Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

엔지니어링 혈관을 근육 플랩

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

복부 벽의 결함은 종종 심한 외상, 암 치료, 화상 감염된 메시의 제거 다음 발생한다. 이러한 결함은 종종 복잡한 수술을 필요로하는 플라스틱 재건 외과 1-4의 주요 과제를 제시, 상당한 조직의 손실을 포함한다. 인공 조직을위한 새로운 소스를 추구하는 조직 공학 연구자들은 다른 재료, 셀 소스와 성장 인자를 살펴 보았다. 이러한 설계 조직의 이식에 의한 기관의 5, 6, 방광 7, 8 각막, 뼈 (9)과 피부 (10), 등의 다양한 조직의 성공적인 복원은 이전에보고되었다. 그러나, 두꺼운 혈관 설계 조직의 제조는 특히 큰 결함의 재건, 조직 공학에서 중요한 과제로 남아.

살아있는 조직 구조체의 두께를 제한하는 주요 요인들 중 하나는 그것의 단점에 대한 산소의 공급 제어이다tituent 세포. 확산에 의존하는 경우, 두께가 매우 얇은 층의 구성으로 제한된다. 산소 및 생체 내에서 영양 공급 모세관 사이의 최대 거리는 11,12 산소의 확산 제한과 상관되는 약 200㎛ 인 것이다. 불충분 한 혈관이 조직 허혈 발생할 흡수 및 조직 괴사 (13)에 확대 할 수있다.

또한, 조직 재건을 위해 사용 이상적인 물질은 생체 적합성 및 비 면역 원성이어야한다. 또한 생체 재료와 숙주 세포를 추가로 통합을 촉진하는, 및 구조적 무결성을 유지할 수 있어야한다. 다양한 생물 14-16 합성 1,17,18 행렬은 이전 그러나 그들의 사용이 효과적인 혈액 공급, 감염 또는 불충분 한 조직의 힘의 부족으로 인해 제한 유지, 조직 재건을 위해 탐구하고있다.

본 연구에서는 생체 적합성, 세포 EMB식품 의약품 안전청 (FDA) -approved 폴리 L- 락트산 (PLLA) / 락트산 - 코 - 글리콜 산 (PLGA), 폴리, 구성된 edded 지지체가 누드 마우스의 대퇴 동맥과 정맥 (AV) 혈관 주위에 주입하고, 단지 AV 혈관에서 혈관 형성을 보장 주변 조직으로부터 분리된다. 일주일 후 주입, 이식이 가능한 두꺼운 잘 혈관했다. AV 혈관이 굵은 혈관 조직은, 다음 같은 마우스에서 복부 전층 결손에 유경 플랩으로 옮겨졌다. 일주일 후 전송, 플랩, 가능한 혈관이 잘 복부 내장을 지원하기 위해 충분한 강도를 베어링, 주변 조직과 통합했다. 따라서,자가 척추 경 베어링 설계 두께, 혈관 조직 플랩, 전체 두께 복부 벽의 결함을 수리하기위한 새로운 방법을 제시한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

모든 동물 실험은 테크 니온의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다. 이 절차는 무 흉선 누드 마우스는 면역 거부 반응을 방지하기 위해 사용되었다. 마우스의 다른 유형을 사용하는 경우, 마우스는 수술과 사이클로스포린의 투여 (또는 다른 항 거부 대체) 이전에 권장 면도해야한다.

1. 비계 준비 및 셀 임베딩

  1. 다음과 같은 방법으로 폴리 -L- 락트산 (PLLA) 및 폴리 락트산 - 코 - 글리콜 산 (PLGA)의 혼합물을 1 : 1로 이루어진 지지체를 제조 :
    1. PLLA 500 mg을 10 ml의 클로로포름 PLGA 500 mg의 해산.
    2. 테플론 금형에 모여 염화나트륨 입자 0.4 g을 중합체 용액 0.24 ml를 추가하기. 212-600 ㎛의 소금 직경을 사용합니다. 클로로포름는 O / N을 증발하도록 허용합니다.
    3. 상호 접속 된 다공성 3 차원 지지체로 이어지는 증류수 염 침출.
    4. 폴리머 조각을 잘라가위 사용하여, 30 분 동안 70 % 에탄올 (v / v)의에 담가 사용하기 전에 2 분 동안 PBS로 3 회 반복한다.
  2. (1 내피 세포 배지 (EGM-2는 10 % 소 태아 혈청의 총알 키트 및 근육 세포 배지 (둘 베코 최소 필수 배지 (DMEM)의 성분이 보충 된 FBS : 1에서 다음 셀 트라이 배양을 준비 ), 2.5 % HEPES 완충액, 100 U / ml의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 (PEN-연쇄상 용액).
    1. 0.5 × 10 6 C2C12 근육 아세포, 0.9 × 10 (6) 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC에), 0.2 × 10 6 정상 인간 피부 섬유 아세포 (NHDF)를 사용합니다.
  3. 4 분 동안 200 XG에서 마이크로 원심 분리기 튜브와 함께 세포를 혼합 배지를 흡인하고 세포 매체 μL 4 μL의 차가운 얼음 외 기질 용액의 혼합물 및도 4에 펠릿을 다시 일시.
  4. X 7mm X 1mm (세로 × 가로 × 두께) PLLA / PLG 10mm 조각 잘라지지체 및 4 mL의 세포 배지를 추가하기 전에 (30 분, 37 ° C, 5 % CO 2)를 6 웰 플레이트에 세포 현탁액을 시드 외 기질 용액을 고형화 할 수있다.
  5. 이식 전에 십일의 발판을 품어 및 매체마다 다른 하루를 교체합니다.

2. 수술 절차를 시작하기 전에

  1. (오토 클레이브) 다음과 같은 수술 도구를 준비하고 소독 : 작은, 좋은, 바로 가위, 스프링 가위, 직선, 뾰족한 집게, 톱니 모양의 집게와 바늘 홀더.
  2. 425 μL의 케타민과 1 ML의 주사기에 75 μL 자일 라진을 혼합하여 microcentrifuge 관에서 자일 라진 솔루션 : 케타민의 혼합물을 준비합니다.
  3. 멸균 식염수 (1:20)을 수행 0.3 ㎎ / ㎖의 프레 노르 핀을 희석.

3. 플랩 건설 (이식 주입)

  1. 인슐린 주사기를 사용하여, 케타민의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 : 자일 라진 (35 μL 당체중 20 g)을 얻었다.
  2. 피하는 부 프레 노르 핀 opperation 전 (0.05-0.1 ㎎ / ㎏의 최종 농도)를 주입.
  3. 정상 체온을 보장하기 위해, 37 ° C로 가열 스테이지 상에 마우스를 배치하고 접착 붕대를 사용하여 마우스를 고정.
  4. 코튼 팁을 사용하여 마우스의 눈 (탈수를 방지하기 위해)에 눈 연고를 윤활 관리 할 수​​ 있습니다.
  5. 무균 작업 필드를 설정, 면화 팁, 요오드와 깨끗한 절개 사이트 다음 70 % 에탄올을 사용.
  6. 작은 가위 집게를 사용하고, 대퇴 동맥과 정맥이 (AV) 혈관이 노출 될 때까지, 대퇴부 혈관으로 평행, 사타구니 인대 무릎의 수준에서, 피부를 통해 절개를.
  7. 조직에 더 접근하기 위해, 견인기를 사용하여 피부를 누르십시오.
  8. 봄 가위와 집게를 사용하여 조심스럽게 주위 조직에서 대퇴 동맥과 정맥 혈관을 격리 할 것. 사타구니 LIG의 수준에서 시작우수한 상복부 혈관의 분기점에 ament. 다리에 혈류를 유지하고 후속 허혈을 예방하기 위해, 본래 profunda 남기기.
  9. profunda 아래 및 경골과 proneal AV로 분기 위에 노출 된 대퇴 AV 주위 (제 1) 이식을 접어, 그리고 8-0 실크 봉합사를 사용하여 끝을 가입 할 수 있습니다.
  10. 만 대퇴 AV 혈관에서 돋 모세 혈관으로 이식 혈관을 보장하기 위해, 6-0 봉합과 이식 주위 멸균 라텍스의 조각 및 봉합 포장.
  11. 4-0 실크 봉합사를 사용하여 상부의 피부를 닫습니다.
  12. 이식이 플랩으로 전송 될 때까지, 마취 후 매일 회복 될 때까지 밀접하게 마우스를 모니터합니다. 피하는 부 프레 노르 핀 2-3 일 동안은 하루에 두 번 (0.05-0.1 ㎎ / ㎏의 최종 농도)를 주입.
    참고 : 노출 된 조직의 탈수를 방지하기 위해, 어떤 단계에 식염수를 사용합니다.

4. 플랩 전송

  1. 하나 또는2 주 postimplantation은 케타민의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 : 자일 라진 (35 μL / 20 g)을, 인슐린 주사기를 사용.
  2. 피하는 부 프레 노르 핀 opperation 전 (0.05-0.1 ㎎ / ㎏의 최종 농도)를 주입.
  3. 정상 체온을 보장하기 위해, 37 ° C로 가열 스테이지 상에 마우스를 배치하고 접착 붕대를 사용하여 마우스를 고정.
  4. 코튼 팁을 사용하여 마우스의 눈 (탈수를 방지하기 위해)에 눈 연고를 윤활 적용됩니다.
  5. 면 정보를 사용하여, 무균 작업 필드를 설정하기 위해, 요오드 후 70 % 에탄올 (복부 무릎 영역)에서 절개 부위를 청소.
  6. 조심스럽게 가위를 사용하여 피부의 봉합을 열고, 가위와 집게를 사용하여 복부 피부를 통해 계속 사타구니 인대에 피부 병렬을 통해 절개를합니다.
  7. 조심스럽게 집게로 라텍스 조각을 제거하고 혈관 플랩을 노출.
  8. sciss 사용ORS와 집게는, 주변 조직에서 조직의 플랩을 해부하다.
  9. 집게와 바늘 홀더를 이용하여, AV 출혈을 방지하기 위해 8-0 실크 봉합사와 대퇴 AV의 선단부를 결찰. 그 후, 원심 절첩 이식 조직 및 8-0 봉합사로, 무릎의 수준 AV 소작.
  10. 부드럽게 전층 결함이 이루어져야하는 거리를 결정하는, 동맥 손상을 피 복부 복벽 향해, ​​그래프트 의해 포위 대퇴 AV 옮긴다.
    주의 : 너무 멀리 동맥을 당기는 것은 동맥을 손상시킬 수 있습니다.
  11. 미세 가위를 사용하여 복부 복부 벽에 절개를합니다.
  12. 스프링 가위를 사용하여, 직근 abdominus 근육의 절개를합니다. 상부의 피부 직근 abdominus 근육의 약 1cm X 0.8 CM 구간을 제거합니다.
  13. 복부 abdom에 전체 두께 결함, 축 플랩으로, 혈관 이식에 의해 포위 대퇴 AV를 전송원고 판 벽.
  14. 탈장을 방지하기 위해, 8-0 실크 봉합사를 이용하여 주변의 근육 조직에 플랩을 봉합.
  15. 복부 근육에 플랩을 봉합 할 때 내부 장기를 봉합 방지하기 위해 집게로 근육을 올립니다. 전체 복벽 결손의 효과를 모방하기 위해 노출 된 복부 피부를 둡니다.
  16. 요오드화 거즈와 노출 영역의 오염을 방지하기 위해 살균 붕대 피부에 상처를 커버.
  17. 4-0 실크 봉합사를 이용하여 다리의 피부를 봉합.
  18. 플랩의 검색까지, 마취 후 매일 회복 될 때까지 밀접하게 마우스를 모니터합니다. 피하는 부 프레 노르 핀 2-3 일 동안은 하루에 두 번 (0.05-0.1 ㎎ / ㎏의 최종 농도)를 주입.
  19. 참고 : 노출 된 조직의 탈수를 방지하기 위해 어떤 단계에 식염수를 사용합니다.

이식의 혈관 관류 5. 초음파 결정

참고 : 전송 전에, 혈관 관류 오F 이식은 초음파로, 이식 후 1 2 주에 측정된다.

  1. 2 % 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취.
  2. 정상 체온을 보장하기 위해, 38 ° C로 가열 한 가동 스테이지 상에 마우스를 배치하고 접착 붕대를 사용하여 마우스를 고정.
  3. B 모드에 설정 비선형 트랜스 듀서와 대퇴 동맥과 정맥 혈관을 찾을 수 있습니다.
  4. 컬러 도플러 모드에 설정 트랜스 듀서를 사용하여 이식의 대퇴 혈관의 개통을 검사합니다.
  5. 제조업체의 지침에 따라 비 대상으로 조영제를 준비합니다.
  6. 식염수로 채워진 1 ML의 주사기에 꼬리 정맥 카테터 (27 G 바늘 12cm 튜브)를 연결합니다. 가열 단계에서 마우스 옆에 주사기를 고정 (주사기의 이동을 방지하기 위해).
  7. 마우스의 꼬리 정맥에 카테터를 연결하고 바늘을 고정합니다.
  8. 두 주사는 정맥에 채우기 위해 만들어지고 있는지 확인하기 위해 식염수의 일부를 주입식염수 튜브 (공기 방울을 방지하기 위해).
  9. 조영제 70 μL와 1ml의 주사기를 채우고 조영제 주사기와 식염수 주사기를 교체한다.
  10. 조영제의 이미지 주입 초음파를 설정합니다. 비선형 모드의 특성에 1,500 프레임의 수 및 프레임의 30 % 파괴 펄스를 설정.
    주 : 파괴 펄스 후, 미세 기포는 모세관 내의 마이크로 버블의 유량에 따라 상기 미세 기포의 주입 속도와 독립적 인 속도로 용기를 다시 채운다. 프레임들의 수는 19, 20, 충전 시간에 따라 변경 될 수있다.
  11. 천천히 꼬리 정맥에 조영제를 주입.
  12. 고해상도 초음파 시스템의 비선형 콘트라스트 모드에서 이미지를 캡처.
  13. 앞서 설명한 바와 같이 19, 20, 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석한다.
    1. 얻어진 화상 IM에 ROI (region of interest)를 그리는mediately 대비 모드에서 중단 펄스 후. ROI은 조영제에 의해 채워진 영역을 개설한다.
    2. 파쇄 후의 펄스 대 미세 기포 주입 후 비선형 신호의 평균 강도의 비이며, 관류 량의 측정은 피크 향상 (PE)을 계산한다.
    3. 피크 신호​​ (P)까지의 경과 시간 (T)에서 결정되는 유량을 계산.

이식 혈관 신생의 정도 6. 결정

주 : 조직 이식편 혈관 화의 정도는 하나 또는 이주 주입 후에 결정된다.

  1. 인슐린 주사기를 사용하여, 케타민의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 : 자일 라진 (35 μL / 20 g)을.
  2. 1 mL를 주사기를 사용하여 꼬리 정맥으로 정맥 10 ㎎ / ㎖ 형광 염료 공역 덱스 트란 (FITC-덱스 트란, MW = 500,000) 200 μL를 주입. </ 리>
  3. 십 초 분사 종료 후, 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사.
  4. 마우스의 다리를 열고 이식을 노출.
  5. 인산염 완충 식염수 (PBS)으로 이식 영역을 세척하고 10 % 중성 포르말린을 적용합니다.
  6. 이미지 공 초점 현미경을 사용하여 마우스 다리에 이식.
  7. 기능적인 혈관 밀도 (FVD)를 정량화.
    1. 공 초점 현미경 이미지의 녹색 채널 (여기 = 488 nm의)를 분리합니다.
    2. 고 대비 구조를 강조하기 위해, 하이 패스 필터를 통해 얻어진 화상을 전달한다.
    3. 하이 패스 필터에 의해 증폭되었을 수있는 잡음을 제거하는 얼룩 제거 필터를 사용한다.
    4. 결과적인 이미지에 임계 값을 설정; 원 화상의 특징과 구조는 이진 영상에 표시되도록 상기 임계 값을 조정한다.
    5. 크기 임계 값을 적용되도록 정의 SIZ보다 큰 연결된 픽셀의 그룹E 임계치는 이진 이미지에 남아있다.
    6. 장-Suen의 알고리즘 (21)를 사용하여 이식의 혈관의 골격을 설명합니다.
    7. 각 용기의 중심선의 길이를 합산하고 ROI의 면적으로 나눈 결과 FVD을 계산한다.

이식 7. 면역 조직 및 조직 학적 염색법

  1. 면역 조직 염색
    1. 공 초점 이미징 후, 작은 가위와 집게를 사용하여 이식을 검색 할 수 있습니다. 이식의 양단에 AV 혈관을 해부 및 이식을 검색 할 수 있습니다.
    2. 30 분 동안 10 % 중성 포르말린에 이식을 수정 - 2 시간을.
    3. 파라핀 삽입 될 때까지 70 % 에탄올에서 조직학 카세트에 이식하고 저장을 놓습니다.
    4. 파라핀 표준 고정을 사용하여 프로토콜 (22)을 포함에 포함하고 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 조각으로 파라핀 조직을 조각입니다. AV에 수직으로 전체 조직을 슬라이스선박.
    5. 10 분 각각 두 번 100 % 크실렌 침지하여 파라핀 섹션을 Deparaffinize.
    6. 250 ml의 플라스틱 코 플린 항아리에 슬라이드를 정렬합니다.
    7. 3 분마다 에탄올 농도 (100 %, 96 %, 90 %, 80 %, 70 %, 50 %, 30 % 및 증류수 (DDW))의 감소에 의해 직렬 침지 재수.
    8. DDW 250ml를 항원에 마스크 용액 2.35 mL로 희석하여 항원에 마스크 용액을 제조 하였다. 95 ° C로 설정 극초단파에서 2 분 동안 항원에 마스크 용액을 가열한다.
    9. 95 ° C로 설정 전자 레인지에 3 분 동안 다시 예열 항원에 마스크 솔루션과 열로 슬라이드를 삽입합니다. 50 ° C에서 슬라이드를 냉각.
    10. 2 분 동안 다시 가열하고 실온까지 냉각한다.
    11. 내인성 퍼 옥시 다제의 활성을 종결 한 다음 PBS로 두 번 씻어 RT에서 10 분 동안 3.3 %의 메탄올에 H 2 O 2 용액을 슬라이드를 배양한다.
    12. 배양 챔버를 준비 : 장소 젖은 abso조직학 상자 안에 rbent 시트와 섬세한 작업 와이퍼를 사용하여 슬라이드를 건조.
    13. 원 슬라이스 당 (PBS에서 제조 2 %) 용액을 차단 염소 혈청의 약 50 μL와 소수성 펜을 사용하고 RT에서 30 분 동안 배양 슬라이드 슬라이스 영역.
    14. 솔루션을 차단에 토끼 항 CD31 항체 1:50 희석, 조각 당 약 50 μL 항체를 적용하고 4 ℃에서 O / N을 품어. PBS로 3 회, 5 분 각 씻어.
    15. 슬라이드 위에 장소, PBS에서 슬라이스 당 항체 약 50 μL를 400 및 RT에서 30 분 동안 배양 : 오티 닐화 염소 항 - 토끼 이차 항체에 1 희석.
    16. PBS로 3 회, 5 분 각 씻어.
    17. PBS 400, 실온에서 30 분 동안 슬라이드와 조각 당 약 50 μl를 적용하고 품어 : 스트렙 타비 딘 - 퍼 옥시 다제 (1) 희석. PBS로 3 회, 5 분 각 씻어.
    18. 제조업체 & #에 따라, 조각 당 약 aminoethylcarbazole의 50 μL (AEC) 기판을 적용8217;의 지시. 반응을 정지 DDW에 슬라이드를 딥.
    19. 2 분 마이어의 헤 마톡 실린 용액의 약 50 μL에 섹션을 담금으로써 파란색 핵을 얼룩. 부드럽게 물에 헹군 다음 매체를 장착와 부분을 커버한다.
    20. 이중 맹검 방식을 사용하여 CD31 양성 염색을 정량화. CD31 염색 갈색 얼룩으로 나타납니다. 쌍안 현미경으로 40 배 확대보기 필드에 4-5 다른 필드를 선택합니다. CD31 양성 루멘의 개수를 카운트.
      1. 필드의 수 및 (쌍안 데이터에 따라)으로 계산 fieldarea 루멘의 총 수를 나눔으로써 발판 당 CD31 양성 루멘의 평균 수를 계산한다.
        주 :인가 시약 볼륨 전체 설명한 슬라이스를 커버하기에 충분해야한다.
  2. 조직 학적 염색
    1. 10 % 중성 포르말린에 이식을 수정합니다.
    2. 파라핀 사용하여 표준에 포함 된 이식고정 및 내장 프로 시저.
    3. 10 분 동안 두 번 100 % 크실렌 침지하여 파라핀 섹션에서 파라핀을 제거합니다.
    4. 100 % 이소프로판올에 재수 두 배 빠른 세척.
    5. 두 배 빠른 세척 95 % 에탄올.
    6. 수돗물에 세 번 씻으십시오.
    7. 10 분 동안 헤 마톡 실린에 빠져.
    8. 수돗물에 세 번 씻으십시오.
    9. 2 분 동안 에오신에 Immere.
    10. 빠른 세척을 두 번 95 % 에탄올로 탈수.
    11. 두 배 빠른 세척 100 % 이소프로판올.
    12. 두 배 빠른 세척 100 % 크실렌.
    13. 1.5 mm 두께의 커버 유리와 DPX 접착제로 커버.
    14. 40X 배율의 현미경을 사용하여 이미지.

8. 기계적 특성 평가

  1. 작은 가위와 집게를 사용하여 이식을 검색합니다.
  2. PBS에서 이식을 씻어.
  3. 그래프트의 폭 및 두께를 측정하고 두께를 곱한 폭과 단면적을 계산한다.
  4. 우리수화 이식편의 응력 - 변형 곡선을 생성하는 테스트 장비를 전자.
    1. 시스템 인장 그립 사이의 이식을 마운트하고 두 그립 (즉, 초기 길이) 사이의 최종 길이를 측정한다.
    2. 실패 할 때까지, 0.01 mm / sec의 변형 속도를 적용.
    3. 제조자의 프로토콜을 이용하여 개발 된 힘과 변위를 기록한다.
    4. 매트랩 응력 - 변형 곡선을 생성합니다.
      1. 초기 길이로 나눈 변위에 따라 변형을 계산합니다. 응력 단면적으로 나눈 측정 된 힘으로서 계산된다.
      2. 응력 - 변형 곡선의 선형 영역의 기울기와 곡선의 최대 점으로서 강성을 결정하는 최대 인장 강도이다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

생체 내 이식 혈관과 관류

이식 전에 축 플랩 그들의 이전에 하나 또는 2 주에 이식 하였다. 한 2 주 후 이식에서 이식 영역의 총 관찰 가능한 및 혈관 조직을 이식 한 것으로 밝혀졌습니다. CD31 양성 면역 염색 (도 1A)에 의해 결정되고, 고도로 관류로서 FITC 덱스 트란 꼬리 정맥 주사와 초음파 측정에 의해 입증되는 바와 같이 이들 이식편은 매우 혈관 것을 알았다. 많은 용기가 이미 주 사후 주입, AV 용기의 근방에 추가 주 후에 크게 상승 수가 관찰되었다. 기능 혈관 밀도 (FVD) (그림 1B)의 FITC-덱스 트란 기반의 결정은 이식이 높은 한 주 postimplantation에서 더 큰 변화는 생체 내에서 추가 주에서 일어났다 없다고 혈관 것으로 나타났다. 선박 개통 및 관류가 입증되었다그림 1C는 이식 주입 후 호스트 대퇴 혈관 개통 및 무결성을 확인 초음파 영상으로 (각각 1, 한 2 주 후 이식, - 1 ± 2.71 mm - - 1 ± 0.51 mm - 1, 10.28 mm FVD는 5.71 mm였다). . 또한, 초음파 검사는 일주일 후 주입 (그림 1D)에 비해 이주 이식 후 약간 높았다 이식 영역에서 관류를 한 것으로 밝혀졌습니다.

플랩 특성

플랩 일주 후 전송의 총 검사, 실행 가능한 혈관과 잘 통합 된 조직을 밝혔다. 플랩은 주변에 회사 부착을 시행 하였다. 무 세포, nonvascularized 이식편을 제어하도록 사전 혈관 세포 매립 플랩을 비교할 때 증가 된 강성과 강도 (의해 나타난 바와 같이, 전자는, 우수한 기계적 특성을 나타내었다

그림 1
그룹을 대조군에 비해 postimplantation도 1 그래프트 혈관. (A) CD31 양성 혈관의 밀도는, 하나의 2 주에 측정 하였다. 모든 값은 이식 영역 (2 mm)로 정규화된다. T * = 테스트 p <0.05. (B) 하나, 둘, 주 postimplantation에서 기능 혈관 밀도 (FVD). 큰 차이는 p = 0.08 (t 검정)이 관찰되지 않았다. (C) 등의 특허 AV 용기 컬러 도플러 모드 초음파를 사용하여 묘화. 파란색과 빨간색 represen그래프트에 혈류를 t. 노란색 사분면은 이식 영역을 설명합니다. 하나, 둘, 주 postimplantation에서 (D) 이식 관류. (E와 F) 호스트 조직 통합 플랩의 H & E 염색 : 검은 색 화살표 지점 가능한 동맥; 흰색 화살표는 복부 근육 섬유를 가리; 노란색 화살표가 발판의 유해를 가리 킵니다. (H 및 G) 공 초점 현미경 이미지로 나타낸 바와 같이 FITC 덱스 트란 분포. 모든 결정은, 표본 크기가 N ≥ 3이고 모든 값은 평균의 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 플랩 일주의 기계적 성질전송 이후. (A) 및 강성 (B) 플랩 최대 인장 강도 (UTS). 제어 세포없이 빈 이식 스탠드, 세포는 트라이 문화 이식을 의미합니다. * = T - 테스트 P <0.05, N = 3 값은 평균의 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

조직 공학의 발전은 다양한 조직 유형의 재건을위한 대체 조직에 대한 수요 증가와 함께 충족. 1,17,18 14-16 합성 및 생물학적 물질뿐만 아니라, 제조하는 다양한 방법은 이러한 요구를 해결하기 위해 그들의 능력에 대해 평가되어왔다. 그러나, 임상 치료 및 조직 공학의 발전에도 불구하고, 전체 두께 복벽 결손의 복원이 과제로 남아. 이러한 대규모 결함의 재건을위한 적절한 조직은 두껍고 (2) 혈관 (1), 그리고 시간이 23 이상 (3) 기계적 무결성, 그리고 (4) 생존 능력을 보여 주어야합니다.

여기서, 우리는자가 조직의 플랩에 대한 대안이 될 수있는, 가능한 두께 및 혈관 조직 절편을 만들기위한 단계별 상세한 프로토콜을 제시한다. 제작 된 플랩은 두 단계로 구성되었다 : (1) PLLA / PLGA 지지체는 양해 각서 (MOU)의 AV 혈관 주위에 이식되었다셀레늄 뒷다리 만 AV 용기 의해 혈관 있도록 주변 조직으로부터 분리된다. (2) 혈관 생성, 두꺼운 티슈 플랩이어서 전층 복벽 결함에 해당 척추 경 역임 AV 용기로 옮겼다.

적절한 플랩 혈관은 호스트 17,18,24 내에서의 성공적인 통합을 위해 필수적이다. 두꺼운 조직에서 산소 공급과 확산을 개선하기 위해 설계된 혈관 조직을 생성하기 위해 다양한 접근 방법들이 문헌에서 논의되었다. 이들 중에서도 각종 골격 유형 13,20,25-30, 이식 장소에 혈관 신생 인자를 제공하기위한 다양한 기법에 내피 세포 (EC에)의 시드를 포함하는 방법이 있었다 (어느 주입하여 직접 투여에 의해, 형질 전환 된 세포의 사용은 요소 (31)를 발현 설계 조직 관류 (37)을 보장하기 위해 다른 비계 35, 36), 생물 반응기의 사용에서 -34 또는 느린 방출 (38, 39)의 고용. 여기서, 조직 이식은자가 조직 혈관의 악용함으로써, 생체 내에서 혈관 하였다. 혈관 실용적 입증 관류 그래프트는, 다음으로 전체 두께 복벽 결함을 수리하기 위해 두꺼운 티슈 플랩로 옮겼다. 일주일 후 전송, 플랩 가능한이었고, 복부 내장을 지원하기에 충분한 기계적 강도를 특징. 여기, 우리는 장애인의 면역 체계를 부담 무 흉선 누드 마우스를 사용; 마우스 또는 다른 동물의 임의의 다른 유형을 사용할 때 (세포 골격 시드 특히), 면역 반응의 가능성을 고려해야한다. 이 기술의 다른 제한은 뒷다리에 혈류를 공급 대퇴 AV 용기, (1) 전송을 포함한다. 그러나, 기술은 그대로 profunda과 깊은 대퇴 혈관 잎없고 뒷다리 허혈 플랩 전송 후에 관찰되지 않았다. 또한, 더 큰 동물과 인간의 사용그들은 몸에 중복으로 말초 혈관 조언한다; (2) 적절한 혈관 전송할 플랩에 앞서, 긴급한 경우에 제한 요소가 될 수있는 달성하는데 필요한 시간; 및 (3) 플랩 생성은 인간의 관련성을 제한 할 수있는, 생체 내에서 수행된다. 향후에는 플랩이 생체를 생성하는 수단을 개발 목표로하고있다. 제시된 방법의 장점은 지지체 주위 (자가 세포)자가 조직의 형성을 강화하는 능력에있다. 그 결과 조직은자가 조직 플랩에 적절한 대안을 제시한다. 또한, 상기 지지체는 상기 호스트 조직 내 혈관 이식편 및 통합을 개선하기 위해, 이식하기 전에자가 세포를 시딩 할 수있다. 자가 세포와 생분해 성 및 생체 적합성 지지체를 사용, 면역 거부 반응의 상당한 위험을 회피하고 수확 및 수술 후 scarifi을 피하면서자가 플랩에 대한 대안을 제시 할 수양이온.

한 방법은 큰 동물 실험에 번역 더 인간 임상 시험으로 확대 할 수 있습니다. 또한 그것은 신체 내의 다양한 손상된 조직을 복구하는 번역 될 수있다. 인간 및 동물에서 큰, 플랩 말초 혈관 주위 대신 AV 대퇴부 혈관을 생성 할 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12 (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32 (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69 (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18 (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28 (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193 (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27 (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. , Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7 (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).

Tags

생명 공학 이슈 (107) 플랩 조직 공학 골격 혈관 마우스 모델 혈관 조직 근육
엔지니어링 혈관을 근육 플랩
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman,… More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter