Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

דש שריר כלי דם מהונדס

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

פגמים בדופן בטן לעתים קרובות מתעוררים בעקבות טראומה קשה, טיפול בסרטן, כוויות וההסרה של רשת נגועה. פגמים אלה לעתים קרובות כרוכים באובדן רקמה משמעותי, הדורשים ניתוחים מסובכים והצגת אתגר גדול עבור מנתחים פלסטיים שחזור 1-4. חוקרי הנדסת רקמות מחפשים מקורות חדשים לרקמות מלאכותיות בחנו חומרים שונים, מקורות תא וגורמי גדילה. שחזורים מוצלחים של רקמות שונות, כגון 5,6 קנה הנשימה, שלפוחית ​​השתן 7, קרנית 8, 9 עצם ועור 10, על ידי השתלה של רקמות מהונדסות דווחו בעבר. עם זאת, ייצור של רקמה מהונדסת כלי דם עבה, במיוחד לשיקום של פגמים גדולים, עדיין מהוות אתגר משמעותי בהנדסת רקמות.

אחד הגורמים העיקריים המגבילים את העובי של מבנה רקמת קיימא היא השליטה של ​​אספקת חמצן לחסרונות שלהתאי tituent. כאשר הסתמכות על דיפוזיה, לבנות עובי מוגבל לזה של שכבה דקה מאוד. המרחק המרבי בין החמצן ונימי אספקת מזין in vivo הוא כ 200 מיקרומטר, אשר בקורלציה עם מגבלת דיפוזיה של חמצן 11,12. כלי דם בלתי מספקים עלולים לגרום לאיסכמיה רקמות ולהסלים לספיגת רקמה או נמק 13.

בנוסף, החומר האידיאלי המשמש לשחזור רקמות חייב להיות ביולוגית ולא-חיסוני. גם הוא חייב להיות מסוגל לקדם אינטגרציה נוספת של תאי מארח עם החומר הביולוגי, ושמירה על שלמות מבנית. 1,17,18 מטריצות ביולוגיות וסינתטיות שונות 14-16 נחקרו בעבר לשיקום רקמות, אך השימוש בם יישארו מוגבל בשל חוסר אספקת דם יעיל, זיהומים או כוח רקמה מספק.

במחקר זה, תא-EMB ביולוגית,פיגום edded המורכב ממזון ותרופות אמריקאים (FDA) חומצת L-לקטית פולי -approved (PLLA) / פולי חומצה לקטית-שיתוף גליקולית (PLGA), הושתל סביב כלי עורק וריד הירך (AV) של עכבר בעירום ו נפרדו מהרקמה הסובבת, הבטחת כלי דם מכלי AV בלבד. שבוע לאחר ההשתלה, השתל היה קיימא, עבה וגם כלי דם. רקמת כלי דם עבה זה עם כלי AV, אז הועברה כדש pedicled לפגם בעובי מלא בבטן באותו העכבר. שבוע לאחר העברה-, הדש היה קיימא, כלי דם ומשולב היטב עם הרקמה הסובבת, נושאות חזקות מספיק כדי לתמוך הקרביים בטן. לפיכך, הדש המהונדס העבה, כלי דם ברקמה, הנושא pedicle אוטולוגית, מציג שיטה חדשנית לתיקון פגמים בדופן בטן בעובי מלא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים בטכניון. להליך זה, עכברי עירום athymic שמשו כדי להימנע מדחייה חיסונית. אם אתם משתמשים בסוג אחר של עכבר, צריכים להיות מגולחים העכברים לפני ההליך כירורגי והממשל של ציקלוספורין (או אחר תחליף נגד דחייה) מומלץ.

1. פיגום הכנה וסלולרית הטבעה

  1. הכן פיגומים מורכבים של 1: 1 תערובת של פולי-L-חומצת חלב (PLLA) וpolylactic-שיתוף גליקולית החומצה (PLGA), באופן הבא:
    1. ממיסים 500 מ"ג של PLLA ו -500 מ"ג של PLGA ב 10 מיליליטר כלורופורם.
    2. להוסיף 0.24 מיליליטר של תמיסת פולימר 0.4 גרם של חלקיקי נתרן כלורי נאספו בתבניות טפלון. השתמש בקוטר של 212-600 מיקרומטר מלח. לאפשר כלורופורם להתאדות O / N.
    3. לדלוף החוצה מלח באמצעות מים מזוקקים מובילים לפיגומי 3D נקבוביים ביניהם.
    4. חותך חתיכות פולימרבאמצעות מספריים, לאחר מכן להשרות באתנול 70% (V / V) למשך 30 דקות ולשטוף 3 פעמים ב PBS למשך 2 דקות לפני השימוש.
  2. הכן תלת-תרבות של התאים הבאים ב1: בינוני תא האנדותל 1 (EGM-2 בתוספת הרכיבים של ערכת כדור ובינוני תא שריר (הבינונית של Dulbecco המינימלי החיוני (DMEM), בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS ), 2.5% חיץ HEPES, 100 פניצילין / מיליליטר U, ו 0.1 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין (עט-דלקת פתרון).
    1. השתמש 0.5 x 10 6 C2C12 myoblasts, 0.9 x 10 6 תאים אנושיים וריד טבור אנדותל (HUVECs), ושל 0.2 x 10 6 fibroblasts רגיל האנושי עורי (NHDF).
  3. מערבבים את התאים יחד בצינור microcentrifuge ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 4 דקות, לשאוב את המדיום מחדש להשעות גלולה בתערובת של פתרון מטריצה ​​4 קרח μl הקר תאי ו -4 μl מדיום סלולארי.
  4. חותכים חתיכה של 10 מ"מ 7 מ"מ x 1 מ"מ x (עובי x רוחב x אורך) PLLA / PLGפיגום וזרעי ההשעיה התא בצלחת 6-היטב, מאפשר פתרון מטריקס לבסס (30 דקות, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) לפני הוספת 4 מיליליטר מדיום סלולארי.
  5. דגירה הפיגומים לעשרה ימים לפני ההשתלה ולהחליף הבינוני בכל יום אחר.

2. לפני שתתחיל בהליך כירורגי

  1. הכן ולעקר את הכלים כירורגיים הבאים (החיטוי):, בסדר, מספריים קטנים ישר, מספריים אביב, מלקחיים ישר, קנס שקצהו, מלקחיים משוננים ובעל מחט.
  2. הכן תערובת של קטמין: פתרון xylazine בצינור microcentrifuge על ידי ערבוב 425 קטמין μl ו -75 xylazine μl במזרק 1 מיליליטר.
  3. לדלל 0.3 מ"ג עצירות / מיליליטר בתמיסת מלח סטרילית (1:20).

3. דש בנייה (שתל השרשה)

  1. שימוש במזרק אינסולין, להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין: xylazine (35 μl ל20 גרם של משקל גוף).
  2. תת עורי להזריק עצירות (ריכוז סופי של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם) לפני opperation.
  3. מניחים את העכבר על במה מחוממת ל -37 מעלות צלזיוס, כדי להבטיח טמפרטורת גוף נורמלית, ואז לאבטח את העכבר באמצעות תחבושת דביקה.
  4. בעזרת טיפים כותנה, לנהל סיכה משחה העין לעיניו של העכבר (כדי למנוע התייבשות).
  5. בעזרת טיפים כותנה, נקי אתר החתך עם יוד ולאחר מכן עם 70% אתנול, להקים שדה עבודה מזוהם.
  6. בעזרת מספריים קטנים ומלקחיים, לעשות חתך דרך העור, מהרמה של הברך לרצועה מפשעתי, במקביל לכלי הירך, עד עורק וריד הירך כלי (AV) נחשפים.
  7. החזק את העור כלפי מטה באמצעות מפשק, כדי לקבל גישה טובה יותר לרקמות.
  8. בעזרת מספריים אביב ובמלקחיים, לבודד זהירות כלי עורק וריד הירך מן הרקמה הסובבת. תתחיל מהרמה של lig מפשעתיאמנט להסתעפות של כלי רום בטן מעולים. השאר את profunda נגע, במטרה לשמר את זרימת דם לרגליים ולמנוע איסכמיה שלאחר מכן.
  9. מקפלים את השתל (מסעיף 1) סביב AV הירך החשוף, מתחת לprofunda ומעל הסתעפות לשוקה וAV proneal, ולהצטרף לקצוות שלה באמצעות 8-0 תפרי משי.
  10. כדי להבטיח כלי דם שתל על ידי נימי הנבטה מכלי AV הירך בלבד, לעטוף פיסת הלטקס מעוקר סביב השתל, ותפר עם 6-0 תפרים.
  11. סגור את העור שמעליה באמצעות 4-0 תפרי משי.
  12. צג העכבר הדוק עד להחלמה מההרדמה וכל יום לאחר מכן, עד השתל מועבר כדש. תת עורי להזריק עצירות (ריכוז סופי של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם) פעמיים ביום במשך 2-3 ימים.
    הערה: השתמש במלח בכל שלב, כדי למנוע התייבשות של הרקמות החשופות.

העברת 4. דש

  1. באחד אוpostimplantation שבועיים, להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין: xylazine (35 μl / 20 גר '), באמצעות מזרק אינסולין.
  2. תת עורי להזריק עצירות (ריכוז סופי של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם) לפני opperation.
  3. מניחים את העכבר על במה מחוממת ל -37 מעלות צלזיוס, כדי להבטיח טמפרטורת גוף נורמלית, ואז לאבטח את העכבר באמצעות תחבושת דביקה.
  4. בעזרת טיפים כותנה, להחיל סיכה משחה העין לעיניו של העכבר (כדי למנוע התייבשות).
  5. בעזרת טיפים כותנה, לנקות את אתר החתך (מאזור הברך ועד הבטן) עם יוד ולאחר מכן עם 70% אתנול, להקים שדה עבודה מזוהם.
  6. שימוש במספריים ומלקחיים, לפתוח בזהירות את התפרים בעור ו, באמצעות מספריים, לעשות חתך דרך העור המקביל לרצועה מפשעתי, ממשיך דרך עור הגחון.
  7. מוציא בזהירות את פיסת הלטקס עם מלקחיים ולחשוף את דש כלי הדם.
  8. באמצעות scissORS ומלקחיים, לנתח את דש הרקמה מהרקמות שמסביב.
  9. בעזרת מלקחיים ובעל מחט, ולקשור את הקצה הדיסטלי של AV הירך עם 8-0 תפרי משי כדי למנוע דימום מAV. אז, לצרוב את AV ברמה של הברך, distally למקופל רקמה המושתלת והתפרים 8-0.
  10. בעדינות להעביר AV הירך עטוף בשתל, לכיוון דופן בטן הגחון, הימנעות נזק לעורק, כדי לקבוע שבמרחק הפגם בעובי המלא צריך להיעשות.
    זהירות: משיכת העורק רחוקה מדי תגרום ניזק לעורק.
  11. שימוש במספריים עדינים, עושה חתך בדופן בטן הגחון.
  12. בעזרת מספריים אביב, לעשות חתך בשריר abdominus rectus. הסר קטע x 0.8 סנטימטר כ 1 סנטימטר של שריר abdominus rectus עם העור שמעליה.
  13. העבר את AV הירך, עטוף בשתל כלי הדם, כמו דש צירי, לפגם בעובי המלא בabdom הגחוןקיר INAL.
  14. לתפור את הדש לרקמת השריר המקיפה, באמצעות 8-0 תפרי משי, כדי למנוע שבר.
  15. כדי להימנע מתפירת האיברים הפנימיים, להעלות את השריר עם מלקחיים כאשר תפירת הדש לשרירי בטן. השאר את עור הגחון החשוף לחקות את האפקט של קיר בטן מלא פגם.
  16. לכסות את הפצע בעור עם גזה עם יוד ותחבושת סטרילית על מנת למנוע זיהום של האזור החשוף.
  17. לתפור את העור של הרגל באמצעות 4-0 תפרי משי.
  18. צג העכבר הדוק עד להחלמה מההרדמה וכל יום לאחר מכן, עד שיחזור של הדש. תת עורי להזריק עצירות (ריכוז סופי של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם) פעמיים ביום במשך 2-3 ימים.
  19. הערה: השתמש במלח בכל שלב כדי למנוע התייבשות של הרקמות החשופות.

5. קביעת אולטראסאונד של כלי הדם זלוף של השתל

הערה: לפני ההעברה, o זלוף כלי הדםו השתל נמדד בעת ובשבועות לאחר השתלה, על ידי בדיקת אולטרה סאונד.

  1. להרדים את העכבר באמצעות 2% isoflurane.
  2. מניחים את העכבר על במה מטלטלין מחוממת ל -38 מעלות צלזיוס, כדי להבטיח טמפרטורת גוף נורמלית, ואז לאבטח את העכבר באמצעות תחבושת דביקה.
  3. מצא את כלי עורק וריד הירך עם מתמר שאינו ליניארי שנקבע על B-המצב.
  4. לבחון את הפתיחות של כלי הירך של השתל באמצעות המתמר להגדיר על מצב דופלר הצבע.
  5. הכן חומר ניגוד-ממוקד שאינו בהתאם להוראות היצרן.
  6. חבר קטטר וריד זנב (צינורות סנטימטרים 12 עם מחט 27 G) למזרק 1 מיליליטר מלא מלוח. אבטח את המזרק ליד העכבר על שלב החימום (כדי למנוע תנועה של המזרק).
  7. חבר את הקטטר לוריד זנב העכבר ולאבטח את המחט.
  8. הזרק חלק המלוח לשני להבטיח שזריקות נעשות לתוך הווריד ולמלאצינורות עם מי מלח (כדי למנוע בועות אוויר).
  9. ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם 70 μl של חומר ניגוד ולהחליף את המזרק המלוח עם מזרק חומר ניגוד.
  10. הגדרת אולטרסאונד להזרקת חומר ניגוד תמונה של. במאפיינים של המצב שאינו ליניארי להגדיר את מספר המסגרות ל -1,500 ודופק ההפרעה עד 30% מהמסגרות.
    הערה: לאחר דופק השיבוש, microbubbles מחדש למלא את כלי בשיעור שתלוי בקצב הזרימה של microbubbles בנימי ואינו תלוי בקצב ההזרקה של microbubbles. מספר המסגרות ניתן לשנות בהתאם לזמן מילוי 19,20.
  11. לאט לאט להזריק חומר הניגוד לוריד הזנב.
  12. צלם תמונות במצב ניגודיות שאינו ליניארי של מערכת אולטרסאונד ברזולוציה הגבוהה.
  13. לנתח את התוצאות באמצעות התוכנה, כפי שתואר קודם לכן 19,20.
    1. צייר אזור של עניין (ROI) בim התמונה המתקבלתmediately אחרי דופק השיבוש בניגוד-המצב. ההחזר על ההשקעה צריכה להתוות את האזור המלא על ידי חומר הניגוד בלבד.
    2. לחשב את שיפור השיא (PE), שהוא היחס של העצמה הממוצעת של האות שאינה ליניארי לאחר ההזרקה של microbubbles לעומת אחרי דופק השיבוש, והוא מדד של זלוף הנפח.
    3. לחשב את קצב הזרימה, אשר נקבע מרגע (T) שחולף עד שאות השיא (P).

6. קביעת היקף שתל כלי הדם

הערה: כלי דם שתל רקמת המידה נקבעה שבוע או שבועות לאחר ההשתלה.

  1. שימוש במזרק אינסולין, להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין: xylazine (35 μl / 20 גר ').
  2. באמצעות מזרק 1 מיליליטר, הווריד להזריק 200 μl של 10 מ"ג / מיליליטר והעמסת dextran isothiocyanate מצומדות- (FITC-dextran, MW = 500,000) לוריד הזנב. </ Li>
  3. עשר שניות לאחר השלמת הזריקה, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
  4. פתח את הרגל של העכבר ולחשוף את השתל.
  5. לשטוף את אזור השתל עם מי מלח פוספט (PBS) ולהחיל 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין.
  6. תמונת השתל ברגל העכבר, באמצעות מיקרוסקופ confocal.
  7. לכמת צפיפות פונקציונלית כלי (FVD).
    1. לבודד את הערוץ הירוק (עירור = 488 ננומטר) של התמונות המיקרוסקופיות confocal.
    2. להעביר את התמונות וכתוצאה מכך דרך מסנן גבוה לעבור, כדי להדגיש את מבני ניגודיות גבוהה.
    3. השתמש במסנן despeckling להסיר רעש שיכול היה מוגבר על ידי המסנן גבוה לעבור.
    4. להגדיר את הערך של סף על התמונה וכתוצאה מכך; ערך הסף הוא מותאם כך את התכונות ומבנים בתמונה המקורית נראות בתמונה בינארי.
    5. החל גודל-סף, כך שקבוצות של פיקסלים המחוברים רק גדולות יותר מsiz המוגדרסף דואר להישאר בתמונה בינארי.
    6. מתאר את השלד של כלי השיט בשתל באמצעות האלגוריתם של ג'אנג-הסואן 21.
    7. לחשב את FVD ידי סיכום האורכים של קו האמצע של כל כלי וחלוקת התוצאה בשטח של ההחזר על ההשקעה.

7. immunohistological והיסטולוגית הכתמה של השתל

  1. מכתים immunohistological
    1. לאחר ההדמיה confocal, לאחזר את השתל באמצעות מספריים קטנים ומלקחיים. לנתח כלי AV בשני הקצוות של השתל ולאחזר את השתל.
    2. לתקן את השתלים ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין למשך 30 דקות - שעה 2.
    3. מניחים את השתלים בקלטות היסטולוגיה והחנות באתנול 70% עד הטבעת פרפין.
    4. להטביע בפרפין באמצעות קיבוע סטנדרטי והטבעת פרוטוקול 22 ופורסים רקמות פרפין מוטבעות לתוך 5 מיקרומטר פרוסות באמצעות microtome. פורסים את כל הרקמות בניצב לAVכלי.
    5. Deparaffinize הסעיפים-מוטבע פרפין על ידי טבילה בקסילן 100% פעמיים, במשך 10 דקות כל אחד.
    6. מסדרים את השקופיות בצנצנת Coplin פלסטיק 250 מיליליטר.
    7. רעננות ידי טבילות סידורי בהפחתת ריכוזים של אתנול (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% ומים מזוקקים פעמיים (DDW)) במשך 3 דקות כל אחד.
    8. הכן פתרון הסרת מסכות אנטיגן על ידי דילול 2.35 מיליליטר של תמיסת הסרת מסכות אנטיגן עם 250 מ"ל של DDW. מחממים את פתרון הסרת מסכות אנטיגן למשך 2 דקות במיקרוגל להגדיר עד 95 מעלות צלזיוס.
    9. הוסף את השקופיות לפתרון הסרת מסכות אנטיגן מחומם מראש בחום שוב במשך 3 דקות במיקרוגל להגדיר עד 95 מעלות צלזיוס. לקרר את השקופיות ל- C ° 50.
    10. מחממים שוב למשך 2 דקות ולאחר מכן מגניב RT.
    11. דגירה השקופיות בH 3.3% 2 O 2 פתרון במתנול במשך 10 דקות, ב RT כדי להרוות את הפעילות של peroxidase אנדוגני ולאחר מכן לשטוף פעמים PBS.
    12. הכן תא דגירה: abso הרטוב המקוםגיליונות rbent בתוך קופסא היסטולוגיה ולייבש את השקופיות באמצעות מגבי משימה עדינים.
    13. מעגל אזור הפרוסה בשקופית באמצעות עט הידרופובי דגירה במשך 30 דקות ב RT, עם כ -50 μl של סרום עז פתרון חסימה (2%, שהוכן בPBS) לכל פרוסה.
    14. לדלל את ארנב נוגדן אנטי CD31 01:50 בחסימת פתרון, יחול כ -50 נוגדן μl לכל פרוסה ודגירת O / N, ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים עם PBS, 5 דקות כל אחד.
    15. לדלל את הנוגדן נגד הארנב העז biotinylated המשני 1: 400 ב PBS, מקום על שקופיות כ -50 μl של נוגדן לכל פרוסה דגירה במשך 30 דקות ב RT.
    16. לשטוף 3 פעמים עם PBS, 5 דקות כל אחד.
    17. לדלל streptavidin-peroxidase 1: 400 ב- PBS, להחיל כ -50 μl לכל פרוסה והדגירה עם שקופיות למשך 30 דקות, ב RT. לשטוף 3 פעמים עם PBS, 5 דקות כל אחד.
    18. החל מצע 50 μl של aminoethylcarbazole (AEC) כ לכל פרוסה, על פי היצרן & #8217; של הוראות. טובלים את השקופיות בDDW כדי לעצור את התגובה.
    19. להכתים את הגרעינים בכחול על ידי טבילה בסעיפים 50 כ μl של פתרון hematoxylin של מאיר למשך 2 דקות. בעדינות ולשטוף במים ולאחר מכן לכסות את החלקים עם ההרכבה בינונית.
    20. לכמת מכתים CD31 החיובי בגישה כפולה סמיות. צביעת CD31 מופיעה ככתם חום. בחר 4-5 תחומים שונים בתחום צפייה בהגדלה 40X תחת מיקרוסקופ דו עיני. לספור את מספר לום CD31 החיובי.
      1. לחשב את המספר הממוצע של לומן CD31 החיובי לפיגום על ידי חלוקת המספר הכולל של לומן נספר במספר תחומים וfieldarea (על פי הנתונים המשקפת).
        הערה: להחיל מגיב הנפח חייב להיות מספיק כדי לכסות את הפרוסה התוותה כולו.
  2. מכתים היסטולוגית
    1. תקן שתלים ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין.
    2. שתלים להטביע בתקן פרפין באמצעותקיבעון ונהלי הטבעה.
    3. הסר את פרפין מהחלקים-מוטבע פרפין על ידי טבילה בקסילן 100% פעמיים במשך 10 דקות.
    4. לשטוף מהר פעמיים להחזרת נוזלים בisopropanol 100%.
    5. לשטוף מהר פעמיים אתנול 95%.
    6. לשטוף שלוש פעמים במים ברז.
    7. לטבול בHematoxylin במשך 10 דקות.
    8. לשטוף שלוש פעמים במים ברז.
    9. Immere בEosin למשך 2 דקות.
    10. לשטוף מהיר ליבש ב -95% אתנול פעמיים.
    11. isopropanol מהירה לשטוף 100% פעמיים.
    12. קסילן המהיר לשטוף 100% פעמיים.
    13. לכסות עם דבק DPX עם מכסה זכוכית 1.5 מ"מ עובי.
    14. תמונה באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה 40X.

8. הערכת תכונות מכאנית

  1. אחזר את השתל באמצעות מספריים קטנים ומלקחיים.
  2. יש לשטוף את השתל בPBS.
  3. מדוד את הרוחב ועובי של השתל ולחשב את שטח חתך רוחב כמוכפל בעובי.
  4. לָנוּדואר מכשיר הבדיקה כדי ליצור עקומת מתח מתח של שתלי התייבשות.
    1. הר השתל בין אוחז המתיחה המערכת ולמדוד את האורך הסופי בין שתי נקודות אחיזה (כלומר, אורך ראשוני).
    2. החל שיעור מתח של 0.01 מ"מ / שנייה, עד שכישלון.
    3. רשום את הכוח שפותח והעקירה באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
    4. ליצור עקומת מתח מתח בMatlab.
      1. חישוב מתח על פי תזוזה מחולקת באורך הראשוני. מתח מחושב ככוח המדוד מחולק בשטח החתך.
      2. לקבוע נוקשות כשיפוע של יניארי-האזור בעקומת מתח מתח והנקודה של העקומה המרבית הוא כוח המתיחה האולטימטיבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כלי דם שתל וזלוף in vivo

השתלים הושתלו שבוע או שבועות עד להעברתם כדשים ציריות. בעת ובשבועות לאחר ההשתלה, תצפית ברוטו של אזור השתל גילתה שתלי רקמת קיימא וכלי דם. שתלים אלה הוכיחו את עצמו כלי דם מאוד, כפי שנקבעו על ידי immunostaining החיובי CD31 (איור 1 א), וperfused מאוד, כפי שמעידים על ידי מדידות הזרקה לוריד הזנב ואולטרסאונד FITC-dextran. כלי רבים כבר נצפו בלאחר ההשתלה של השבוע, מספר שעלה באופן משמעותי לאחר שבוע נוסף בקרבת כלי AV. קביעת צפיפות כלי הפונקציונלית (FVD) (איור 1) מבוססת-dextran FITC הראתה כי השתל היה כלי דם מאוד בpostimplantation אחד בשבוע וכי לא חלו שינויים משמעותיים התרחשו בשבוע נוסף in vivo. patency הכלי וזלוף הודגמועל ידי ההדמיה אולטרה סאונד (FVD היה 5.71 מ"מ - 1 ± 0.51 מ"מ - 1 ו10.28 מ"מ - 1 ± 2.71 מ"מ - 1, אחד ושבועיים לאחר ההשתלה, בהתאמה) איור 1 ג אישר patency מארח הירך כלי ויושרה לאחר השתלת שתל. . יתר על כן, בדיקת ultrasonographic חשפה זלוף בתוך אזור השתל, שהיה מעט גבוה יותר שבועיים לאחר ההשתלה בהשוואה לשבוע אחד לאחר ההשתלה (1D איור).

מאפייני דש

בדיקה גולמית של דשי שבוע שלאחר העברה-גילתה רקמת קיימא, כלי דם ומשולבת היטב. הדשים עברו מצורף משרד לסביבתם. כאשר משווה את הדשים מראש כלי דם, משובץ תא לשלוט acellular, שתלי nonvascularized, לשעבר הראו תכונות מכאניות מעולים, כפי שבא לידי ביטוי בקשיחות מוגברת וכוח (

איור 1
איור 1. כלי דם שתל. () הצפיפות של כלי CD31 חיובי, הנמדדים באחד ושבועיים postimplantation בהשוואה לקבוצת ביקורת. כל הערכים מנורמלים לאזור השתל (2 מ"מ). * = P T-המבחן <0.05. (ב) בצפיפות כלי דם פונקציונלית (FVD) בpostimplantation אחד ושבועיים. לא נצפה הבדל משמעותי, p = 0.08 (T-מבחן). (ג) כלי AV פטנטים כהדמיה באמצעות אולטרסאונד במצב דופלר הצבע. כחול ואדום represent את זרימת הדם בשתל. רבע הצהוב מתאר את אזור השתל. זלוף (ד) שתל בpostimplantation אחד ושבועיים. צביעת H & E של הדשים משולבים עם רקמת המארח (E ו- F): נקודת חץ שחורה עורק קיימא; חצים לבנים מצביעים סיבי שריר בטן; חיצים צהובים מצביעים שרידי פיגום. (H ו- G) הפצת dextran FITC כפי שמוצג על ידי תמונות מיקרוסקופיה confocal. לכל הקביעות, גודל המדגם היה n ≥ 3 ואת כל הערכים מיוצגים כשגיאת ± סטנדרטית הממוצעת של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תכונות מכאניות של הדש בשבוע אחדלאחר העברה. () הקשיחות וחוזק המתיחה האולטימטיבית (UTS) של הדשים (B). שליטה עומדת שתל ריק ללא תאים, תאים עומד שתלים תלת-תרבות. * = P T-המבחן <0.05, n = 3. ערכים מיוצגים כשגיאת ± סטנדרטית הממוצעת של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההתקדמות בהנדסת רקמות כבר נפגשה עם דרישה גוברת לרקמות תחליף לבנייה מחדש של רקמות מסוגים שונים. מגוון של 14-16 חומרים סינטטיים 1,17,18 וביולוגיים, כמו גם שיטות ייצור כבר העריך ליכולתם כדי לטפל בדרישות אלה. עם זאת, למרות ההתקדמות בטיפול קליני ובהנדסת רקמות, השיקום של פגמים בדופן בטן בעובי מלאים עדיין מהווה אתגר. רקמה הולמת לשיקום של פגמים מסיביים כזה חייבת להיות (1) עבה ו( 2) כלי דם, ולהפגין (3) שלמות מכאנית, ו( 4) כדאיות לאורך זמן 23.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד ליצירת דש רקמה עבה, בת קיימא, וכלי דם, אשר יכול לשמש כתחליף לדשי רקמה אוטולוגית. הדש המפוברק נבנה בשני שלבים: (1) פיגום PLLA / PLGA הושתל סביב כלי AV של mouhindlimb se ומופרד מהרקמה הסובבת כדי לאפשר כלי דם על ידי כלי AV בלבד. (2) הדש נוצר כלי הדם, רקמה עבה אז הועבר עם כלי AV, ששימשו כpedicle, בקיר בטן פגם בעובי מלא.

כלי דם דש נכונים הוא חיוני לשילוב המוצלח שלה בתוך 17,18,24 המארח. גישות שונות ליצירת רקמה מהונדסת כלי דם על מנת לשפר את אספקת חמצן ודיפוזיה ברקמות עבות, נידונו בספרות. בין אלה היו שיטות מעורבות זריעה של תאי האנדותל (EC) על סוגים שונים פיגום 13,20,25-30, בטכניקות שונות כדי לספק גורמי angiogenic לאתר ההשתלה (או על ידי מנהל ישיר על ידי הזרקה, שימוש בתאים הפכו מבטא את הגורמים 31 שחרור -34 או איטי מפיגומים שונים 35,36), השימוש בbioreactors כדי להבטיח זלוף רקמות מהונדסות 37 38,39. כאן, שתל רקמת כלי הדם in vivo, על ידי ניצול של כלי אוטולוגית. השתל, אשר הוכיח קיימא, כלי דם וperfused, אז הועבר כדש רקמה עבה כדי לתקן פגם קיר בטן בעובי מלא. שבוע לאחר העברה-, הדש היה קיימא וכולל את כל תכונות חוזק מכאני מספיק כדי לתמוך באיברים הפנימיים בבטן. כאן, השתמשנו בעכברי עירום athymic, אשר נושאים את מערכת חיסונית לקויה; בעת שימוש בכל סוג אחר של עכבר או בעל חיים אחרים, את האפשרות של תגובות חיסוני צריכה להילקח בחשבון (במיוחד כאשר זריעת הפיגומים עם תאים). מגבלות אחרות של טכניקה זו כוללות (1) ההעברה של כלי AV הירך, המספקים זרימת הדם לhindlimb. עם זאת, הטכניקה משאירה profunda וכלי הירך העמוקים נגעה ולא איסכמיה hindlimb נצפתה לאחר העברת דש. יתר על כן, בבעלי חיים גדולים יותר ובבני אדם, השימוש בכלי היקפיים יהיו מומלץ כפי שהם מיותרים בגוף; את הזמן הנדרש כדי להשיג כלי דם נאותים לפני דש העברה, יכול להיות גורם מגביל במקרים דחופים (2); ו- (3) יצירת דש מבוצעת in vivo, אשר יכולה להגביל את הרלוונטיות שלה בבני אדם. בעתיד, אנו שואפים לפתח אמצעי ליצירת דש לשעבר vivo זה. יתרונה של השיטה שהוצגה טמון ביכולת לשפר את ההיווצרות של רקמה אוטולוגית (עם תאים עצמיים) סביב הפיגום. הרקמה וכתוצאה מכך מציגה חלופה מתאימה לדש רקמה אוטולוגית. יתר על כן, הפיגום ניתן זרע עם תאים לפני השתלה אוטולוגית, כדי לשפר את כלי דם שתל ואינטגרציה בתוך רקמת המארח נוסף. שימוש בתאי אוטולוגי ופיגום מתכלה וביולוגי, יכול לעקוף את הסיכון המשמעותי של תגובות חיסוני דחייה ולהציג אלטרנטיבה לדשים אוטולוגית תוך הימנעות קצירה וscarifi לאחר הניתוחקטיון.

השיטה המתוארת יכולה מתורגמת לניסויים בבעלי חיים גדולים ומורחבת נוספים לניסויים קליניים בבני אדם. יתר על כן זה יכול להיות מתורגם לתיקון רקמות פגועות שונות בגוף. בבני אדם ובחיות גדולות, יכולים להיות שנוצרו הדשים סביב כלי היקפיים במקום מכלי AV הירך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12 (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32 (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69 (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18 (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28 (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193 (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27 (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. , Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7 (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 107 דש הנדסת רקמות פיגום כלי דם מודל עכבר רקמת כלי דם שרירים
דש שריר כלי דם מהונדס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman,… More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter