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Bioengineering

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

doi: 10.3791/52984 Published: January 11, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

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Difetti della parete addominale spesso sorgono a seguito di traumi gravi, il trattamento del cancro, le ustioni e la rimozione della rete infetti. Questi difetti spesso comportano una significativa perdita di tessuto, che richiedono procedure chirurgiche complesse e la presentazione di una grande sfida per i chirurghi plastici di ricostruzione 1-4. Ricercatori di ingegneria dei tessuti alla ricerca di nuove fonti per i tessuti artificiali hanno esplorato diversi materiali, fonti di cellule e fattori di crescita. Restauri positivo di vari tessuti, come trachea 5,6, vescica 7, cornea 8, 9 e osso pelle 10, per impiantazione di tessuti ingegnerizzati sono stati segnalati in precedenza. Tuttavia, la fabbricazione di uno spesso ingegneria tessutale vascolarizzato, in particolare per la ricostruzione di grandi difetti, rimane una sfida significativa in ingegneria dei tessuti.

Uno dei principali fattori limitanti lo spessore di un costrutto tessuto vitale è il controllo dell'alimentazione di ossigeno ad suoi svantaggicellule tituent. Quando basandosi sulla diffusione, costruire spessore è limitato a quello di uno strato molto sottile. La distanza massima tra ossigeno e nutrienti capillari fornitura in vivo è di circa 200 micron, che è correlato con il limite diffusione dell'ossigeno 11,12. Vascolarizzazione insufficiente può provocare ischemia tissutale e aumentare al riassorbimento del tessuto o necrosi 13.

Inoltre, il materiale ideale utilizzato per la ricostruzione del tessuto deve essere biocompatibile e non immunogenica. Deve anche essere in grado di promuovere una maggiore integrazione di cellule ospiti con il biomateriale, e mantenendo l'integrità strutturale. Vari biologici 14-16 e sintetiche 1,17,18 matrici sono stati precedentemente esplorati per la ricostruzione dei tessuti, ma il loro uso rimane limitato a causa della mancanza di afflusso di sangue efficace, infezioni o la forza del tessuto insufficiente.

In questo studio, un biocompatibile, cell-embimpalcatura edded composto da Food and Drug Administration (FDA) l'acido L-lattico poli -approvato (PLLA) / poli acido lattico-co-glicolico (PLGA), è stato impiantato intorno all'arteria femorale e vena (AV) le navi di un topo nudo e separato dal tessuto circostante, assicurando vascolarizzazione solo dai vasi AV. Una settimana dopo l'impianto, l'innesto è stato vitale, denso e ben vascolarizzato. Questo tessuto vascolarizzato spessore con vasi AV, è stato poi trasferito come lembo peduncolato un difetto a tutto spessore addominale nel mouse stesso. Una settimana dopo il trasferimento, il lembo era praticabile, vascolarizzato e ben integrato con il tessuto circostante, tenendo forza sufficiente a sostenere visceri addominali. Così, la spessa, lembo di tessuto vascolarizzato ingegneria, recanti un peduncolo autologo, presenta un nuovo metodo per la riparazione di difetti della parete addominale a tutto spessore.

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Protocol

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Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato delle Etico di esperimenti su animali del Technion. Per questa procedura, topi nudi atimici sono stati usati per evitare il rigetto immunologico. Se si utilizza un altro tipo di mouse, i topi dovrebbero essere rasata prima della procedura chirurgica e la somministrazione di ciclosporina (o un altro sostituto anti-rigetto) è raccomandato.

1. Ponteggio Preparazione e Cell Embedding

  1. Preparare ponteggi composto da 1: 1 miscela di poli-L-lattico-acido (PLLA) e polilattico-glicolico-co-acido (PLGA), nel modo seguente:
    1. Sciogliere 500 mg di PLLA e 500 mg di PLGA in 10 ml di cloroformio.
    2. Aggiungere 0,24 ml della soluzione di polimero a 0,4 g di particelle di cloruro di sodio raccolti in Teflon stampi. Utilizzare un diametro di 212-600 micron di sale. Lasciare che il cloroformio evaporare O / N.
    3. Percolare il sale utilizzando acqua distillata che porta a interconnessi scaffold 3D porosi.
    4. Tagliare pezzi di polimeriutilizzando un paio di forbici, poi immergere in 70% di etanolo (v / v) per 30 minuti e lavare 3 volte in PBS per 2 minuti prima dell'uso.
  2. Preparare un tri-coltura delle seguenti cellule in 1: medio cella 1 endoteliale (EGM-2 integrato con i componenti del suo kit proiettile e medie cellule muscolari (mezzo essenziale minimo di Dulbecco (DMEM), supplementato con siero bovino fetale al 10% (FBS ), 2,5% tampone HEPES, 100 U / ml di penicillina, e 0,1 mg / ml di streptomicina (Pen-Strep Solution).
    1. Utilizzare 0,5 x 10 6 C2C12 mioblasti, 0,9 x 10 6 vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) e 0,2 x 10 6 normali fibroblasti dermici umani (NHDF).
  3. Mescolare insieme le cellule in una provetta e centrifugare a 200 xg per 4 minuti, aspirare il terreno e risospendere il pellet in una miscela di soluzione di matrice extracellulare freddo 4 microlitri ghiaccio e 4 microlitri medio cellule.
  4. Tagliare un pezzo di 10 mm x 7 mm x 1 mm (lunghezza x larghezza x spessore) PLLA / PLGUn ponteggio e Seed la sospensione cellulare in una piastra da 6 pozzetti, lasciare che la soluzione matrice extracellulare solidificare (30 min, 37 ° C, 5% CO 2) prima di aggiungere 4 ml di mezzo cellulare.
  5. Incubare le impalcature per dieci giorni prima dell'impianto e sostituire il mezzo a giorni alterni.

2. Prima di avviare la procedura chirurgica

  1. Preparare e sterilizzare (autoclave) i seguenti strumenti chirurgici: un piccolo, multa, forbici diritte, un paio di forbici a molla, una scala, pinze punta fine, una pinza dentata e un porta-aghi.
  2. Preparare una miscela di ketamina: soluzione xylazina in una provetta mescolando 425 ml di ketamina e 75 xylazina microlitri in una siringa da 1 ml.
  3. Diluire 0,3 mg / ml in soluzione fisiologica sterile buprenorfina (1,20).

3. Flap costruzione (Graft impianto)

  1. Utilizzando una siringa da insulina, anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina: xylazina (35 microlitri per20 g di peso corporeo).
  2. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) prima della opperation.
  3. Posizionare il mouse su un palco riscaldato a 37 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo.
  4. Utilizzando punte di cotone, amministrare lubrificante pomata occhio agli occhi del mouse (per evitare la disidratazione).
  5. Usando punte di cotone, pulire il sito di incisione con iodio e poi con il 70% di etanolo, per stabilire un campo di lavoro asettico.
  6. Utilizzando piccole forbici e pinze, fare un'incisione attraverso la pelle, dal livello del ginocchio per legamento inguinale, parallelo ai vasi femorali, fino l'arteria femorale e vena (AV) navi sono esposti.
  7. Tenere la pelle verso il basso con un divaricatore, per ottenere un migliore accesso al tessuto.
  8. Utilizzando forbici primavera e pinze, isolare con cura i vasi arteria e vena femorale dal tessuto circostante. Inizia dal livello della lig inguinaleament alla biforcazione dei vasi epigastrici superiori. Lasciare la profunda intatto, al fine di preservare il flusso di sangue alla gamba e prevenire la conseguente ischemia.
  9. Piegare l'innesto (dal punto 1) intorno al AV femorale esposta, sotto la profunda e al di sopra della biforcazione al tibiale e proneal AV, e unire le estremità con 8-0 punti di sutura in seta.
  10. Per garantire la vascolarizzazione dell'impianto dai capillari che spuntano solo dai vasi femorali AV, avvolgere un pezzo di lattice sterile intorno al trapianto, e suturare con 6-0 punti di sutura.
  11. Chiudere la pelle sovrastante con 4-0 punti di sutura in seta.
  12. Monitorare il mouse strettamente fino al recupero dall'anestesia e ogni giorno successivo, fino a quando l'innesto viene trasferito come lembo. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2-3 giorni.
    NOTA: Utilizzare soluzione salina in ogni fase, per evitare la disidratazione del tessuto esposto.

4. Flap Transfer

  1. Ad una odue settimane dopo l'impianto, anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina: xilazina (35 ml / 20 g), utilizzando una siringa da insulina.
  2. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) prima della opperation.
  3. Posizionare il mouse su un palco riscaldato a 37 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo.
  4. Utilizzando punte di cotone, applicare lubrificante pomata occhio agli occhi del mouse (per evitare la disidratazione).
  5. Utilizzando punte di cotone, pulire il sito di incisione (dalla zona del ginocchio per l'addome) con iodio e poi con il 70% di etanolo, per stabilire un campo di lavoro asettico.
  6. Utilizzando un paio di forbici e pinze, aprire con attenzione i punti di sutura nella pelle e, utilizzando un paio di forbici, fare un'incisione attraverso la pelle parallela al legamento inguinale, proseguendo attraverso la pelle ventrale.
  7. Rimuovere con attenzione il pezzo di lattice con una pinza ed esporre il lembo vascolarizzato.
  8. Utilizzando un SCISSors e pinze, sezionare il lembo di tessuto dal tessuto circostante.
  9. Utilizzando una pinza e un porta-aghi, legare l'estremità distale del femore AV con 8-0 punti di sutura in seta per prevenire le emorragie dal AV. Poi, cauterizzare la AV a livello del ginocchio, distalmente al tessuto impiantato ripiegato e le suture 8-0.
  10. Trasferire delicatamente il AV femorale avvolto dal trapianto, verso la parete addominale ventrale, evitando di danneggiare l'arteria, per determinare a quale distanza il difetto a tutto spessore dovrebbe essere fatto.
    ATTENZIONE: Tirando l'arteria troppo per evitare di danneggiare l'arteria.
  11. Utilizzando una multa forbici, fare un'incisione nella parete addominale ventrale.
  12. Utilizzando un paio di forbici a molla, fare un'incisione nel muscolo retto addominale. Rimuovere un segmento x 0,8 centimetri circa 1 cm del muscolo retto addominale con la pelle sovrastante.
  13. Trasferire il AV femorale, avvolto dal trapianto vascolarizzato, come un lembo assiale, al difetto a tutto spessore nel abdom ventralemuro inale.
  14. Suturare il lembo di tessuto muscolare circostante, utilizzando 8-0 punti di sutura in seta, per evitare ernia.
  15. Per evitare di sutura gli organi interni, aumentare il muscolo con una pinza quando la sutura del lembo al muscolo addominale. Lasciare la cute ventrale esposta per simulare l'effetto di una completa difetto della parete addominale.
  16. Coprire la ferita della pelle con garza iodato e una benda sterile per prevenire la contaminazione della superficie esposta.
  17. Suturare la pelle della gamba utilizzando 4-0 suture di seta.
  18. Monitorare il mouse strettamente fino al recupero dall'anestesia e ogni giorno successivo, fino recupero del lembo. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2-3 giorni.
  19. NOTA: Utilizzare soluzione salina in ogni fase per evitare la disidratazione del tessuto esposto.

5. Determinazione di Ecografia Vascolare perfusione del Graft

NOTA: Prima di trasferimento, la perfusione vascolare of l'innesto viene misurata a una e due settimane dopo l'impianto, con l'ecografia.

  1. Anestetizzare il mouse utilizzando 2% isoflurano.
  2. Posizionare il mouse su una fase mobile riscaldato a 38 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo.
  3. Trova l'arteria e vena vasi femorali con trasduttore non lineare impostata sul B-mode.
  4. Esaminate la pervietà dei vasi femorali dell'innesto utilizzando il trasduttore impostato sulla modalità colore Doppler.
  5. Preparare agente non mirato contrasto secondo le istruzioni del produttore.
  6. Collegare un catetere vena della coda (12 cm tubo con un ago 27 G) ad una siringa da 1 ml riempito con soluzione fisiologica. Fissare la siringa accanto al mouse sulla fase di riscaldamento (per evitare il movimento della siringa).
  7. Collegare il catetere alla vena della coda del mouse e fissare l'ago.
  8. Iniettare alcuni dei salina sia garantire che le iniezioni vengono effettuate in vena e per riempireil tubo con soluzione salina (per evitare bolle d'aria).
  9. Riempire una siringa da 1 ml con 70 ml di mezzo di contrasto e sostituire la siringa salina con la siringa agente di contrasto.
  10. Impostare la ultrasuoni per iniezione immagine del mezzo di contrasto. Nelle proprietà della modalità non lineare impostare il numero di fotogrammi da 1.500 e l'impulso di interruzione 30% delle esposizioni.
    NOTA: Dopo l'impulso interruzione, le microbolle ri-riempire i vasi ad una velocità che dipende dalla portata delle microbolle nei capillari ed è indipendente dalla velocità di iniezione delle microbolle. Il numero di fotogrammi può essere modificato a seconda del tempo di riempimento 19,20.
  11. Iniettare lentamente il mezzo di contrasto nella vena della coda.
  12. Cattura immagini in modalità contrasto non lineare del sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione.
  13. Analizzare i risultati utilizzando il software, come descritto in precedenza 19,20.
    1. Disegnare una regione di interesse (ROI) sull'immagine ottenuta immediatamente dopo l'impulso interruzione nel contrasto modalità. Il ROI dovrebbe delineare l'area riempita solo dal mezzo di contrasto.
    2. Calcolare il miglioramento picco (PE), che è il rapporto tra l'intensità media del segnale non lineare dopo l'iniezione delle microbolle contro dopo l'impulso interruzione, ed è una misura del volume di perfusione.
    3. Calcolare la portata, che è determinato dal tempo (T) che deve trascorrere prima del segnale di picco (P).

6. Determinazione della misura di Graft Vascolarizzazione

NOTA: Il grado di innesto di tessuto vascolarizzazione è determinata una o due settimane dopo l'impianto.

  1. Utilizzando una siringa da insulina, anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina: xilazina (35 ml / 20 g).
  2. Uso 1 siringa ml, per via endovenosa iniettare 200 ml di 10 mg / isotiocianato-destrano coniugato ml fluoresceina (FITC-destrano, MW = 500.000) nella vena della coda. </ li>
  3. Dieci secondi dopo il completamento dell'iniezione, eutanasia il mouse per dislocazione cervicale.
  4. Aprire la gamba del mouse e esporre l'innesto.
  5. Lavare la zona di innesto con tampone fosfato (PBS) e applicare il 10% formalina tamponata neutra.
  6. Immagine l'innesto nella gamba del mouse, utilizzando un microscopio confocale.
  7. Quantificare densità dei vasi funzionale (FVD).
    1. Isolare il canale verde (eccitazione = 488 nm) delle immagini microscopiche confocale.
    2. Passare le immagini risultanti attraverso un filtro passa-alto, per accentuare le strutture ad alto contrasto.
    3. Utilizzare un filtro despeckling per rimuovere il rumore che potrebbe essere stato amplificato dal filtro passa-alto.
    4. Impostare il valore di soglia sulla immagine risultante; il valore di soglia è regolata in modo che le caratteristiche e le strutture dell'immagine originale sono visibili nell'immagine binaria.
    5. Applicare una size-soglia in modo che solo i gruppi di pixel connessi più grandi del siz definitae soglia rimangono nell'immagine binaria.
    6. Delineare lo scheletro dei vasi del trapianto utilizzando l'algoritmo di Zhang-Suen 21.
    7. Calcolare il FVD sommando le lunghezze della linea mediana di ciascun recipiente e dividendo il risultato per l'area della ROI.

7. immunoistologica e istologica colorazione della Graft

  1. Colorazione immunoistologico
    1. Dopo confocale, recuperare il trapianto utilizzando un piccolo forbici e pinze. Sezionare i vasi AV nelle due estremità dell'innesto e recuperare l'innesto.
    2. Fissare gli innesti nel 10% formalina tamponata neutra per 30 minuti - 2 ore.
    3. Posizionare gli innesti in cassette istologia e conservare in etanolo al 70% fino a paraffina.
    4. Incorpora in paraffina utilizzando una fissazione standard incorporare il protocollo 22 e affettare le paraffina tessuti in 5 micron fette utilizzando un microtomo. Tagliate tutto il tessuto perpendicolarmente al AVvasi.
    5. Deparaffinare sezioni incluse in paraffina per immersione in 100% xilene due volte, per 10 minuti ciascuno.
    6. Disponete le diapositive di una da 250 ml di plastica vaschetta Coplin.
    7. Reidratare per immersioni seriali in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% e acqua bidistillata (DDW)) per 3 minuti ciascuno.
    8. Preparare la soluzione smascheramento dell'antigene diluendo 2,35 ml di soluzione di smascheramento dell'antigene con 250 ml di DDW. Riscaldare la soluzione antigene smascheramento per 2 minuti in un forno impostato a 95 ° C.
    9. Inserire i vetrini nella soluzione di antigene smascheramento preriscaldata e riscaldare di nuovo per 3 minuti in un forno a microonde impostato a 95 ° C. Raffreddare i vetrini a 50 ° C.
    10. Riscaldare di nuovo per 2 minuti e poi raffreddare a RT.
    11. Incubare i vetrini in 3,3% H 2 O 2 soluzione in metanolo per 10 minuti, a temperatura ambiente per estinguere l'attività di perossidasi endogena e quindi risciacquare due volte in PBS.
    12. Preparare una camera di incubazione: posto abso bagnatofogli rbent all'interno di una scatola di istologia e asciugare le diapositive usando tergicristalli compito delicato.
    13. Circle l'area della sezione sul vetrino utilizzando una penna idrofobico e incubare per 30 min a temperatura ambiente, con circa 50 ml di siero di capra una soluzione bloccante (2%, preparato in PBS) per fetta.
    14. Diluire il coniglio anti-CD31 anticorpo 1:50 in soluzione bloccante, applicare circa il 50 microlitri anticorpo per fetta e incubare O / N, a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno.
    15. Diluire la capra biotinilato anti-coniglio anticorpo secondario 1: 400 in PBS, posto sopra scivoli circa 50 ml di anticorpi per fetta e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    16. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno.
    17. Diluire streptavidina-perossidasi 1: 400 in PBS, applicare circa 50 microlitri per fetta e incubare con vetrini per 30 minuti, a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno.
    18. Applicare circa 50 ml di aminoethylcarbazole (AEC) substrato per fetta, secondo il produttore & #8217; s istruzioni. Immergere i vetrini in DDW per arrestare la reazione.
    19. Stain i nuclei in blu immergendo sezioni in circa 50 ml di soluzione di ematossilina di Mayer per 2 min. Lavare delicatamente in acqua e poi coprire le sezioni con mezzo di montaggio.
    20. Quantificare CD31-positivo colorazione utilizzando un approccio a doppio cieco. CD31 colorazione appare come una macchia marrone. Scegliere 4-5 campi differenti in un campo visivo di ingrandimento 40X sotto un microscopio binoculare. Contare il numero di lumen CD31-positivo.
      1. Calcolare il numero medio di lumen CD31-positive per scaffold dividendo il numero totale di lumen contato con il numero di campi e fieldarea (secondo i dati binoculare).
        NOTA: Il volume di reagente applicato deve essere sufficiente a coprire l'intera fetta delineato.
  2. Colorazione istologica
    1. Fissare innesti nel 10% formalina tamponata neutra.
    2. Innesti Incorpora in paraffina utilizzando le normalifissazione e le procedure di incorporamento.
    3. Rimuovere la paraffina dalle sezioni incluse in paraffina per immersione in 100% xilene due volte per 10 min.
    4. Lavaggio rapido due volte per la reidratazione in 100% di isopropanolo.
    5. Lavaggio rapido due volte il 95% di etanolo.
    6. Lavare tre volte in acqua di rubinetto.
    7. Immergere in ematossilina per 10 min.
    8. Lavare tre volte in acqua di rubinetto.
    9. Immere in Eosina per 2 min.
    10. Lavaggio rapido disidratare in etanolo al 95% due volte.
    11. Veloce lavaggio 100% di isopropanolo due volte.
    12. Veloce lavaggio 100% xilene due volte.
    13. Coprire con colla DPX con vetro di copertura spessore di 1,5 mm.
    14. Immagine utilizzando microscopio in 40X di ingrandimento.

8. Proprietà meccaniche Assessment

  1. Recuperare l'innesto con un piccolo forbici e pinze.
  2. Sciacquare il trapianto in PBS.
  3. Misurare la larghezza e lo spessore dell'innesto e calcolare l'area della sezione trasversale come larghezza moltiplicato per lo spessore.
  4. Noivia e lo strumento di prova per generare una curva sforzo-deformazione degli innesti idrati.
    1. Montare l'innesto tra le impugnature di trazione del sistema e misurare la lunghezza finale tra le due impugnature (ad esempio, lunghezza iniziale).
    2. Applicare una velocità di deformazione di 0,01 mm / sec, fino alla rottura.
    3. Registrare la forza sviluppata e lo spostamento utilizzando il protocollo del produttore.
    4. Generare una curva sforzo-deformazione in Matlab.
      1. Calcolare ceppo secondo spostamento diviso per la lunghezza iniziale. Lo stress è calcolata come la forza misurata divisa per l'area della sezione trasversale.
      2. Determinare rigidità come la pendenza lineare regione nella curva sforzo-deformazione e il punto di massimo della curva è la resistenza a trazione.

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Representative Results

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Vascolarizzazione del trapianto e la perfusione in vivo

Gli innesti sono stati impiantati una o due settimane prima del loro trasferimento come lembi assiali. A uno e due settimane dopo l'impianto, l'osservazione al lordo della zona dell'innesto rivelato innesti di tessuto vitali e vascolarizzate. Questi innesti dimostrato di essere altamente vascolarizzati, come determinato mediante immunocolorazione CD31 positivo (Figura 1A) e altamente perfuso, come evidenziato da misurazioni iniezione coda vena e ultrasuoni FITC-destrano. Molti vasi sono stati già osservati a una settimana dopo l'impianto, un numero che è aumentato significativamente dopo un'ulteriore settimana in prossimità dei vasi AV. Determinazione a base di destrano FITC della densità dei vasi funzionale (FVD) (Figura 1B) ha mostrato che il trapianto è stato altamente vascolarizzato in una settimana post-impianto e che nessun cambiamento significativo ha avuto luogo nella settimana supplementare in vivo. Vessel pervietà e perfusione sono stati dimostratiper ecografia (il FVD era 5,71 millimetri - 1 ± 0,51 millimetri - 1 e 10,28 millimetri - 1 ± 2,71 millimetri - 1, una e due settimane dopo l'impianto, rispettivamente) Figura 1C confermato ospite femorale pervietà e integrità nave dopo trapianto impianto. . Inoltre, l'esame ecografico rivelato perfusione nell'area dell'innesto, di poco superiore due settimane dopo l'impianto rispetto ad una settimana post-impianto (Figura 1D).

Proprietà Flap

Esame superficiale dei lembi uno settimana post-trasferimento ha rivelato un tessuto vitale, vascolarizzato e ben integrati. I lembi sono stati sottoposti a fermo attaccamento ai loro dintorni. Quando si confrontano i lembi, cellulari-embedded pre-vascolarizzati per controllare acellulare, innesti nonvascularized, l'ex ha mostrato proprietà meccaniche superiori, come manifestato da una maggiore rigidità e resistenza (

Figura 1
Figura 1. Graft vascolarizzazione. (A) La densità dei vasi CD31-positive, misurata a una e due settimane dopo l'impianto, rispetto al gruppo di controllo. Tutti i valori sono normalizzati alla zona di innesto (2 mm). * = T-test p <0.05. (B) Funzionale densità vascolare (FVD) a una e due settimane post-impianto. Nessuna differenza significativa è stata osservata, p = 0,08 (T-test). (C) le navi AV brevetti come ripreso utilizzando gli ultrasuoni in modalità color Doppler. Blu e rosso rappret il flusso di sangue nel trapianto. Il quadrante giallo evidenzia la zona di innesto. (D) Graft perfusione a una e due settimane post-impianto. (E e F) H & E colorazione delle alette integrate con il tessuto ospite: nero punta della freccia arteria vitale; frecce bianche indicano fibre muscolari addominali; frecce gialle indicano resti patibolo. (H e G) distribuzione destrano FITC come mostrato dalle immagini di microscopia confocale. Per tutte le determinazioni, la dimensione del campione è stata n ≥ 3 e tutti i valori sono rappresentati come media ± errore standard della media. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Proprietà meccaniche del lembo uno settimanapost-trasferimento. (A) La rigidezza e (B) il carico di rottura (UTS) dei lembi. Controllo significa un innesto vuota senza le cellule, le cellule stand innesti tri-cultura. * = T-test p <0.05, n = 3. I valori sono rappresentati come media ± errore standard della media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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I progressi in ingegneria dei tessuti sono stati raggiunti con una crescente domanda per i tessuti sostitutivi per la ricostruzione dei vari tipi di tessuto. Una varietà di sintesi 1,17,18 e biologici 14-16 materiali, nonché i metodi di fabbricazione sono stati valutati per la loro capacità di far fronte a queste esigenze. Tuttavia, nonostante i progressi nella cura clinica e in ingegneria dei tessuti, il restauro di difetti della parete addominale a tutto spessore rimane una sfida. Un tessuto adeguato per la ricostruzione di tali difetti massicce deve essere (1) di spessore e (2) vascolarizzato, e dimostrare (3) integrità meccanica, e (4) vitalità nel tempo 23.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato passo-passo per la creazione di un lembo di tessuto denso, vitale, e vascolarizzato, che può servire come alternativa a lembi di tessuto autologhe. Il lembo fabbricato è stato costruito in due fasi: (1) A ponteggio PLLA / PLGA è stato impiantato intorno ai vasi AV del mouse hindlimb e separato dal tessuto circostante per permettere vascolarizzazione soltanto dalle navi AV. (2) Il vascolarizzato, lembo di tessuto denso creato è stato poi trasferito con i vasi AV, che serviva come il suo peduncolo, in un difetto della parete addominale a tutto spessore.

Lembo corretta vascolarizzazione è essenziale per la sua integrazione di successo all'interno del 17,18,24 ospite. Vari approcci per creare ingegneria tessutale vascolarizzato al fine di migliorare la fornitura di ossigeno e diffusione nei tessuti spessi, sono stati discussi in letteratura. Tra questi erano i metodi che comportano la semina delle cellule endoteliali (ECS) su vari tipi impalcatura 13,20,25-30, varie tecniche per la fornitura di fattori angiogenici al sito di impianto (sia per la somministrazione diretta per iniezione, l'uso di cellule trasformate esprimendo i fattori 31 rilascio -34 o lenta di diversi ponteggi 35,36), l'uso di bioreattori per garantire ingegneria tessutale perfusione 37 38,39. Qui, l'innesto di tessuto è stato vascolarizzato in vivo, per lo sfruttamento dei vasi autologhi. L'innesto, che si è rivelato vitale, vascolarizzato e perfuso, è stato poi trasferito come un lembo di tessuto spesso per riparare un difetto della parete addominale a tutto spessore. Una settimana dopo il trasferimento, il lembo era praticabile e caratterizzato resistenza meccanica sufficiente a sostenere i visceri addominali. Qui, abbiamo utilizzato topi nudi atimici, che portano un sistema immunitario compromesso; quando si utilizza qualsiasi altro tipo di mouse o altro animale, la possibilità di reazioni immunitarie dovrebbe essere preso in considerazione (soprattutto quando semina scaffold con cellule). Altre limitazioni di questa tecnica sono: (1) il trasferimento di navi AV femorali, che forniscono il flusso di sangue al hindlimb. Tuttavia, la tecnica lascia il profunda e vasi femorali profondi intatta e senza ischemia degli arti posteriori è stata osservata dopo il trasferimento lembo. Inoltre, in animali più grandi e negli esseri umani, l'uso divasi periferici saranno informati quanto sono ridondanti nel corpo; (2) il tempo necessario per ottenere una adeguata vascolarizzazione prima lembo trasferimento, può essere un fattore limitante nei casi urgenti; e (3) creazione lembo viene eseguita in vivo, che può limitare la sua rilevanza nell'uomo. In futuro, ci proponiamo di sviluppare un mezzo per creare questo lembo ex vivo. Il vantaggio del metodo presentato risiede nella capacità di migliorare la formazione di un tessuto autologo (con cellule autologhe) intorno al ponteggio. Il tessuto risultante presenta una valida alternativa ad un lembo di tessuto autologo. Inoltre, l'impalcatura può essere seminato con cellule autologhe prima dell'impianto, per migliorare ulteriormente la vascolarizzazione dell'innesto e integrazione nel tessuto ospite. L'utilizzo di cellule autologhe e una impalcatura biodegradabile e biocompatibile, in grado di aggirare il sostanziale rischio di reazioni immuno-rigetto e presentare un'alternativa a lembi autologhe, evitando la raccolta e scarifi postoperatoriocatione.

Il metodo descritto può tradotto in esperimenti animali di grandi dimensioni e in seguito esteso a studi clinici sull'uomo. Inoltre può essere tradotto per riparare vari tessuti danneggiati all'interno del corpo. Negli esseri umani e in grandi animali, le alette possono essere generati in giro vasi periferici anziché sui vasi femorali AV.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

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References

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Progettato Vascolarizzato muscolare Flap
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Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

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