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Bioengineering

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

doi: 10.3791/52984 Published: January 11, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

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Defectos de la pared abdominal a menudo surgen después de un trauma severo, el tratamiento del cáncer, quemaduras y la eliminación de la malla infectada. Estos defectos implican a menudo la pérdida de tejido significativa, requiriendo procedimientos quirúrgicos complicados y presentar un gran reto para los cirujanos de reconstrucción de plástico 1-4. Investigadores de ingeniería de tejidos que buscan nuevas fuentes de tejidos artificiales han explorado diferentes materiales, fuentes de células y factores de crecimiento. Se informó anteriormente restauraciones exitosas de diversos tejidos, tales como 5,6 tráquea, vejiga 7, 8 córnea, hueso 9 y la piel 10, mediante la implantación de tejidos de ingeniería. Sin embargo, la fabricación de un tejido vascularizado ingeniería de espesor, en particular para la reconstrucción de defectos grandes, sigue siendo un desafío significativo en la ingeniería de tejidos.

Uno de los principales factores que limitan el espesor de una construcción de tejido viable es el control de suministro de oxígeno a sus contrascélulas tituent. Cuando se depende de la difusión, la construcción de espesor se limita a la de una capa muy delgada. La distancia máxima entre oxígeno y nutrientes capilares de suministro in vivo es de aproximadamente 200 micras, que se correlaciona con el límite de difusión de oxígeno 11,12. Vascularización insuficiente puede resultar en isquemia tisular y escalar a la resorción de tejido o necrosis 13.

Además, el material ideal utilizado para la reconstrucción de tejidos debe ser biocompatible y no inmunogénico. También debe ser capaz de promover una mayor integración de las células huésped con el biomaterial, y el mantenimiento de la integridad estructural. Varios biológicos 14-16 y sintéticos 1,17,18 matrices se han explorado previamente para la reconstrucción de tejidos, sin embargo su uso quedará limitado debido a la falta de suministro de sangre eficaz, las infecciones o la fuerza del tejido insuficiente.

En este estudio, un biocompatible, célula-embandamio edded compuesto de Food and Drug Administration (FDA) de ácido L-láctico con aprobación para poli (PLLA) / poli ácido láctico-co-glicólico (PLGA), se implantó alrededor de los vasos de la arteria femoral y la vena (AV) de un ratón desnudo y separado del tejido circundante, lo que garantiza la vascularización de sólo los vasos AV. Una semana después de la implantación, el injerto era viable, grueso y bien vascularizado. Este tejido vascularizado grueso con los vasos de AV, fue trasladado como un colgajo pediculado a un defecto de espesor total abdominal en el mismo ratón. Una semana después de la transferencia, la aleta era viable, vascularizado y bien integrado con el tejido circundante, teniendo resistencia suficiente para soportar las vísceras abdominales. Por lo tanto, el espesor, colgajo de tejido vascularizado ingeniería, teniendo un pedículo autólogo, se presenta un método novedoso para la reparación de defectos de la pared abdominal de espesor completo.

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Protocol

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Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Experimentación Animal del Technion. Para este procedimiento, se usaron ratones desnudos atímicos para evitar el rechazo inmunológico. Si se utiliza otro tipo de ratón, los ratones deben ser afeitaron antes del procedimiento quirúrgico y la administración de ciclosporina (u otro sustituto anti-rechazo) se recomienda.

1. Preparación Andamios y Cell incrustación

  1. Preparar estructuras compuestas de 1: 1 mezcla de poli-L-láctico-ácido (PLLA) y poliláctico-co-glicólico-ácido (PLGA), de la siguiente manera:
    1. Disolver 500 mg de PLLA y 500 mg de PLGA en 10 ml de cloroformo.
    2. Añadir 0,24 ml de solución de polímero de 0,4 g de partículas de cloruro de sodio se reunieron en un molde de teflón. Use un diámetro de 212 a 600 micras sal. Deje que el cloroformo se evapore O / N.
    3. Lixiviar la sal con agua destilada conduce a interconectadas andamios 3D porosas.
    4. Cortar trozos de polímerousando unas tijeras, a continuación, en remojo en 70% de etanol (v / v) durante 30 min y lavar 3 veces en PBS durante 2 min antes de su uso.
  2. Preparar un tri-cultivo de las siguientes células en 1: medio celular 1 endotelial (EGM-2 suplementado con los componentes de su kit bala y medio de células de músculo (medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM), suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS ), 2,5% de tampón HEPES, 100 U / ml de penicilina, y 0,1 mg / ml de estreptomicina (Pen-Strep Solution).
    1. Utilice 0,5 x 10 6 C2C12 mioblastos, 0,9 x 10 6 células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), y 0,2 x 10 6 fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF).
  3. Mezclar las células juntos en un tubo de microcentrífuga y se centrifuga a 200 xg durante 4 min, aspirar el medio y volver a suspender el sedimento en una mezcla de 4 l de hielo solución de matriz extracelular frío y 4 l medio celular.
  4. Cortar un trozo de 10 mm x 7 mm x 1 mm (largo x ancho x grosor) PLLA / PLGUn andamio y sembrar la suspensión de células en una placa de 6 pocillos, permita que la solución de la matriz extracelular se solidifique (30 min, 37 ° C, 5% de CO 2) antes de añadir 4 ml de medio celular.
  5. Incubar los andamios para diez días antes de la implantación y reemplazar el medio cada dos días.

2. Antes de comenzar el procedimiento quirúrgico

  1. Preparar y esterilizar (autoclave) las siguientes herramientas quirúrgicas: una pequeña, muy bien, tijeras rectas, tijeras primavera, unas rectas, pinzas de punta fina, unas pinzas dentadas y un porta-agujas.
  2. Preparar una mezcla de ketamina: xilazina solución en un tubo de microcentrífuga mediante la mezcla de 425 l ketamina y xilazina 75 l en una jeringa de 1 ml.
  3. Diluir 0,3 mg / ml de buprenorfina en solución salina estéril (01:20).

3. Solapa Construcción (injerto de implantación)

  1. Usando una jeringa de insulina, anestesiar el ratón por una inyección intraperitoneal de ketamina: xilazina (35 l por20 g de peso corporal).
  2. Por vía subcutánea inyectar buprenorfina (concentración final de 0,05 hasta 0,1 mg / kg) antes de la opperation.
  3. Coloca el ratón en un escenario calentado a 37 ° C, para asegurar la temperatura normal del cuerpo, y luego asegurar el ratón usando una venda adhesiva.
  4. Utilizando puntas de algodón, administrar lubricante ungüento para los ojos a los ojos del ratón (para evitar la deshidratación).
  5. Utilizando puntas de algodón, limpia el sitio de la incisión con yodo y luego con 70% de etanol, para establecer un campo de trabajo aséptico.
  6. El uso de pequeñas tijeras y pinzas, hacer una incisión a través de la piel, desde el nivel de la rodilla en el ligamento inguinal, paralelo a los vasos femorales, hasta que la arteria y la vena femoral (AV) los barcos están expuestos.
  7. Mantenga la piel hacia abajo usando un retractor, para tener mejor acceso al tejido.
  8. Con unas tijeras y pinzas de resorte, aislar cuidadosamente los vasos arteriales y vena femoral del tejido circundante. Comience desde el nivel de la lig inguinalAment a la bifurcación de los vasos epigástricos superiores. Deje la profunda sin tocar, a fin de preservar el flujo de sangre a la pierna y prevenir la posterior isquemia.
  9. Dobla el injerto (de la Sección 1) alrededor de la AV femoral expuesta, por debajo de la profunda y por encima de la bifurcación a la tibial y AV proneal, y unirse a sus extremos utilizando 8-0 suturas de seda.
  10. Para asegurar la vascularización del implante por los capilares que brotan de sólo los vasos femorales AV, envolver un pedazo de látex esterilizados alrededor del injerto, y la sutura con 6-0 suturas.
  11. Cierre la piel que lo recubre utilizando 4-0 suturas de seda.
  12. Monitorear el ratón estrechamente hasta que la recuperación de la anestesia y cada día a partir de entonces, hasta que el injerto se transfiere como una aleta. Por vía subcutánea inyectar buprenorfina (concentración final de 0,05 hasta 0,1 mg / kg) dos veces al día durante 2-3 días.
    NOTA: Utilice solución salina en cualquier etapa, para evitar la deshidratación del tejido expuesto.

Transferencia 4. Flap

  1. En uno odos semanas después de la implantación, anestesiar el ratón por una inyección intraperitoneal de ketamina: xilazina (35 l / 20 g), usando una jeringa de insulina.
  2. Por vía subcutánea inyectar buprenorfina (concentración final de 0,05 hasta 0,1 mg / kg) antes de la opperation.
  3. Coloca el ratón en un escenario calentado a 37 ° C, para asegurar la temperatura normal del cuerpo, y luego asegurar el ratón usando una venda adhesiva.
  4. Utilizando puntas de algodón, aplique lubricante ungüento para los ojos a los ojos del ratón (para evitar la deshidratación).
  5. Utilizando puntas de algodón, limpiar el lugar de la incisión (desde el área de la rodilla en el abdomen) con yodo y luego con etanol al 70%, para establecer un campo de trabajo aséptico.
  6. Utilizando unas tijeras y pinzas, abra cuidadosamente las suturas en la piel y, utilizando una tijera, hacer una incisión a través de la piel paralelo al ligamento inguinal, continuando a través de la piel ventral.
  7. Retire con cuidado la pieza de látex con unas pinzas y exponer el colgajo vascularizado.
  8. El uso de un scissORS y fórceps, diseccionar el colgajo de tejido del tejido circundante.
  9. Usando unas pinzas y un soporte de aguja, ligar el extremo distal de la AV femoral con 8-0 suturas de seda para prevenir el sangrado de la AV. Entonces, cauterizar la AV a nivel de la rodilla, distalmente al tejido implantado plegada y el 8-0 suturas.
  10. Transferir suavemente el AV femoral envuelto por el injerto, hacia la pared abdominal ventral, evitando daños a la arteria, para determinar la distancia a la que se debe hacer el defecto de espesor.
    PRECAUCIÓN: Al tirar de la arteria demasiado puede dañar la arteria.
  11. Utilizando unas tijeras, hacer una incisión en la pared abdominal ventral.
  12. Utilizando unas tijeras de primavera, hacer una incisión en el músculo recto abdominal. Eliminar una de aproximadamente 1 cm x 0,8 cm segmento del músculo recto abdominal con la piel suprayacente.
  13. Transferir el AV femoral, envuelto por el injerto vascularizado, como un colgajo axial, al defecto de espesor completo en el Abdom ventralpared inal.
  14. Suturar el colgajo en el tejido muscular circundante, usando suturas de seda 8-0, para evitar la hernia.
  15. Para evitar la sutura de los órganos internos, elevar el músculo con un fórceps cuando la sutura del colgajo al músculo abdominal. Deja la piel ventral expuesta para imitar el efecto de un defecto de la pared abdominal completa.
  16. Cubra la herida en la piel con una gasa yodado y un vendaje estéril para evitar la contaminación de la zona expuesta.
  17. Suturar la piel de la pierna usando suturas de seda 4-0.
  18. Monitorear el ratón estrechamente hasta que la recuperación de la anestesia y cada día a partir de entonces, hasta que la recuperación de la solapa. Por vía subcutánea inyectar buprenorfina (concentración final de 0,05 hasta 0,1 mg / kg) dos veces al día durante 2-3 días.
  19. NOTA: Utilice solución salina en cualquier etapa para evitar la deshidratación del tejido expuesto.

5. Determinación de Ultrasonido Vascular perfusión del injerto

NOTA: Antes de la transferencia, la perfusión vascular of el injerto se mide a una y dos semanas después de la implantación, por ultrasonografía.

  1. Anestesiar el ratón usando 2% de isoflurano.
  2. Coloca el ratón sobre un escenario móvil se calienta a 38 ° C, para asegurar la temperatura normal del cuerpo, y luego asegurar el ratón usando una venda adhesiva.
  3. Encuentra los vasos arteriales y venosos femorales con transductor no lineal ajustado en el modo B.
  4. Examinar la permeabilidad de los vasos femorales del injerto utilizando el transductor ajustado en el modo Doppler color.
  5. Preparar agente no específica contraste de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  6. Conectar un catéter de vena de la cola (12 cm tubo con una aguja de 27 G) a una jeringa de 1 ml llena con solución salina. Asegure la jeringa al lado del ratón en la fase de calentamiento (para evitar el movimiento de la jeringa).
  7. Conectar el catéter a la vena de la cola del ratón y asegurar la aguja.
  8. Inyectar algunos de la solución salina para asegurar tanto que las inyecciones se realizan en la vena y para llenarel tubo con solución salina (para evitar burbujas de aire).
  9. Llenar una jeringa de 1 ml con 70 l de agente de contraste y sustituir la jeringa con solución salina con la jeringa agente de contraste.
  10. Configure el ultrasonido para la inyección de la imagen del agente de contraste. En las propiedades del modo no lineal configurar el número de fotogramas a 1500 y el impulso de interrupción de 30% de los marcos.
    NOTA: Después de la interrupción del pulso, las microburbujas vuelva a llenar los vasos a una velocidad que depende de la velocidad de flujo de las microburbujas en los capilares y es independiente de la velocidad de inyección de las microburbujas. El número de fotogramas se puede cambiar de acuerdo con el tiempo de llenado 19,20.
  11. Lentamente inyectar el agente de contraste en la vena de la cola.
  12. Captura de imágenes en el modo de contraste no lineal del sistema de ultrasonidos de alta resolución.
  13. Analizar los resultados utilizando el software, como se describió anteriormente 19,20.
    1. Dibuje una región de interés (ROI) en la imagen obtenida immediatamente después del impulso de interrupción en el modo de contraste. El retorno de la inversión debe esbozar el área de llenado sólo por el agente de contraste.
    2. Calcular la mejora de pico (PE), que es la relación de la intensidad media de la señal no lineal después de la inyección de las microburbujas frente a después del impulso de interrupción, y es una medida del volumen de perfusión.
    3. Calcular la velocidad de flujo, que se determina a partir del tiempo (T) que transcurre hasta que la señal de pico (P).

6. Determinación del Grado de injerto Vascularización

NOTA: El grado de vascularización de injerto de tejido se determina una o dos semanas después de la implantación.

  1. Usando una jeringa de insulina, anestesiar el ratón por una inyección intraperitoneal de ketamina: xilazina (35 l / 20 g).
  2. El uso de 1 ml de la jeringa, por vía intravenosa inyectar 200 l de 10 mg / ml de dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano, MW = 500.000) en la vena de la cola. </ li>
  3. Diez segundos después de la finalización de la inyección, la eutanasia el ratón por dislocación cervical.
  4. Abra la pata del ratón y exponer el injerto.
  5. Lavar el área del injerto con tampón fosfato salino (PBS) y aplicar 10% de formalina tamponada neutra.
  6. Image el injerto en la pata del ratón, utilizando un microscopio confocal.
  7. Cuantificar densidad de los vasos funcional (FVD).
    1. Aislar el canal verde (excitación = 488 nm) de las imágenes microscópicas confocales.
    2. Pasar las imágenes resultantes a través de un filtro de paso alto, con el fin de acentuar las estructuras de alto contraste.
    3. Use un filtro de eliminación de puntos para eliminar el ruido que podría haber sido amplificada por el filtro de paso alto.
    4. Establecer el valor de umbral en la imagen resultante; el valor umbral se ajusta de modo que las características y estructuras en la imagen original son visibles en la imagen binaria.
    5. Aplicar un tamaño umbral para que sólo los grupos de píxeles conectados más grande que el siz definidoe umbral permanecen en la imagen binaria.
    6. Delinear el esqueleto de los buques en el injerto utilizando el algoritmo del Zhang-Suen 21.
    7. Calcular la FVD sumando las longitudes de la línea media de cada buque y dividiendo el resultado por el área de la ROI.

7. inmunohistológica y tinción histológica del injerto

  1. Tinción inmunohistoquímico
    1. Después imagen confocal, recuperar el injerto usando un pequeño tijeras y fórceps. Diseccionar los vasos de AV en los dos extremos del injerto y recuperar el injerto.
    2. Fijar los injertos en 10% de formalina tamponada neutra durante 30 min - 2 h.
    3. Coloca los injertos en cassettes de histología y guardar en etanol al 70% hasta que la inclusión en parafina.
    4. Incrustar en parafina utilizando una fijación estándar y la incrustación de protocolo 22 y cortar los tejidos embebidos en parafina a 5 micras rodajas utilizando un micrótomo. Cortar todo el tejido de forma perpendicular a la AVvasos.
    5. Desparafinar las secciones incluidas en parafina por inmersión en 100% xileno dos veces, durante 10 minutos cada uno.
    6. Colocar los portaobjetos en un 250 ml Coplin de plástico jarra.
    7. Rehidrate por inmersiones de serie en la disminución de las concentraciones de etanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% y agua doblemente destilada (DDW)) durante 3 min cada uno.
    8. Preparar la solución de desenmascaramiento antígeno mediante la dilución de 2,35 ml de solución de desenmascaramiento antígeno con 250 ml de DDW. Calentar la solución desenmascaramiento antígeno para 2 min en un microondas ajustado a 95 ° C.
    9. Inserte las diapositivas en la solución desenmascaramiento antígeno pre-calienta y el calor de nuevo por 3 min en un microondas ajustado a 95 ° C. Enfriar los portaobjetos a 50 ° C.
    10. Calentar de nuevo durante 2 min y después se enfría a RT.
    11. Incubar los portaobjetos en 3,3% H 2 O 2 solución en metanol durante 10 min, a temperatura ambiente para apagar la actividad de la peroxidasa endógena y luego enjuague dos veces en PBS.
    12. Preparar una cámara de incubación: lugar abso húmedahojas rbent dentro de un cuadro de la histología y se secan las diapositivas utilizando limpiadores de tareas delicadas.
    13. Círculo área del sector en el portaobjetos con un bolígrafo hidrófobo y se incuba durante 30 min a TA, con aproximadamente 50 l de suero de cabra de solución de bloqueo (2%, preparado en PBS) por rebanada.
    14. Diluir el conejo anti-CD31 anticuerpo 1:50 en solución de bloqueo, se aplican aproximadamente 50 l de anticuerpo por rebanada y se incuba O / N, a 4 ° C. Enjuagar 3 veces con PBS, 5 min cada uno.
    15. Diluir la biotina de cabra anti-anticuerpo secundario de conejo 1: 400 en PBS, lugar durante aproximadamente 50 diapositivas l de anticuerpo por rebanada y se incuba durante 30 min a TA.
    16. Enjuagar 3 veces con PBS, 5 min cada uno.
    17. Diluir estreptavidina-peroxidasa 1: 400 en PBS, se aplican aproximadamente 50 l por rebanada y se incuba con toboganes durante 30 min, a temperatura ambiente. Enjuagar 3 veces con PBS, 5 min cada uno.
    18. Aplique aproximadamente 50 l de aminoetilcarbazol (AEC) de sustrato por porción, según el fabricante y #8217; s instrucciones. Sumerja los portaobjetos en DDW para detener la reacción.
    19. Teñir los núcleos en azul sumergiendo las secciones en aproximadamente 50 l de solución de hematoxilina de Mayer durante 2 min. Enjuague suavemente con agua y luego cubrir las secciones con medio de montaje.
    20. Cuantificar la tinción de CD31-positivo utilizando un enfoque de doble ciego. Tinción CD31 aparece como una mancha marrón. Elige 4-5 campos diferentes en un campo de visión de aumento de 40X con un microscopio binocular. Cuente el número de lúmenes CD31-positivo.
      1. Calcular el número medio de lúmenes CD31-positivas por andamio dividiendo el número total de lúmenes contadas con el número de campos y la fieldarea (de acuerdo con los datos binocular).
        NOTA: El volumen de reactivo aplicado debe ser suficiente para cubrir toda la rebanada esbozado.
  2. Tinción histológica
    1. Fijar injertos en 10% de formalina tamponada neutra.
    2. Injertos Insertar en norma de parafina utilizandofijación y procedimientos de incrustación.
    3. Eliminar la parafina de las secciones embebidas en parafina por inmersión en 100% de xileno dos veces durante 10 min.
    4. De lavado rápido en dos ocasiones para la rehidratación en el 100% de isopropanol.
    5. De lavado rápido en dos ocasiones 95% de etanol.
    6. Lavar tres veces con agua del grifo.
    7. Sumerja en hematoxilina durante 10 min.
    8. Lavar tres veces con agua del grifo.
    9. Immere en eosina durante 2 min.
    10. Lavado rápido deshidratar en el 95% de etanol dos veces.
    11. Rápido lavado 100% isopropanol dos veces.
    12. Rápido lavado 100% xileno dos veces.
    13. Cubra con pegamento DPX con cubierta de vidrio de 1,5 mm de espesor.
    14. Imagen mediante microscopio en 40 aumentos.

8. Propiedades Mecánicas Evaluación

  1. Recuperar el injerto usando un pequeño tijeras y fórceps.
  2. Enjuague el injerto en PBS.
  3. Medir la anchura y el grosor del injerto y calcular el área de sección transversal como la anchura multiplicada por el espesor.
  4. Nose el instrumento de prueba para generar una curva de tensión-deformación de los injertos hidratadas.
    1. Montar el injerto entre las mordazas de tracción del sistema y medir la longitud final entre las dos empuñaduras (es decir, la longitud inicial).
    2. Aplique una velocidad de deformación de 0,01 mm / s, hasta el fallo.
    3. Registre la fuerza y ​​el desplazamiento desarrollado utilizando el protocolo del fabricante.
    4. Generar una curva de tensión-deformación en Matlab.
      1. Calcular cepa de acuerdo con el desplazamiento dividido por la longitud inicial. El estrés se calcula como la fuerza medida dividida por el área de sección transversal.
      2. Determinar la rigidez como la pendiente de la región lineal de la curva de tensión-deformación y el punto máximo de la curva es la resistencia a la tracción.

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Representative Results

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Vascularización del injerto y la perfusión in vivo

Los injertos fueron implantados uno o dos semanas antes de su transferencia como aletas axiales. A la una y dos semanas después de la implantación, la observación bruto de la zona del injerto reveló injertos de tejidos viables y vascularizados. Estos injertos demostraron ser altamente vascularizado, como se determina por inmunotinción positiva CD31 (Figura 1A), y altamente perfundidos, como se evidencia por las mediciones de inyección en la vena de la cola y de ultrasonido FITC-dextrano. Muchos buques ya se observaron a una semana después de la implantación, un número que aumentó significativamente después de una semana adicional en las proximidades de los vasos AV. Determinación de dextrano-FITC basada en la densidad de los vasos funcional (FVD) (Figura 1B) mostró que el injerto fue altamente vascularizada en una semana después de la implantación, y que no hay cambios significativos tuvieron lugar en la semana adicional en vivo. La permeabilidad del vaso y la perfusión se demostraronpor ecografía (la FVD fue 5,71 mm - 1 ± 0,51 mm - 1 y 10,28 mm - 1 ± 2,71 mm - 1, de una y dos semanas después de la implantación, respectivamente) Figura 1C confirmó anfitrión femoral permeabilidad y la integridad vascular tras la implantación del injerto. . Por otra parte, el examen ecográfico reveló la perfusión dentro de la zona del injerto, que fue ligeramente superior dos semanas después de la implantación, en comparación con una semana después de la implantación (Figura 1D).

Propiedades Flap

El examen macroscópico de las solapas de una semana después de la transferencia reveló un tejido viable, vascularizado y bien integrado. Las solapas se sometieron apego firme a su entorno. Al comparar las solapas pre-vascularizados, teléfonos embebido para controlar acelular, los injertos no vascularizados, el anterior mostró propiedades mecánicas superiores, tal como se manifiesta por el aumento de rigidez y resistencia (

Figura 1
Figura 1. vascularización del injerto. (A) La densidad de los vasos CD31-positivo, medido a una y dos semanas después de la implantación en comparación con el grupo control. Todos los valores están normalizados a la zona del injerto (2 mm). * = T-test, p <0.05. (B) la densidad vascular funcional (FVD) a una y dos semanas después de la implantación. No se observó ninguna diferencia significativa, p = 0,08 (T-test). (C) los buques AV Patentes como fotografiado usando ultrasonido en el modo Doppler color. Azul y rojo represent el flujo sanguíneo en el injerto. El cuadrante amarillo describe la zona del injerto. (D) Injerto de perfusión en una y dos semanas después de la implantación. (E y F) tinción H & E de las aletas integradas en el tejido del huésped: punta de flecha negro arteria viable; flechas blancas señalan las fibras musculares abdominales; flechas amarillas señalan restos de andamios. (H y G) de distribución de dextrano FITC como se muestra por las imágenes de microscopía confocal. Para todas las determinaciones, el tamaño de la muestra fue de n ≥ 3 y todos los valores se representan como media ± error estándar de la media. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
La Figura 2. Las propiedades mecánicas de la aleta de una semanapost-transferencia. (A) La rigidez y (B) la resistencia a la tracción final (UTS) de las aletas. Control representa un injerto vacía sin células, las células se destaca injertos tri-cultura. * = T-test, p <0,05, n = 3. Los valores se representan como media ± error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Los avances en la ingeniería de tejidos se han encontrado con una creciente demanda de tejidos sustitutos para la reconstrucción de los diversos tipos de tejidos. Una variedad de materiales sintéticos y biológicos 1,17,18 14-16, así como métodos de fabricación han sido evaluados por su capacidad para hacer frente a estas demandas. Sin embargo, a pesar de los avances en la atención clínica y en la ingeniería de tejidos, la restauración de defectos de la pared abdominal de espesor completo sigue siendo un desafío. Un tejido adecuado para la reconstrucción de tales defectos masivas debe ser (1) de espesor y (2) vascularizado, y demostrar (3) integridad mecánica, y (4) la viabilidad con el tiempo 23.

A continuación, presentamos un protocolo detallado paso a paso para crear un colgajo de tejido grueso, viable, y vascularizada, que puede servir como una alternativa a los colgajos de tejido autólogo. La solapa fabricada se construyó en dos pasos: (1) Un andamio PLLA / PLGA fue implantado alrededor de los vasos AV del mouSE miembro posterior y separada del tejido circundante para permitir la vascularización por sólo los vasos AV. (2) El, colgajo de tejido vascularizado gruesa creada fue trasladado con los vasos de AV, que sirvió como su pedículo, en un defecto de la pared abdominal de espesor total.

Vascularización adecuada colgajo es esencial para su integración exitosa en el 17,18,24 de acogida. Diversos enfoques para crear de ingeniería tisular vascularizado con el fin de mejorar el suministro de oxígeno y la difusión en los tejidos gruesos, se han discutido en la literatura. Entre éstos estaban métodos que implican la siembra de las células endoteliales (EC) en varios tipos de andamio 13,20,25-30, varias técnicas para el suministro de factores angiogénicos al lugar de implantación (ya sea por administración directa mediante inyección, el uso de células transformadas que expresan los factores 31 -34 liberación lenta o de diferentes andamios 35,36), uso de biorreactores para asegurar la perfusión tisular ingeniería 37 38,39. Aquí, el injerto de tejido vascularizado fue in vivo, por la explotación de los vasos autólogos. A continuación, el injerto, que resultó viable, vascularizado y perfundido, fue transferido como un colgajo de tejido grueso para reparar un defecto de la pared abdominal de espesor total. Una semana después de la transferencia, la aleta era viable y presentó una resistencia mecánica suficiente para soportar las vísceras abdominales. Aquí, hemos utilizado ratones desnudos atímicos, que llevan un sistema inmunitario deteriorado; cuando se utiliza cualquier otro tipo de ratón u otro animal, la posibilidad de reacciones inmunes debe tenerse en cuenta (especialmente cuando la siembra de los andamios con células). Otras limitaciones de esta técnica incluyen (1) la transferencia de los vasos femorales AV, que suministran el flujo sanguíneo a la extremidad posterior. Sin embargo, la técnica deja la profunda y los vasos femorales profundas intacto y sin isquemia de las extremidades posteriores se observó después de la transferencia solapa. Por otra parte, en animales más grandes y en los seres humanos, el uso deSe informará a los vasos periféricos, ya que son redundantes en el cuerpo; (2) el tiempo requerido para alcanzar la vascularización adecuada antes de la solapa de transferencia, puede ser un factor limitante en caso de urgencia; y (3) la creación del colgajo se realiza in vivo, lo que puede limitar su relevancia en los seres humanos. En el futuro, nuestro objetivo es desarrollar un medio de crear este colgajo ex vivo. La ventaja del método presentado reside en la capacidad para mejorar la formación de un tejido autólogo (con células autólogas) alrededor del andamio. El tejido resultante presenta una alternativa adecuada a un colgajo de tejido autólogo. Además, el andamio puede ser sembrado con células autólogas antes de la implantación, para mejorar aún más la vascularización del injerto y la integración en el tejido huésped. El uso de células autólogas y un andamio biodegradable y biocompatible, puede eludir el riesgo sustancial de reacciones inmuno-rechazo y presentar una alternativa a los colgajos autólogos evitando al mismo tiempo la cosecha y scarifi postoperatoriacatión.

El método descrito puede traducida a los experimentos en animales grandes y más ampliado para los ensayos clínicos en seres humanos. Por otra parte puede ser traducido a reparar diversos tejidos dañados en el cuerpo. En los seres humanos y en animales grandes, las aletas pueden ser generados alrededor de los vasos periféricos en lugar de sobre los vasos femorales AV.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

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References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28, (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12, (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32, (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69, (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128, (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372, (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367, (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351, (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18, (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28, (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16, (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193, (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50, (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52, (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14, (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8, (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118, (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111, (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27, (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16, (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3, (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100, (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7, (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15, (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108, (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23, (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21, (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106, (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34, (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34, (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116, (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115, (3), 353-360 (2007).
Diseñado vascularizado colgajo de músculo
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Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

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