Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

doi: 10.3791/52984 Published: January 11, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Karın duvarı defektleri sıklıkla şiddetli travma, kanser tedavisi, yanık ve enfekte mesh çıkarılmasını takiben ortaya çıkar. Bu kusurlar genellikle komplike cerrahi girişimler gerektiren ve plastik rekonstrüksiyon cerrahlar 1-4 için büyük bir meydan okuma sunan, önemli doku kaybı içerir. Yapay dokular için yeni kaynaklar arayan Doku mühendisliği araştırmacılar farklı malzemeler, hücre kaynakları ve büyüme faktörleri incelemiş bulunuyoruz. Bu tür işlenmiş dokular implantasyonu ile trakea 5,6, mesane 7, kornea 8, kemik 9 ve cilt 10, çeşitli dokuların başarılı restorasyonu daha önce rapor edilmiştir. Ancak, kalın damarlı mühendislik dokusunun fabrikasyon özellikle büyük defektlerinin rekonstrüksiyonu için, doku mühendisliğinde önemli bir sorun olmaya devam etmektedir.

Bir canlı doku yapısının kalınlığını sınırlayan en önemli faktörlerden biri de eksilerini oksijen kaynağı kontrolünü olantituent hücreleri. Difüzyon dayanarak zaman, kalınlığı çok ince bir tabaka bu sınırlıdır oluştururlar. , Oksijen ve in vivo besin tedarik kılcal damarların arasındaki maksimum mesafe oksijen 11,12 difüzyon sınırı ile bağlantılı olan, yaklaşık 200 mm. Yetersiz vaskülarizasyon doku iskemisi neden ve doku rezorpsiyonu veya nekroz 13 kadar varabilmektedir.

Buna ek olarak, doku onarımı için kullanılan ideal malzeme, biyolojik uyumlu ve immünojenik olmayan olmalıdır. Ayrıca, biyo ev sahibi hücrelerin daha da entegrasronu ve yapısal bütünlüğünü muhafaza kapasitesine sahip olmalıdır. Çeşitli biyolojik 14-16 ve sentetik 1,17,18 matrisler önce ancak bunların kullanımı etkili kan temini, enfeksiyonlara veya yetersiz doku gücü eksikliği nedeniyle sınırlı kalmaktadır, doku rekonstrüksiyonu için araştırılmıştır.

Bu çalışmada, biyolojik olarak uyumlu, hücre embGıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı poli-L-laktik asit (PLLA) / laktik-ko-glikolik asit (PLGA), poli, oluşan gömülmüştür skafold çıplak farenin femoral arter ve ven (AV) damarların etrafında yerleştirildi ve Sadece AV Gemilerden damarlanmayı sağlanması, çevre dokuya ayrılmış. Bir hafta implantasyon sonrası, greft, canlı, kalın ve iyi vaskülarize oldu. AV damarları ile bu kalın vaskülarize doku, daha sonra aynı fare bir karın tam kat defekt pediküllü flep olarak aktarıldı. Bir hafta sonrası transferi, flep, canlı damarlı ve iyi karın iç organları desteklemek için yeterli gücü taşıyan, çevre doku ile entegre oldu. Böylece, otolog pedikül taşıyan mühendislik kalın, damarlı doku flep, tam kat karın duvarı defektleri onarmak için yeni bir yöntem sunuyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan çalışmaları Technion Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından kabul edildi. Bu işlem için, atimik çıplak farelere bağışıklık sistemince reddini önlemek için kullanılmıştır. Fare başka tür kullanıyorsanız, fareler cerrahi işlem ve siklosporin idaresi (ya da başka bir anti-ret yerine) öncesinde tavsiye edilir traş edilmelidir.

1. İskele Hazırlama ve Hücre katıştırma

  1. Aşağıdaki şekilde poli-L-laktik-asit (PLLA) ve polilaktik-ko-glikolik asit (PLGA) ve 1 karışımı: 1 oluşan iskeleleri hazırlayın:
    1. PLLA 500 mg ve 10 ml kloroform içinde PLGA 500 mg çözülür.
    2. Bir Teflon kalıp toplandı, sodyum klorür parçacıkları 0.4 g polimer çözeltisi, 0.24 ml ilave edilir. 212-600 um'lik bir tuzunun çapı kullanın. Kloroform O / N buharlaşmasına izin verin.
    3. Birbirine bağlı gözenekli 3D iskeleleri giden damıtılmış su kullanarak tuz hemen çözün.
    4. Polimer parçalar KesBir makas kullanılarak, daha sonra, 30 dakika süre ile,% 70 etanol (h / h) ile ıslatın ve kullanımdan önce 2 dakika boyunca PBS içinde 3 kez yıkayın.
  2. (1 endotelial hücre ortamında (EGM-2,% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş olan madde malzemesi ve kas hücresi ortamı (Dulbecco minimal esas ortamı (DMEM), bileşenleri ile takviye edilmiş FBS: 1, aşağıdaki hücreler bir tri-kültür hazırlama ),% 2.5 HEPES tamponu, 100 U / ml penisilin, ve 0.1 mg / ml streptomisin (Pen-Strep çözeltisi).
    1. 0.5 x 10 6 C2C12 miyoblastlar, 0.9 x 10 6 İnsan göbeğine yakın damar endotelial hücreler (HUVECs) ve 0.2 x 10 6 normal insan dermal fibroblastları (NHDF) kullanın.
  3. , 4 dakika boyunca 200 x g'de bir mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj hücreleri birlikte karıştırın orta aspire ve hücre ortamı ul 4 ul buz gibi soğuk hücre dışı matris çözeltisi karışımı ve 4 pelet yeniden askıya.
  4. X 7 mm x 1 mm (uzunluk x genişlik x kalınlık) PLLA / PLG 10 mm'lik bir parça kesinBir skafold ve 4 ml hücre orta eklemeden önce (30 dak, 37 ° C,% 5 CO2), bir 6-yuvalı plaka içinde bir hücre süspansiyonu tohum hücre dışı matris çözeltisi katılaşmaya sağlar.
  5. Implantasyon öncesi on gün iskeleleri inkübe ve orta her gün değiştirin.

2. Cerrahi Prosedür Başlamadan Önce

  1. (Otoklav) aşağıdaki cerrahi aletler hazırlayın ve sterilize: küçük, ince, düz makas, bir yay makas, düz, ince uçlu forseps, taraklı forseps ve bir iğne tutucu.
  2. 425 ul ketamin ve 1 ml şırınga içinde 75 ul ksilazin karıştırılarak, bir mikrosantrifüj tüpü içinde ksilazin çözelti: a ketamin karışım hazırlayın.
  3. Steril tuzlu su (01:20) 'de 0,3 mg / ml buprenorfin seyreltilir.

3. Flap İnşaatı (Graft implantasyon)

  1. Bir insülin şırıngası kullanılarak, ketamin intraperitoneal bir enjeksiyonu yoluyla anestezi fare: ksilazin (35 ul başınaVücut ağırlığı 20 g) eklenmiştir.
  2. Deri altına buprenorfin opperation önce (0.05-0.1 mg / kg nihai konsantrasyon) enjekte edilir.
  3. Normal vücut sıcaklığını sağlamak için, 37 ° C ısıtılmış bir sahnede fare koyun ve daha sonra bir yapışkan bandaj kullanarak fare sabitleyin.
  4. Pamuk ipuçlarını kullanarak, farenin gözlerinin (dehidratasyonu önlemek için) göz merhemi yağlama yönetmek.
  5. Bir aseptik çalışma alanı oluşturmak için, pamuk ipuçları, iyot temiz kesi ve daha sonra% 70 etanol kullanılması.
  6. Küçük bir makas ve forseps kullanarak, femoral arter ve ven (AV) damarlar açığa kadar, femoral damarların paralel inguinal ligaman diz seviyesinden, deri yoluyla bir kesi yapmak.
  7. Dokuya daha rahat erişmek için, bir kafes kullanarak cilt basılı tutun.
  8. Yaylı makas ve forseps kullanarak, dikkatli çevreleyen dokudan femoral arter ve ven damarları izole. Kasık lig seviyesinden başlayınÜstün epigastrik damarların çatallanma Ament. Bacağa kan akışını korumak ve daha sonra iskemi önlemek amacıyla, el değmemiş profunda bırakın.
  9. Profunda'da altında ve tibial ve proneal AV bifurkasyonunun yukarıda maruz femoral AV etrafında (Bölüm 1) greft katlayın ve 8-0 ipek sütür kullanarak uçları katılın.
  10. Sadece femoral AV damarlarının çimlenme kılcal damarlar yoluyla implant kanlanmalı sağlamak için, 6-0 dikiş ile greft etrafında steril lateks parçası ve dikiş sarın.
  11. 4-0 ipek sütür kullanarak üstteki deriyi kapatın.
  12. Greft bir flep olarak aktarılır kadar anestezi ve bundan sonra her gün kurtarma kadar yakından fare izleyin. Deri altına buprenorfin 2-3 gün boyunca günde iki kez (0.05-0.1 mg / kg nihai konsantrasyon) enjekte edilir.
    NOT: maruz kalan doku dehidratasyonu önlemek için, herhangi bir aşamada tuz kullanın.

4. Flap Transferi

  1. Birinde ya daİki hafta İmplantasyon, ketamin intraperitoneal bir enjeksiyonu yoluyla anestezi fare: ksilazin (35 ul / 20 g), bir insülin şırıngası kullanılarak.
  2. Deri altına buprenorfin opperation önce (0.05-0.1 mg / kg nihai konsantrasyon) enjekte edilir.
  3. Normal vücut sıcaklığını sağlamak için, 37 ° C ısıtılmış bir sahnede fare koyun ve daha sonra bir yapışkan bandaj kullanarak fare sabitleyin.
  4. Pamuk ipuçlarını kullanarak, farenin gözlerinin (dehidratasyonu önlemek için) göz merhemi yağlama uygulanır.
  5. Pamuk ipuçları kullanılarak, mikropsuz bir çalışma alanı oluşturmak için, iyot ile ve daha sonra% 70 etanol ile (karın, diz alanı) kesi temizleyin.
  6. Dikkatlice makas kullanılarak, deride sütürler açıp, bir makas ve forseps kullanarak, ventral deri yoluyla devam inguinal ligament cilt üzerinden paralel bir kesi yapmak.
  7. Dikkatle forseps ile lateks parçası kaldırmak ve vaskülarize flep maruz kalmaktadır.
  8. Bir SCISS kullanmaors ve forseps, çevredeki doku doku kapağı teşrih.
  9. Bir forseps ve bir iğne tutucu kullanarak, AV kanamayı önlemek için 8-0 ipek dikişlerle femoral AV distal ucunu Arter. Ardından, distale katlanmış implante doku ve 8-0 sütür ile, diz hizasında AV dağlamak.
  10. Yavaşça tam kat defekt yapılmalıdır hangi mesafeden belirlemek için, arter zarar gelmesin, ventral karın duvarına doğru, greft ile sarılmış femur AV aktarın.
    DİKKAT: çok arter çekilmesi arteri zarar verecektir.
  11. Ince bir makas kullanarak, ventral karın duvarında bir kesi yapmak.
  12. Bir bahar makas kullanarak, rektus abdominus kasında bir kesi yapmak. Üstteki deri ile rektus abdominus kas yaklaşık 1 cm x 0,8 cm segmenti çıkartın.
  13. Ventral abdom tam kalınlıkta defekte, eksenel flep olarak, vaskülarize greft ile zarflı femur AV, Transferinal duvar.
  14. Fıtık önlemek için, 8-0 ipek sütürler kullanılarak, çevredeki kas dokusuna kanadı dikin.
  15. Karın kas flep dikilmesi sırasında iç organları dikilmesi önlemek için, bir forseps ile kas yükseltmek. Tam karın duvarı defekti etkisini taklit maruz kalan ventral cilt bırakın.
  16. İyotlu gazlı bez ve maruz alanının kirlenmesini önlemek için steril bir bandajla deride yara örtün.
  17. 4-0 ipek sütür kullanarak bacak cilt dikin.
  18. Flep alımı kadar, anestezi ve bundan sonra her gün kurtarma kadar yakından fare izleyin. Deri altına buprenorfin 2-3 gün boyunca günde iki kez (0.05-0.1 mg / kg nihai konsantrasyon) enjekte edilir.
  19. NOT: maruz kalan doku dehidratasyonu önlemek için herhangi bir aşamada tuz kullanın.

Graft Damar Perfüzyon 5. Ultrason Belirlenmesi

NOT: transferi öncesinde vasküler perfüzyon of greft ultrasonografi ile, implantasyon sonrası bir ve iki hafta ölçülür.

  1. % 2 izofluran kullanarak fare anestezisi.
  2. Normal vücut sıcaklığını sağlamak için, 38 ° C ısıtılmış bir hareketli sahnede fare yerleştirin ve daha sonra bir yapışkan bandaj kullanarak fare sabitleyin.
  3. B-mod ayarlanmış doğrusal olmayan dönüştürücü ile femoral arter ve ven damarları bulun.
  4. Renkli Doppler moduna ayarlamak transdüser kullanılarak greft femoral damarların açıklığını inceleyin.
  5. Üreticinin talimatlarına göre hedefli olmayan kontrast ajanı hazırlanır.
  6. Tuzlu su ile dolu bir 1 ml şırınga için kuyruk damarından sonda (27 G iğne ile 12 cm boru) takın. Isıtma sahnede fare yanında şırınga sabitleyin (şırınga hareketini önlemek için).
  7. Fare kuyruğu ven kateteri bağlayın ve iğne sabitleyin.
  8. Her iki enjeksiyonlar damara ve doldurmak için yapılıyor emin olmak için tuzlu su enjekte bazıtuzlu su ile boru (hava kabarcıklarını önlemek için).
  9. Kontrast maddenin 70 ul 1 ml şırınga doldurun ve kontrast maddesi şırınga ile tuzlu su şırınga değiştirin.
  10. Kontrast madde enjeksiyonu görüntü için ultrason ayarlayın. Non-lineer modda özelliklerinde 1,500 kare sayısını ve kare% 30 bozulma darbe kurdu.
    Not: bozulması puls sonrasında mikro-kabarcıklar kılcal kabarcık akış hızına bağlıdır ve mikro-kabarcıkların enjekte hızından bağımsız olan bir oranda damarları yeniden doldurun. Kare sayısı doldurma zamanında 19,20 göre değiştirilebilir.
  11. Yavaş yavaş kuyruk damar içine kontrast madde enjekte edilir.
  12. Yüksek çözünürlüklü ultrason sisteminin doğrusal olmayan kontrast modunda görüntüler yakalayın.
  13. Daha önce 19,20 açıklandığı gibi, yazılımı kullanarak sonuçları analiz.
    1. Görüntüsü elde im faiz (ROI) bir bölge çizindolaylı olarak kontrast modunda bozulması darbe sonrası. ROI sadece kontrast madde ile doldurulmuş alanı belirtilmelidir.
    2. Bozulması darbe sonrası karşı mikro-kabarcıkların enjekte edildikten sonra, doğrusal olmayan sinyal ortalama yoğunluğu oranıdır ve perfüzyon hacminin bir ölçüsüdür pik geliştirme (PE), hesaplayın.
    3. Pik sinyali (P) kadar geçen süre (T) tespit edilir akış oranı hesaplanır.

Greft Vaskülarizasyon Kapsamında 6. Belirlenmesi

Not: greft vaskülarizasyonu ölçüde bir veya iki hafta implantasyondan sonra belirlenir.

  1. Bir insülin şırıngası kullanılarak, ketamin intraperitoneal bir enjeksiyonu yoluyla anestezi fare: ksilazin (35 ul / 20 g) eklenmiştir.
  2. 1 ml şırınga kullanılarak, damar içinden, kuyruk damarına 10 mg / ml floresin izotiyosiyanat-eşlenikli dekstran (FITC-Dextran, = 500,000 MW) 200 ul enjekte edilir. </ li>
  3. On sn enjeksiyonundan sonra servikal dislokasyon ile fare euthanize.
  4. Fare bacak açın ve greft maruz kalmaktadır.
  5. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile greft yıkayın ve% 10 nötr tamponlu formalin uygulanır.
  6. Görüntü konfokal mikroskop kullanılarak fare bacak greft.
  7. Fonksiyonel damar yoğunluğu (FVD) ölçmek.
    1. Odaklı mikroskopik görüntülerin yeşil kanal (uyarma = 488 nm) izole edin.
    2. Yüksek kontrastlı yapıları vurgulamak amacıyla, bir yüksek geçiren filtre ile sonuçlanan görüntüleri geçirin.
    3. Yüksek geçiren filtre tarafından güçlendirilmiş olabileceğini gürültü çıkarmak için bir despeckling filtresi kullanın.
    4. Elde edilen görüntü üzerinde eşik değerini ayarlayın; orijinal görüntüdeki özellikleri ve yapıları, ikili görüntüde görülebilir olacak şekilde eşik değeri ayarlanır.
    5. Bir boyut eşiği uygulayın, böylece tanımlanan sIz daha büyük Bağlı piksel sadece gruplare eşiği ikili görüntüdeki kalır.
    6. Zhang-Suen algoritması kullanarak 21 greft gemilerin iskelet özetleyin.
    7. Her geminin orta hat uzunlukları toplanmasıyla ve ROI alanına göre sonucu bölerek FVD hesaplayın.

Graft 7. Immünohistolojik ve histolojik Boyama

  1. Immünohistolojik Boyama
    1. Konfokal görüntüleme sonra, küçük bir makas ve forseps bir kullanarak greft almak. Greft iki ucu AV damarları incelemek ve greft almak.
    2. 30 dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde greft saptamak - 2 saat.
    3. Parafine kadar% 70 etanol içinde histoloji kasetlerinde greft ve mağaza yerleştirin.
    4. Parafin standart fiksasyon kullanarak ve protokol 22 gömme göm ve bir mikrotom kullanılarak 5 mikron dilimler halinde parafin doku dilim. AV dikey bütün doku dilimgemiler.
    5. 10 dakika her biri, iki kez% 100 ksilen içine daldırma ile parafine gömülü bölümleri Deparaffinize.
    6. 250 ml'lik plastik Coplin kavanoza slaytlar düzenleyin.
    7. 3 dakika her biri için etanol konsantrasyonunun (100,% 96,% 90,% 80,% 70,% 50,% 30,% ve çift damıtılmış su (DDW)) azaltılması seri batırma ile rehidrate.
    8. DDW 250 mL antijeninin ortaya çıkartılması çözeltisi 2.35 ml sulandırarak antijeninin ortaya çıkartılması çözeltisi hazırlayın. 95 ° C'ye ayarlanmış bir mikrodalga 2 dakika boyunca antijeninin ortaya çıkartılması çözeltisi ısıtın.
    9. 95 ° C'ye ayarlanmış bir mikrodalga fırın içinde 3 dakika boyunca daha önceden ısıtılmış antijeninin ortaya çıkartılması çözeltisi ve ısı içine slaytlar yerleştirin. 50 ° C'ye kadar slaytlar soğutun.
    10. 2 dakika boyunca daha ısıtılır ve oda sıcaklığına soğutulur.
    11. Endojen peroksidaz aktivitesi söndürmek ve daha sonra PBS içinde iki kere yıkayın, oda sıcaklığında, 10 dakika boyunca% 3.3 H, metanol içinde 2 O 2 çözeltisi slaytlar inkübe edin.
    12. Bir kuluçka odasına hazırlayın: Yer ıslak absoBir histoloji kutu içinde rbent çarşaf ve hassas bir görev silecekleri kullanarak slaytları kurulayın.
    13. Yuvarlak dilim başına (PBS içinde hazırlanan% 2) çözeltisi bloke keçi serumu yaklaşık 50 ul bir hidrofobik kalem kullanılarak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir slayt üzerinde kesit alanı.
    14. Çözümü engelleme tavşan anti-CD31 antikoru 1:50 seyreltin, dilim başına yaklaşık 50 ul antikor uygulayın ve 4 ° C 'de O / N, inkübe edilir. PBS ile 3 kez, her biri 5 dakika durulayın.
    15. Slaytlarının yer, PBS içinde dilim başına antikorun yaklaşık 50 ul 400 ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir: biyotinlenmiş keçi anti-tavşan ikincil antikoru 1 seyreltin.
    16. PBS ile 3 kez, her biri 5 dakika durulayın.
    17. PBS içinde 400, oda sıcaklığında, 30 dakika süre ile slaytlar ile dilim başına yaklaşık 50 ul uygulamak ve inkübe: streptavidin-peroksidaz 1 seyreltin. PBS ile 3 kez, her biri 5 dakika durulayın.
    18. Üreticinin # göre dilim başına yaklaşık aminoethylcarbazole 50 ul (AEC) alt-tabakanın uygulama8217; ın talimatları. Reaksiyonu durdurmak için DDW slaytlar batırın.
    19. 2 dakika süreyle Mayer'in hematoksilen çözeltisi yaklaşık 50 ul bölümleri daldırarak mavi çekirdekleri Leke. Yavaşça su ile durulayın ve ardından orta montaj bölümleri kapsamaktadır.
    20. Bir çift-kör bir yaklaşım kullanarak CD31-pozitif boyanma niceliğini. CD31 boyama kahverengi leke olarak belirir. Binoküler mikroskop altında 40X büyütme görüş alanında 4-5 farklı alanları seçin. CD31-pozitif lümen sayısını.
      1. Alanların sayısı ve (binoküler verilerine göre) fieldarea ile sayılan lümen sayısı bölerek iskele başına CD31-pozitif lümen ortalama sayısını hesaplayın.
        NOT: uygulanan reaktif hacmi, tüm hatlarıyla dilim karşılamak için yeterli olmalıdır.
  2. Histolojik Boyama
    1. % 10 nötral tamponlu formalin greft sabitleyin.
    2. Parafin kullanılarak standart göm greftlertespit ve gömme işlemleri.
    3. 10 dakika boyunca iki kez,% 100 ksilen içine daldırma ile parafin kesitlerinden parafin çıkarın.
    4. % 100 izopropanol içinde rehidrasyon için iki kez hızlı yıkama.
    5. Iki kez hızlı yıkama% 95 Etanol.
    6. Musluk suyu ile üç kez yıkayın.
    7. 10 dakika boyunca Hematoksilen daldırın.
    8. Musluk suyu ile üç kez yıkayın.
    9. 2 dakika boyunca Eosin bölgesindeki Immere.
    10. Hızlı yıkama iki kez% 95 Etanol içinde kurutmak.
    11. Iki kez hızlı yıkama% 100 izopropanol.
    12. Iki kez hızlı yıkama% 100 ksilen.
    13. 1.5 mm kalınlığında cam kapak ile DPX yapıştırıcı ile kaplayın.
    14. 40X büyütmede mikroskop kullanılarak görüntü.

8. Mekanik Özellikler Değerlendirme

  1. Küçük makas ve forseps bir kullanarak greft almak.
  2. PBS greft durulayın.
  3. Greft genişlik ve kalınlık ölçülür ve kalınlığı ile çarpılan genişliği çapraz kesit alanı hesaplanır.
  4. Bizehidratlı greft bir gerilme-deformasyon eğrisi oluşturmak için test cihazı e.
    1. Sistem çekme kulpları arasındaki greft monte edin ve iki kulpları (yani, ilk uzunluk) arasındaki son uzunluğunu ölçmek.
    2. Başarısızlık kadar, 0.01 mm / sn gerilme hızını uygulayın.
    3. Üreticinin protokolünü kullanarak geliştirilen kuvvet ve deplasman kaydedin.
    4. Matlab bir gerilme-uzama eğrisi oluşturun.
      1. Bölü ilk uzunluk değiştirmesine göre, bu tür hesaplayın. Stres kesit alanına bölünmesi ile elde ölçülen kuvvet olarak hesaplanır.
      2. Gerilme-uzama eğrisindeki doğrusal bölgesi eğimi ve eğrinin maksimum noktası olarak sertliği belirlemek nihai gerilme mukavemetidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In vivo Greft damarlanma ve perfüzyon

Greftler önce eksenel flep olarak transfer bir ya da iki hafta implante edildi. Bir ve iki hafta sonrası implantasyon anda, greft alanının brüt gözlem canlı ve vaskülarize doku greft saptandı. Pozitif CD31 immün (Şekil 1A) ile tespit ve son derece perfüze FITC-dekstran kuyruk damarından enjeksiyon ve ultrason ölçümleri ile kanıtlandığı gibi, bu greftler, oldukça yüksek oranda damarlanmış kanıtladı. Birçok gemiler zaten bir hafta sonrası implantasyon, AV damarların yakınında ek bir hafta sonra önemli ölçüde arttı sayıda gözlendi. Fonksiyonel damar yoğunluğu (FVD) (Şekil 1B), FITC-dekstran esaslı belirleme greft yüksek bir haftalık İmplantasyon ve hiçbir anlamlı değişiklik in vivo hafta daha yer aldığı vaskülarize olduğunu göstermiştir. Gemi açıklığı ve perfüzyon saptandıŞekil 1C greft implantasyonu sonrası ev sahibi femoral damar açıklığı ve bütünlüğünü teyit ultrason görüntüleme ile (sırasıyla 1, bir ve iki hafta sonrası implantasyon, - 1 ± 2.71 mm - - 1 ± 0.51 mm - 1 ve 10.28 mm FVD 5.71 mm idi). . Ayrıca, ultrasonografik inceleme bir hafta sonrası implantasyon (Şekil 1D) ile karşılaştırıldığında iki hafta sonrası implantasyon biraz daha yüksek olduğu greft alanı içinde perfüzyon saptandı.

Flap özellikleri

Kanatlar bir hafta sonrası transfer Brüt incelemesinde, canlı kanlanan ve iyi entegre dokusu saptandı. Kanatlar çevrelerine firma eki uygulandı. Hücreli olmayan, nonvaskülerize greft kontrol etmek için önceden vaskülarize, hücreye gömülü kanatlara karşılaştırıldığında artmış sertlik ve direnç (kendini gösteren, önceki, üstün mekanik özellikler göstermiştir

figür 1
Kontrol grubuna göre postimplantasyon Şekil 1. Greft vaskularizasyon. (A) CD31-pozitif damarların yoğunluğu, bir ve iki hafta ölçülen. Tüm değerler greft alanının (mm 2) normalize vardır. * = T-testi p <0.05. (B) bir ve iki hafta İmplantasyon Fonksiyonel damar yoğunluğu (FVD). Anlamlı bir farklılık, p = 0.08 (t-testi) gözlenmiştir. (C) olarak Patent AV gemiler renkli Doppler modunda ultrasonografi kullanılarak görüntülendi. Mavi ve kırmızı Temsilci Vekiligreft kan akışını t. Sarı kadran greft alanı özetliyor. Bir ve iki hafta İmplantasyon de (D) Greft perfüzyon. (E ve F) konak doku ile entegre flep H & E boyama: siyah ok noktası canlı arter; beyaz oklar karın kas liflerini işaret; sarı oklar iskele kalıntıları etmektedir. (H ve G) konfokal mikroskopi görüntüleri ile gösterildiği gibi FITC dekstran dağılımı. Tüm tespitler için, örneklem büyüklüğü n ≥ 3 ve bütün değerler ortalamanın ortalama ± standart hata olarak temsil edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Kanadın bir hafta mekanik özelliklerisonrası transfer. (A) sertliği ve (B) kanatların kopma mukavemeti (UTS). Kontrol hücreleri olmadan boş bir greft duruyor, hücreler üç kültür greft duruyor. * = T-testi p <0.05, n = 3 Değerler ortalamanın ortalama ± standart hata olarak temsil edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Doku mühendisliği alanındaki ilerlemeler, çeşitli doku tiplerinin yeniden inşası için yedek dokular için büyüyen bir talep ile karşılandı. 1,17,18, sentetik ve biyolojik 14-16 malzeme olarak hem de üretim yöntemlerinin çeşitliliği, bu talepleri karşılamak için kapasiteleri açısından değerlendirilmiştir. Ancak, klinik bakım ve doku mühendisliği gelişmelere rağmen, tam kalınlıkta karın duvarı defektleri restorasyonu bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu tür kitlesel defektlerinin rekonstrüksiyonu için yeterli doku kalın ve (2) vaskülarize (1) olacak ve zaman üzerinde 23 (3), mekanik bütünlüğünü, ve (4) canlılığı göstermek zorundadır.

Burada, otolog doku flep alternatif olarak hizmet verebilir, kalın yaşayabilir ve vaskülarize doku flep oluşturmak için bir adım-adım detaylı protokol mevcut. Fabrikasyon kapak iki aşamada inşa edilmiştir: (1) Bir PLLA / PLGA iskele mou AV damarlarının etrafında yerleştirildise hindlimb ve sadece AV gemileri tarafından damarlanmayı izin çevreleyen dokudan ayrılır. (2) oluşturuldu vaskülarize, kalın doku flep daha sonra tam kalınlıkta karın duvarı defekti içine onun pedikül olarak görev AV damarları ile transfer edildi.

Uygun flep vaskülarizasyon konak 17,18,24 içinde başarılı entegrasyon için esastır. Kalın dokularda oksijen kaynağı ve yayılmasını arttırmak için tasarlanmış vaskülarize doku oluşturmak için çeşitli yaklaşımlar, literatürde tartışılmıştır. Bunlar arasında çeşitli iskelesi türleri 13,20,25-30, implantasyon sitesine anjiyojenik faktörler temin etmek için çeşitli tekniklere endotel hücreleri (EC) çimen gibi yöntemler bulunmuştur (ya da enjeksiyon ile doğrudan uygulama ile, dönüştürülmüş hücrelerin kullanımı faktörleri 31 eksprese mühendislik doku perfüzyonunun 37 sağlamak için farklı iskeleler 35,36), biyoreaktörlerin kullanımından -34 ya da yavaş salınımlı 38,39 istihdam. Burada, doku grefti otolog damarların sömürü, in vivo vaskülarize edildi. Vaskülarize, canlı kanıtladı ve perfüze greft, daha sonra tam kalınlıkta karın duvarı defekti onarmak için kalın bir doku flep olarak aktarıldı. Bir hafta sonrası transfer flep yaşayabilir ve karın iç organları desteklemek için yeterli mekanik dayanım özellikli. Burada, bozulmuş bağışıklık sistemini taşıyan atimik çıplak fareler, kullanılan; fare veya diğer bir hayvana, herhangi bir başka tür kullanarak (hücreler ile iskeleleri tohumlama zaman), immün reaksiyonların ihtimali göz önüne alınmalıdır. Bu tekniğin diğer sınırlamalar, arka bacağın kan gitmesi femoral AV kaplar, (1) transferi. Ancak, teknik, bakir Profunda ve derin femoral damarların bırakır ve hiçbir hindlimb iskemi flep transferi sonrasında gözlendi. Ayrıca, daha büyük hayvanlar için ve insanlarda kullanımı,vücutta gereksiz gibi periferik damarlar tavsiye edilecektir; (2) Yeterli vaskülarizasyon transferi flep öncesinde, acil durumlarda sınırlayıcı bir faktör olabilir ulaşmak için gerekli zamanı; ve (3) kanat oluşturma insanlarda ile ilişkisi sınırlayabilir, in vivo olarak gerçekleştirilir. Gelecekte, bu kanadı ex vivo yaratma aracı geliştirmeyi hedefliyoruz. Sunulan yöntemin avantajı yapı iskeleleri etrafında (otolog hücreler bulunan), otolog doku formasyonunu geliştirmek için kapasitesinde yatmaktadır. Sonuçta elde edilen doku, bir otolog doku kapağa uygun bir alternatif sunar. Ayrıca, skafold daha konak doku içinde greft vaskülarizasyon ve entegrasyonu geliştirmek için, implantasyondan önce otolog hücrelerinin tohumlandığı edilebilir. Otolog hücreler ve biyolojik olarak parçalanabilir ve biyouyumlu iskele kullanımı olup, immüno-reddinin önemli risk aşmak ve hasat ve postoperatif scarifi kaçınarak otolog kanatçıklara bir seçenek sunabilirkatyon.

Tarif edilen yöntem, büyük hayvanlarda deney çevrilen ve daha insanlarda klinik deneylerde genişletilmiş olabilir. Üstelik vücut içinde çeşitli hasarlı dokuları onarmak için tercüme edilebilir. İnsanlarda ve büyük hayvanlarda, kanatlar periferal damarların etrafında yerine femoral AV gemilerinde oluşturulabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28, (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12, (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32, (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69, (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128, (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372, (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367, (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351, (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18, (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28, (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16, (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193, (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50, (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52, (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14, (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8, (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118, (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111, (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27, (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16, (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3, (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100, (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7, (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15, (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108, (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23, (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21, (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106, (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34, (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34, (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116, (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115, (3), 353-360 (2007).
Engineered Vaskülarize Muscle Flap
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter