROI.

7. Immunohistologisk og histologisk farvning af Graft

  1. Immunhistologisk Farvning
    1. Efter konfokal billeddannelse, hente implantatet ved hjælp af en lille saks og pincet. Dissekere AV fartøjer i de to ender af transplantatet og hente transplantatet.
    2. Fix transplantaterne i 10% neutral bufret formalin i 30 minutter - 2 timer.
    3. Placer podninger i histologi kassetter og gemmer på 70% ethanol, indtil paraffinindlejring.
    4. Integrer i paraffin ved hjælp af en standard fiksering og indlejring protokol 22 og skær paraffin indlejrede væv i 5 um skiver ved hjælp af en mikrotom. Skær hele væv vinkelret på AVfartøjer.
    5. Afparaffiniser paraffinindstøbte sektioner ved nedsænkning i 100% xylen to gange, i 10 minutter hver.
    6. Arranger dias i en 250 ml plastik Coplin-skål.
    7. Rehydrere ved seriel neddypninger i faldende koncentrationer af ethanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% og dobbelt destilleret vand (DDW)) i 3 minutter hver.
    8. Forbered antigen demaskering ved at fortynde 2,35 ml antigen demaskering opløsning med 250 ml DDW. Varm antigen demaskering opløsning i 2 minutter i en mikrobølgeovn indstillet til 95 ° C.
    9. Indsæt diassene i den forvarmede antigen demaskering opløsning og varmen igen i 3 minutter i en mikrobølgeovn indstillet til 95 ° C. Cool dias til 50 ° C.
    10. Varm igen i 2 min og derefter afkøles til stuetemperatur.
    11. Glassene inkuberes i 3,3% H 2 O 2-opløsning i methanol i 10 minutter, ved stuetemperatur til standsning af aktiviteten af endogen peroxidase og derefter skylles to gange i PBS.
    12. Forbered en inkubation kammer: sted våde ABSOrbent plader inde i en histologi kasse og tørre dias ved hjælp af vanskelige opgave vinduesviskere.
    13. Circle udsnitsområdet på objektglasset ved hjælp af en hydrofob pen og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur med ca. 50 pi gedeserum blokerende opløsning (2%, fremstillet i PBS) pr skive.
    14. Fortynd kanin-anti-CD31-antistof 1:50 i blokerende opløsning, anvendes ca. 50 pi antistof pr skive og inkuber O / N, ved 4 ° C. Skyl 3 gange med PBS, 5 minutter hver.
    15. Fortynd biotinyleret gede-anti-kanin sekundært antistof 1: 400 i PBS, sted over slides ca. 50 pi antistof pr skive og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
    16. Skyl 3 gange med PBS, 5 minutter hver.
    17. Fortynd streptavidin-peroxidase 1: 400 i PBS, anvendes ca. 50 pi pr skive og inkuberes med lysbilleder i 30 minutter, ved stuetemperatur. Skyl 3 gange med PBS, 5 minutter hver.
    18. Anvend ca 50 pi aminoethylcarbazol (AEC) substrat pr skive, ifølge producentens & #8217 anvisninger. Dyp dias i DDW at standse reaktionen.
    19. Farv kerner i blåt ved at nedsænke afsnittene i ca. 50 ul Mayers hematoxylinopløsning i 2 min. Forsigtigt skylles i vand og derefter dække sektioner med monteringsmedium.
    20. Kvantificere CD31-positiv farvning under anvendelse af en dobbelt-blind tilgang. CD31-farvning vises som en brun plet. Vælg 4-5 forskellige felter i en 40X forstørrelse synsfelt under et binokulært mikroskop. Tæl antallet af CD31-positive lumen.
      1. Beregn det gennemsnitlige antal CD31-positive lumen pr stillads ved at dividere det totale antal optalte lumen med antallet af felter og fieldarea (ifølge kikkerten data).
        BEMÆRK: Den anvendte reagens volumen skal være tilstrækkelig til at dække hele skitserede skive.
  2. Histologisk farvning
    1. Fix grafts i 10% neutral pufret formalin.
    2. Indkapsle transplantater i paraffin ved anvendelse af standardfiksering og indlejring procedurer.
    3. Fjern paraffinen fra paraffinindlejrede sektioner ved nedsænkning i 100% xylen to gange i 10 min.
    4. Hurtig vask to gange for rehydrering i 100% isopropanol.
    5. Hurtig vask to gange 95% ethanol.
    6. Vask tre gange i postevand.
    7. Fordyb i Hæmatoxylin i 10 min.
    8. Vask tre gange i postevand.
    9. Immere i eosin for 2 min.
    10. Hurtig vask dehydrere i 95% ethanol to gange.
    11. Hurtig vask 100% isopropanol to gange.
    12. Hurtig vask 100% xylen to gange.
    13. Dæk med DPX lim med dækglas 1,5 mm tyk.
    14. Billedet ved hjælp mikroskop i 40X forstørrelse.

8. Mekanisk Ejendomme Vurdering

  1. Hent transplantatet ved hjælp af en lille saks og pincet.
  2. Skyl implantatet i PBS.
  3. Måle bredden og tykkelsen af ​​implantatet og beregne tværsnit område som bredde multipliceret med tykkelsen.
  4. Ose test instrument, som tilvejebringer en stress-strain kurve af hydratiserede transplantater.
    1. Monter implantatet mellem systemet trækstyrke greb og måle den endelige længde mellem de to greb (dvs. oprindelige længde).
    2. Anvende en stamme på 0,01 mm / sek, indtil brud.
    3. Optag den udviklede kraft og forskydning ved hjælp af producentens protokol.
    4. Generer en stress-strain kurve i Matlab.
      1. Beregn stamme ifølge forskydning divideret med den oprindelige længde. Stress beregnes som den målte kraft divideret med tværsnitsarealet.
      2. Bestem stivhed som hældningen af ​​den lineære region i stress-strain kurve og den maksimale punkt på kurven er den ultimative trækstyrke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Graft vaskularisering og in vivo perfusion

De podninger blev implanteret en eller to uger før overførsel som aksiale klapper. På en og to uger efter implantation, brutto observation af graft området afslørede levedygtige og vaskulariserede vævstransplantater. Disse transplantater viste sig at være yderst vaskulariseret, som bestemt ved positiv immunfarvning CD31 (figur 1A), og stærkt perfunderet, som det fremgår af FITC-dextran injektion i halevenen og ultralyd målinger. Mange fartøjer blev allerede observeret ved en uges post-implantation, et tal, der er steget markant efter en ekstra uge i nærheden af ​​AV fartøjer. FITC-dextran-baserede bestemmelse af den funktionelle kardensitet (FVD) (figur 1B) viste, at transplantatet var stærkt vaskulariseret på en uge efter implantation, og at ingen signifikante ændringer fandt sted i ekstra uge in vivo. Karåbenhed og perfusion blev påvistved ultralydsscanning (FVD var 5,71 mm - 1 ± 0,51 mm - 1 og 10,28 mm - 1 ± 2,71 mm - 1, en ​​og to uger efter implantation, henholdsvis) figur 1C bekræftede vært femoral karåbenhed og integritet efter graft implantation. . Desuden ultrasonografi undersøgelse afslørede perfusion inden implantatet område, som var lidt højere to uger efter implantation sammenlignet med én uge post-implantation (figur 1D).

Flap egenskaber

Brutto undersøgelse af flapperne en uge efter overførsel afslørede en levedygtig, vaskulariseret og velintegreret væv. Klapperne gennemgik fast tilknytning til deres omgivelser. Når man sammenligner de præ-vaskulariserede, celle-embedded flapper til at styre acellulær, nonvascularized transplantater, den tidligere viste overlegne mekaniske egenskaber, som manifesterer sig ved øget stivhed og styrke (

Figur 1
Figur 1. Graft vaskularisering. (A) Densiteten af CD31-positive kar, målt ved en og to uger efter implantation sammenlignet med kontrolgruppen. Alle værdier er normaliseret til graft området (mm2). * = T-test p <0,05. (B) Funktionel vaskulær densitet (FVD) ved en og to uger efter implantation. Ingen signifikant forskel blev observeret, p = 0,08 (t-test). (C) Patent AV fartøjer som filmede med ultralyd i farven Doppler-mode. Blå og røde repræt blodgennemstrømningen i transplantatet. Den gule kvadrant skitserer graft området. (D) Graft perfusion på en og to uger efter implantation. (E og F) H & E farvning af flapperne integreret med værtsvævet: sort pil point levedygtige arterie; hvide pile peger abdominal muskelfibre; gule pile peger stillads rester. (H og G) FITC dextran fordeling som vist ved konfokal mikroskopi billeder. For alle bestemmelser, prøvens størrelse var n ≥ 3, og alle værdier er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Mekaniske egenskaber for klappen én ugeefter indsættelse. (A) Stivheden og (B) den maksimale trækstyrke (UTS) af klapperne. Kontrol står en tom transplantat uden celler, celler står tri-kultur podninger. * = T-test p <0,05, n = 3. Værdier er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De fremskridt inden for tissue engineering er blevet mødt med en stigende efterspørgsel efter alternative væv til genopbygning af forskellige vævstyper. En række syntetiske 1,17,18 og biologiske 14-16 materialer samt fabrikation metoder er blevet vurderet for deres evne til at håndtere disse krav. Trods fremskridt i klinisk pleje og i vævsmanipulering, genoprettelse af fuld tykkelse abdominale væg defekter fortsat en udfordring. Et væv tilstrækkelig til genopførelse af sådanne massive defekter skal være (1) tyk og (2) vaskulariseret, og demonstrere (3) mekaniske integritet, og (4) levedygtighed over tid 23.

Her præsenterer vi en trin-for-trin detaljeret protokol til at skabe en tyk, levedygtig, og vaskulariseret væv flap, der kan tjene som et alternativ til autologe væv flaps. Den fabrikerede flap blev bygget i to trin: (1) En PLLA / PLGA stillads blev implanteret omkring AV fartøjer af mouSE bagben og adskilt fra det omgivende væv for at muliggøre vaskularisering af AV kun skibe. (2) Den oprettede vaskulariseret, tykke væv flap blev derefter overført med AV fartøjer, der tjente som sin stilken, ind i en fuld tykkelse bugvæggen defekt.

Korrekt flap vaskularisering er afgørende for en vellykket integration, inden værten 17,18,24. Forskellige tilgange til at skabe vaskulariseret manipuleret væv for at forbedre udbuddet ilt og diffusion i tykke væv, er blevet drøftet i litteraturen. Blandt disse var fremgangsmåder, der involverer podning af endotelceller (EC'er) på forskellige typer stillads 13,20,25-30, forskellige teknikker til at levere angiogene faktorer over implantationsstedet (enten ved direkte administration ved injektion, anvendelse af transformerede celler, der udtrykker de faktorer 31 -34 eller langsom frigivelse fra forskellige stilladser 35,36), brug af bioreaktorer at sikre manipuleret væv perfusion 37 38,39. Her blev vævet transplantat vaskulariseret in vivo, ved udnyttelse af autologe fartøjer. Implantatet, som viste sig levedygtig, vaskulariseret og perfunderet, blev derefter overført som en tyk vævslap at reparere en fuld tykkelse bugvæggen defekt. En uge efter indsættelse, flappen var levedygtig og fremhævede tilstrækkelig mekanisk styrke til at understøtte den abdominale indvolde. Her brugte vi atymiske nøgne mus, der bærer et svækket immunsystem; når der anvendes enhver anden type mus eller et andet dyr, bør muligheden for immunreaktioner tages i betragtning (især når podning af stilladser med celler). Andre begrænsninger ved denne teknik indbefatter (1) overførsel af femorale AV fartøjer, der forsyner blodtilførslen til bagbenet. Men teknikken forlader profunda og dybe femorale fartøjer uberørt og ingen bagben iskæmi blev observeret efter flap overførsel. Desuden i større dyr og mennesker, at anvendeperifere kar vil blive rådgivet, da de er overflødige i kroppen; (2) den tid, der kræves for at opnå en passende vaskularisering før flap overførslen, kan være en begrænsende faktor i hastetilfælde; og (3) flap skabelse udføres in vivo, som kan begrænse dets relevans for mennesker. I fremtiden ønsker vi at udvikle et middel til at skabe denne flap ex vivo. Fordelen ved den foreliggende fremgangsmåde ligger i evnen til at forbedre dannelsen af ​​autolog væv (med autologe celler) omkring stilladset. Den resulterende væv viser et egnet alternativ til et autologt væv flap. Desuden kan stilladset podes med autologe celler før implantation, for yderligere at forbedre graft vaskularisering og integration i værtsvævet. Anvendelse af autologe celler og et biologisk nedbrydelige og biokompatible stillads, kan omgå den betydelige risiko for immuno-afstødningsreaktioner og præsentere et alternativ til autologe flapper samtidig undgå høst og postoperativ scarifikation.

Den beskrevne fremgangsmåde kan oversættes til forsøg i stor dyr og yderligere udvidet til kliniske forsøg på mennesker. Derudover kan det oversættes til at reparere beskadigede væv forskellige i kroppen. Hos mennesker og store dyr, kan flapperne dannes omkring perifere kar i stedet for på de femorale AV fartøjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12 (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32 (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69 (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18 (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28 (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193 (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27 (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. , Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7 (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).

Tags

Bioengineering klap tissue engineering stillads vaskularisering musemodel vaskulariseret væv muskler
Udviklet vaskulariserede Muskel Flap
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman,… More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter