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Biology

की दुर्लभ सेल आबादी से ट्रैप-आर सी, अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि Published: September 10, 2015 doi: 10.3791/52985
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Introduction

कोशिकाओं के विकास के दौरान विशिष्ट संपत्तियों के अधिग्रहण समझ कैसे अंगों की जटिलता और रोग की स्थिति के प्रति अपनी क्षमता विकास की सराहना करने के क्रम में महत्वपूर्ण है। Unrevealing वैश्विक जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल से सेल विनिर्देश और भेदभाव underly कि जीन विनियामक नेटवर्क को समझने के लिए एक बड़ा अनुसंधान धक्का है, पोल द्वितीय बाध्यकारी स्थिति, विनियामक दृश्यों या histones की बाद translational संशोधनों पर प्रतिलेखन कारक अधिभोग।

एक वैश्विक स्तर प्रोटीन पर जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने और आरएनए seq के तरीकों का इस्तेमाल किया जाता है। डीएनए आरएनए-सेक कोडिंग सहित और microRNAs, lncRNAs या snRNAs तरह आरएनए noncoding RNAs के विभिन्न प्रकारों पर सूचित करने के लिए बेहतर तैयार है, जबकि mRNA बहुतायत पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, इन तकनीकों को सक्रिय रूप-लिखित अंतर नहीं कर सकते, स्थिर राज्य mRNA, mRNA के लिए सक्रिय रूप से-अनुवाद और mRNA गिरावट प्रक्रिया में प्रवेश। स्थिर सेंट मापनेmRNA स्तर खाया proteome रचना 1-3 की एक गरीब अनुमान होने के लिए जाना जाता है। इसके विपरीत में, mRNA के लिए सक्रिय रूप से-अनुवाद की पहचान प्रोटीन के उत्पादन का एक और अधिक सटीक तस्वीर देता है।

हालांकि, transcriptomic के अध्ययन मुख्य रूप से जंगली प्रकार हालत 4-7 करने के लिए या विच्छेदित ऊतक पर लाभ या एक विशिष्ट कारक के समारोह के नुकसान की तुलना व्याख्या करने के लिए जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल मुश्किल बनाकर पूरे जीव स्तर पर नेतृत्व किया गया है। सेल को निशाना बनाने के उपकरण, आत्मीयता शुद्धि और संवेदनशीलता के सुधार में हाल के अग्रिमों अब जीनोम चौड़ा एक जीवित जीव में छोटे सेल आबादी या यहां तक ​​कि एकल कक्षों पर विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं।

ड्रोसोफिला में, ट्रांसजेनिक लाइनों के बड़े संग्रह सेल समारोह के लिए आवश्यक आणविक तंत्र का अधिक सटीक मात्रा का ठहराव उपज Gal4 / यूएएस सिस्टम 8-10 के माध्यम से विभिन्न ऊतकों और सेल उप-जनसंख्या के विशिष्ट अस्थायी और स्थानिक लक्ष्य-निर्धारण सक्षम।

11 सक्रिय रूप-अनुवाद पर कब्जा करने के एक तरीके के रूप में वर्णित किया गया था polysome। सुक्रोज ढाल centrifugation के आधार पर इस विधि प्रोटीन या गहरी अनुक्रमण के साथ विश्लेषण किया जब polysome अंश और mRNA के निर्धारण के चयन के जीनोम चौड़ा अनुवाद की अनुमति देता है। Polysome अलगाव अनुवाद प्रक्रिया 12 के दौरान राइबोसोम द्वारा संरक्षित शाही सेना के टुकड़े करने के लिए इसी राइबोसोमल पैरों के निशान की पहचान करने के लिए nuclease पाचन के साथ मिलकर किया जा सकता है। Ribosomal footprinting आरएनए अनुवाद और आरएनए अनुक्रम स्तर के संकल्प और राइबोसोम स्थिति की मात्रा का ठहराव की सटीकता, अनुवाद की दर को मापने के लिए यह संभव बनाता है बढ़ जाती है। हालांकि, यह मुख्य कारण राइबोसोम footprinting प्रक्रिया के अंत में प्राप्त की शाही सेना उपज में मजबूत कमी करने के लिए, translatomes की सेल विशिष्ट अलगाव के लिए लागू नहीं किया गया है तिथि करने के लिए। शाही सेना के आकार चयन संभावित झूठी पी उत्पन्न हो सकता है कि यह देखते हुएयह भी एक समान तरीके में शाही सेना की रक्षा की जा सकती है कि विभिन्न RNPs से ositives, आगे की घटनाओं राइबोसोमल footprinting में सुधार लाने और सेल विशिष्ट दृष्टिकोण के लिए यह अनुकूल करने के लिए आवश्यक हैं।

इस तरह के तरीकों में से एक, अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (जाल) Heiman एट अल द्वारा 2008 में वर्णित किया गया है कहा जाता है। और चूहों में न्यूरॉन्स की एक सबसेट से translatome को अलग-थलग करने के लिए आवेदन किया। द्वारा एक सेल प्रकार विशिष्ट तरीके से एक राइबोसोमल प्रोटीन मिलान टैगिंग, polysomes चुनिंदा सेल हदबंदी और छंटनी की श्रमसाध्य कदम के बिना शुद्ध किया जा सकता है। इस मामले में, राइबोसोम की सतह पर 60 राइबोसोमल प्रोटीन L10a EGFP 13 के साथ टैग किया गया था। 2008 के बाद से, कई अध्ययनों एक्स 14-19 चूहों से, विभिन्न प्रजातियों में इस विधि का इस्तेमाल किया है 24 thaliana 20,21, zebrafish 22,23 और एराबिडोप्सिस laevis। जाल विधि भी ड्रोसोफिला मॉडल के लिए अनुकूलित और पुरी करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैवित्तीय वर्ष सेल प्रकार विशिष्ट neuronal कोशिकाओं 25 और astrocytes 26 से mRNAs। बहुमुखी बाइनरी Gal4 / यूएएस प्रणाली एक ऊतक विशेष ढंग से GFP टैग RpL10A व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। वयस्क मक्खियों के प्रमुखों अनुक्रम थे (अखिल तंत्रिका ELAV-Gal4 चालक द्वारा लक्षित) neuronal कोशिकाओं और पृथक आरएनए से polysome चयन प्रदर्शन करने के लिए विच्छेदित कर रहे थे। ऊपर विनियमित जीन की बड़ी संख्या ड्रोसोफिला भ्रूण के विकास में (कम से कम 1 कोशिकाओं की%) वर्तमान दृष्टिकोण अच्छा विशिष्टता है कि यह दर्शाता है और दुर्लभ सेल आबादी के लिए अनुकूल करने के लिए हमें उत्साह, तंत्रिका तंत्र में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है उन लोगों के लिए corresponded ।

आणविक अभिनेताओं और मॉर्फ़ोजेनेटिक आंदोलनों evolutionarily संरक्षित कर रहे हैं के रूप में ड्रोसोफिला मॉडल के भीतर, भ्रूण अवस्था, विकास की प्रक्रिया के अध्ययन के लिए पसंद का एक मॉडल है। इस मॉडल में अब तक आयोजित केवल ऊतक विशेष transcriptomic दृष्टिकोण इसलिए सेल या परमाणु का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया हैrting और केवल मक्खी भ्रूण में ऊतक / सेल विशिष्ट translatome की रूपरेखा के लिए समर्पित तरीकों के लिए एक बनाने की जरूरत, स्थिर राज्य transcriptome 27-31 अध्ययन करने के लिए सक्षम है। यहाँ हम ड्रोसोफिला भ्रूण को समर्पित पहली जाल प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। इस विधि के साथ लगे-अनुवाद में mRNA भ्रूण प्रति 100 के आसपास की मांसपेशियों की कोशिकाओं का एक बहुत ही सीमित सेल की आबादी में सफलतापूर्वक उच्च गुणवत्ता और विशिष्टता के साथ पृथक किया गया। बाइनरी Gal4 / यूएएस प्रणाली किसी भी विषाक्तता के बिना मांसपेशियों के उप-जनसंख्या में GFP टैग RpL10A की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है, कोई स्पष्ट phenotypes या विकासात्मक देरी पहले से दिखाया गया है 25। ड्रोसोफिला भ्रूण मांसलता को जन्म देगा कि hemisegment प्रति 30 मांसपेशियों के अधिकारी लार्वा की। झुकना पहचान जीन के आसपास के क्षेत्र में खोज की एक नियामक क्षेत्र का उपयोग करके, 30 बहु-केन्द्रक की मांसपेशियों में से 6 लक्षित कर रहे हैं। इस परख में, राइबोसोम अनुवाद बढ़ाव का उपयोग कर mRNA पर स्थिर कर रहे हैंcycloheximide अवरोध करनेवाला। साइटोसोलिक अर्क तो GFP एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ आत्मीयता शुद्धि के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। शुद्ध शाही सेना की गुणवत्ता Bioanalyzer का उपयोग कर मान्य किया गया था। मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (आरटी-qPCR) विशिष्टता और mRNA अलगाव की संवेदनशीलता का निर्धारण किया जाता है और हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल अत्यधिक कुशल है कि प्रदर्शन किया गया।

Protocol

1. मक्खी लाइन जनरेशन

  1. दो अलग-अलग निर्माणों उत्पन्न करता है। पहले निर्माण में, RpL10A सीडीएनए (राइबोसोमल प्रोटीन सबयूनिट L10a) pUASP-पी एल GFP-nter प्लाज्मिड में GFP के बहाव के क्लोन है (32 से संशोधित संस्करण)। एक germline प्रमोटर के उपयोग ट्रांसजेनिक लाइन का एक और अधिक polyvalent उपयोग की अनुमति देता है।
    नोट: pPTGAL4 प्लाज्मिड का उपयोग कर GAL4 (टीएफ) के अपस्ट्रीम झुकना जीन के ऊतक विशेष अभिव्यक्ति ड्राइविंग नियामक अनुक्रम क्लोनिंग द्वारा दूसरे निर्माण प्राप्त करते हैं।
  2. 1118 मक्खियों w में अलग से प्लास्मिडों इंजेक्षन और 33 (मानक प्रक्रिया के अनुसार) पी-तत्व प्रविष्टि से मक्खी जीनोम में निर्माणों डालें।
  3. आदेश में चयन transformants दो अलग गुणसूत्रों पर निर्माणों के साथ उड़ लाइनों को ठीक करने के लिए। अंतिम जाल लाइन एक डबल ट्रांसजेनिक स्थिर लाइन प्राप्त करने के क्रम में इन दो पंक्तियों (आनुवंशिक पार) के संयोजन के द्वारा बनाई गई है। F0: डब्ल्यू; Cyo, यूएएस EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bएक्स डब्ल्यू; cyo / Scu; झुकना Gal4 / TM6B। F1: डब्ल्यू; Cyo, यूएएस EGFP :: RpL10A; झुकना Gal4 / TM6B। व्यापक इस लाइन बढ़ाना और इच्छित मंचन भ्रूण इकट्ठा।

2. भ्रूण संग्रह

  1. पिंजरे प्रति युवा मक्खियों के चारों ओर 40 ग्राम युक्त 8 बड़े बेलनाकार जनसंख्या पिंजरों तैयार (180000 मक्खियों / पिंजरे के आसपास)।
  2. मक्खियों उनकी oviducts से विकासशील भ्रूण स्पष्ट करने की अनुमति है कि तथाकथित पूर्व लेज के साथ आगे बढ़ें। उस के लिए, जम अगर और अंगूर का रस का एक मिश्रण युक्त दो 11 सेमी व्यास पेट्री डिश पर 1 घंटे के लिए मक्खियों करना और हौसले से बनाया खमीर पेस्ट के साथ सतह के ⅓ को कवर किया। अंगूर के 3 आदान-प्रदान के बाद रस प्लेटें समान ताजा बना प्लेटों पर वास्तविक भ्रूण इकट्ठा।
    नोट: ऊष्मायन समय का अध्ययन किया विकास समय खिड़की के अनुसार अलग अलग होंगे।
  3. पिंजरों से प्लेटें निकालें और addit की (जैसे, अंडे बिछाने के 3 घंटा + 10 घंटा सही विकास मंच प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय के लिए ही तापमान पर उन्हें छोड़ional ऊष्मायन 10-13 घंटा अंडे बिछाने (AEL)) के बाद मंच से भ्रूण देता है। एक ब्रश का उपयोग कर पानी की 50 मिलीलीटर के साथ थाली सामग्री (भ्रूण, खमीर पेस्ट, मृत मक्खियों) Resuspend।
  4. मृत मक्खियों से भ्रूण और शेष शरीर के अंगों को अलग किया और छोटे-व्यास चलनी पर बरकरार रखा भ्रूण लीजिए, तो विआयनीकृत पानी में संक्षेप में धोने के लिए चलनी (700 माइक्रोन, 355 माइक्रोन, 112 माइक्रोन) की एक श्रृंखला के माध्यम से जाओ। यह चलनी रोकना कर सकते हैं के रूप में संग्रह के प्रति अधिक से अधिक 18 प्लेटों का प्रयोग न करें।
  5. विआयनीकृत पानी में 4.5% ब्लीच में dechorionate भ्रूण 2 मिनट के लिए और 30-60 सेकंड के लिए विआयनीकृत पानी से अच्छी तरह कुल्ला। आंदोलन के तहत आरटी पर 5-10 मिनट के लिए, पीबीएस 0.01% बीच 20, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cycloheximide में भ्रूण सेते हैं।
  6. सेलूलोज शोषक शीट पर सूखी भ्रूण और microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण। ट्यूबों के वजन और तरल नाइट्रोजन में विसर्जन के द्वारा भ्रूण फ्लैश फ्रीज। इस स्तर पर, सूखे भ्रूण -80 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  1. अच्छी तरह से कोमल आंदोलन के द्वारा मूल बोतल में प्रोटीन जी चुंबकीय मोती resuspend।
  2. स्थानांतरण 90 एक RNase मुक्त ट्यूब को मोतियों की μl और एक चुंबक (30-60 सेकंड) पर उन्हें इकट्ठा। मोतियों की 90 μl 60-80 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन युक्त lysate के 1 मिलीलीटर के साथ immunoprecipitation (आईपी) प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। मनका संतृप्ति को रोकने के अनुपात का सम्मान करें। प्रोटीन राशि के अनुसार कई ट्यूब का उपयोग करें।
  3. चुंबक पर धो 1 × पीबीएस 0.01% बीच 20 (500 μl) के साथ माला और इकट्ठा मोती सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए। मोती के लिए पीबीएस 0.01% बीच 20 से 350 μl में GFP एंटीबॉडी के 30 माइक्रोग्राम जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण अंत पर धीमी गति से अंत के साथ सेते हैं।
  4. चुंबक (30-60 सेकंड) पर मोती लीजिए सतह पर तैरनेवाला त्यागें और polysome निकासी बफर के 500 μl में कुल्ला (Hepes 10 मिमी, KCl 150 मिमी, 2 MgCl 5 मिमी, डीटीटी 0.5 मिमी, ट्राइटन 1%, cycloheximide 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर , पीआरotease 1 × अवरोध, RNase अवरोध करनेवाला 100 यू)।
  5. चुंबक पर मोती लीजिए और अवरुद्ध बफर के 500 μl जोड़ने (बीएसए 0.1 माइक्रोग्राम / μl, खमीर tRNA 0.1 माइक्रोग्राम / μl, polysome निष्कर्षण बफर में 0.1 माइक्रोग्राम / μl ग्लाइकोजन)।
  6. आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और ताजा अवरुद्ध बफर के साथ एक बार इस चरण को दोहराएँ।
  7. तो मोती स्मरण करना और immunopurification कदम (धारा 6) के लिए तुरंत आगे बढ़ना है, चुंबक पर मोती लीजिए और polysome निकासी बफर के 500 μl में कुल्ला।

4. lysate तैयारी

  1. शुरू करने से पहले, बहु दिशात्मक तेज गति मोती चक्की पर कार्यक्रम की स्थापना: 2 × 10 सेकंड आरपीएम 5000 में, 15 सेकंड ठहराव। 15 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण सूखे भ्रूण (1.5 ग्राम) polysome निकासी बफर युक्त बर्फ पर prechilled, और तुरंत homogenize। Polysome निकासी बफर के 4 मिलीलीटर में भ्रूण की 1.5 ग्राम Homogenize।
  2. दो में फैले homogenized भ्रूण 2 एमएल ट्यूबों prechilled और Embry पीसhomogenizer कार्यक्रम चलाकर ओएस। बर्फ पर ताजा prechilled microcentrifuge ट्यूबों में lysate स्थानांतरण और 2,000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा एक postnuclear सतह पर तैरनेवाला तैयार करते हैं।
  3. बर्फ पर एक ताजा prechilled microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला सतह पर तैरनेवाला (अंतिम एकाग्रता = 0.1%) के लिए 10% Nonidet पी 40 के 1/100 नमूना मात्रा जोड़ने के लिए, और inverting ट्यूब द्वारा धीरे मिश्रण।
  4. पल्स-सेंट्रीफ्यूज एक minifuge में नमूना, ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा 300 मिमी 1,2-Diheptanoyl-एस.एन.-glycero-3-phosphocholine (DHPC) (अंतिम एकाग्रता का 1/9 नमूना मात्रा = 30 मिमी से जोड़ने के लिए )), inverting ट्यूब द्वारा धीरे यह मिश्रण है, और ऊष्मायन के दौरान कई बार inverting द्वारा (5 मिनट के लिए मिश्रण बर्फ पर मिश्रण सेते हैं।
  5. 20,000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा पोस्ट-माइटोकॉन्ड्रियल सतह पर तैरनेवाला तैयार करें। ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय: lysate में एकाग्रता 60-80 मिलीग्राम / एमएल के बीच होना चाहिए। टीएक ताजा नए prechilled microcentrifuge ट्यूब सतह पर तैरनेवाला ake और पूर्व अवशोषण कदम (धारा 5) के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

5. पूर्व-अवशोषण

  1. अच्छी तरह से कोमल आंदोलन के द्वारा चुंबकीय मोती resuspend और आरटी पर एक microcentrifuge ट्यूब में (मोती / 1 मिलीलीटर भ्रूण lysate के 30 μl) मोतियों की 30 μl हस्तांतरण।
  2. बंद सतह पर तैरनेवाला, चुंबक पर पिपेट मोती ले लीजिए, और polysome निष्कर्षण बफर (500 μl) में मोती resuspend। चुंबक पर मोती लीजिए भ्रूण lysate जोड़ने के लिए, और एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    1. मोती निकालें और immunopurification कदम के लिए बर्फ पर सतह पर तैरनेवाला रहते हैं। Immunopurification से पहले, उदाहरण के लिए RT-qPCR द्वारा immunopurification के बाद एकत्र आरएनए नमूना, के साथ वैश्विक आरएनए नमूना तुलना करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के 100 μl (इनपुट) रहते हैं।

6. Immunopurification

  1. की (60-80 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन के लिए इसी) 1 मिलीलीटर जोड़ेंGFP एंटीबॉडी के लिए युग्मित अवरुद्ध मोतियों की 90 μl युक्त एक RNase मुक्त ट्यूब lysate पूर्व अवशोषित। एक ट्यूब रोटेटर में कोमल अंत से अधिक अंत मिश्रण के साथ 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन हे / एन प्रदर्शन करते हैं।
  2. ऊष्मायन के बाद, चुंबक पर मोती को इकट्ठा। तो 0.5 मिमी, cycloheximide 100 माइक्रोग्राम / एमएल, RNase अवरोध करनेवाला 100 यू धो बफर के 500 μl (Hepes 10 मिमी, KCl 350mm, 2 MgCl 5 मिमी, Nonidet पी 40 1%, डीटीटी में resuspend, मोती नीचे स्पिन करने के लिए एक minifuge प्रयोग करें ) और चुंबक पर उन्हें इकट्ठा। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  3. एक नए prechilled RNase मुक्त ट्यूब को मोतियों को बदलें और दो बार धो लें। एक चुंबक पर मोती लीजिए और मोती के लिए TRIzol सीधे 1 मिलीलीटर जोड़कर शाही सेना निकासी के लिए आगे बढ़ना है और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

7. आरएनए क्लीन अप और गुणवत्ता मूल्यांकन

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक RNeasy माइक्रो किट का प्रयोग करें। पूरा होने पर, elut(एक्स) μl RNase मुक्त पानी के साथ ई आरएनए। 2 60 डिग्री सेल्सियस पर मिनट, और दुकान के लिए गर्म तस्वीर जमी नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर। Bioanalyzer का उपयोग करते हुए शाही सेना गुणवत्ता चेक (निर्माता के निर्देशों का पालन करें)।
  2. TRAPed शाही सेना की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, निर्माता के निर्देशों (सुपरस्क्रिप्ट तृतीय) के अनुसार शुद्ध शाही सेना (इनपुट और आईपी) के 3 एनजी पर रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करते हैं। जीन विशिष्ट प्राइमर सेट का उपयोग कर qPCR के लिए प्राप्त सीडीएनए का प्रयोग करें।

Representative Results

ड्रोसोफिला भ्रूण दैहिक पेशी सिस्टम hemisegment प्रति 30 मांसपेशियों से बना है, और प्रत्येक पेशी संपत्तियों की एक विशिष्ट सेट है: पहचान जीन, स्थिति, संलयन घटनाओं, लगाव साइटों और तंत्रिका वितरण की संख्या के कोड। एक विशिष्ट मांसपेशी सबसेट में अनुवाद किया mRNA की पहचान इन विशिष्ट मांसपेशी विशेषताओं बनाने के लिए आवश्यक प्रोटीन के बारे में जानकारी दे देंगे। पहचान जीन झुकना व्यक्त की मांसपेशियों के एक उप-जनसंख्या से ट्रैप-आधारित पद्धति, शाही सेना का उपयोग (चित्रा 1 ए-बी) के शुद्ध किया गया था। इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख चिंता का विषय पृथक शाही सेना की गुणवत्ता और विशिष्टता है। यहां बताया अनुकूलित प्रोटोकॉल Bioanalyzer विश्लेषण के साथ मूल्यांकन उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना की व्यवस्थित वसूली सक्षम होना चाहिए। प्रोफ़ाइल प्राप्त शो शाही सेना की कोई गिरावट (चित्रा 1 सी)।

जाल विधि के आसपास विकसित की अन्य अध्ययनों में सवालों के डेटा की विशिष्टता पर उठाया गया था। यहाँ हम मैंमोती या ट्यूबों के लिए शाही सेना के गैर विशिष्ट बंधन को और धोने बफर के अनुकूलन से जुड़े पृष्ठभूमि को दबाने के लिए विधि mprove। पृष्ठभूमि के स्तर पर और झुकना व्यक्त कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता का आकलन करने के लिए, हम एक ही भ्रूण चरण के 3 प्रतिकृति पर RT-qPCR परीक्षणों का नेतृत्व किया। 4 विभिन्न जीनों की-संवर्धन गुना (mef2, झुकना, Prospero, soxNeuro) RpL32 जीन (चित्रा -1) के खिलाफ इनपुट और सामान्यीकृत की तुलना में गणना की गई। इन परिणामों के अखिल पेशी जीन mef2 और झुकना जीन का 5.6 गुना संवर्धन के 2.3 गुना संवर्धन दिखाया। इसके विपरीत, तंत्रिका प्रणाली में व्यक्त दो जीन समाप्त इनपुट की तुलना में थे। इसी तरह बहुत गुना परिवर्तन मूल्यों प्रोटोकॉल मजबूत है कि प्रदर्शन, 3 जैविक प्रतिकृति पर मनाया गया। 150 × 10 ^ 6 सकारात्मक (कुल 100 GFP कोशिकाओं / भ्रूण होते हैं कि प्राप्त किया गया 1.5x10 ^ 6 भ्रूण के चारों ओर, 1.5 ग्राम के साथ शुरू झुकना-Gal4 ड्राइवर के साथ औरकोशिकाओं)।

जाल प्रयोग चलाने के बाद, उपज चरण के हित के आधार पर विशिष्ट शाही सेना के चारों ओर 25-45 एनजी है। इस सामग्री को माइक्रोएरे विश्लेषण या एक शाही सेना-सेक पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए एक प्रवर्धन प्रोटोकॉल का उपयोग आरएनए-सेक चलाने के लिए पर्याप्त है। क्षमता RpL10A-EGFP व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया ड्राइवर के बल पर दृढ़ता से निर्भर करेगा।

चित्र 1
चित्रा 1. गुणवत्ता और झुकना-Gal4> UASRpL10A-EGFP भ्रूण से ट्रैप-पृथक शाही सेना की विशिष्टता मूल्यांकन।

(एबी) hemisegment (ए) के अनुसार छह झुकना मांसपेशियों की कोशिकाओं में विशेष रूप से RpL10A-EGFP अभिव्यक्ति दिखा एक मंच -16 भ्रूण के confocal छवियों। सामान्य पेशी मार्कर Beta3tubulin साथ RpL10A-EGFP के सह स्थानीयकरण मर्ज चित्र (बी) पर मनाया जाता है। (सी) TRAPed आरएनए रा की गुणवत्ता नियंत्रणएन Bioanalyzer पर rRNA 18S और 28S का सही अखंडता दिखा। (डी) आर टी-qPCR विश्लेषण चरण -16 भ्रूण के 3 जैविक प्रतिकृति पर ट्रैप-पृथक mRNA के प्रयोगों के उच्च विशिष्टता दिखा। मोड़ो परिवर्तन इनपुट और RpL32 जीन के खिलाफ सामान्यीकृत की तुलना में गणना की है। सभी मांसपेशी प्रजातियों में मौजूद Mef2 टेप अधिक प्रतिबंधित झुकना टेप 5.6 गुना-समृद्ध कर रहे हैं, जबकि इनपुट की तुलना में 2.3 गुना-समृद्ध कर रहे हैं। तंत्रिका Prospero व्यक्त कोशिकाओं और soxN जीन 2.2 गुना और क्रमश: 5.5 गुना समाप्त हो रहे हैं। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व (एन = 3)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस पत्र ड्रोसोफिला भ्रूण में दुर्लभ सेल आबादी के अध्ययन के लिए समर्पित एक संशोधित अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल (डब 'जाल-आर सी') का वर्णन है। सूचना माइक्रोएरे या आरएनए-सेक विश्लेषण, भ्रूण सेल और polysome निकासी के लिए, यानी 1) आवश्यक जैविक सामग्री की मात्रा और अनुकूलित प्रक्रिया के लिए उपयुक्त उपज के साथ विशिष्ट शाही सेना के सफल अलगाव के लिए महत्वपूर्ण कदम पर प्रदान की जाती है; 2) मोती / एंटीबॉडी करने वाली lysate इष्टतम immunoprecipitation के लिए अनुपात; उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ ट्रैप-आर सी प्रयोगों को चलाने के लिए इतनी के रूप में 3) धो बफर संरचना सहित पृष्ठभूमि की कमी की अनुमति के कदम।

इस प्रोटोकॉल यह आसानी से किसी भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू कर रही प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा अर्जित करता है। इस तकनीक को सक्रिय रूप-अनुवाद mRNA के स्तर पर अंतर जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण और इस तरह एक कल्पना में प्रोटीन अभिव्यक्ति को समझने के लिए मार्ग प्रशस्त करने के लिए यह संभव बनाता है एक विशिष्ट समय खिड़की पर ific सेल प्रकार। प्रोटीन बहुतायत अनुवाद और गिरावट प्रक्रियाओं की दर पर निर्भर करेगा लेकिन ध्यान दें कि। जाल विधि का एक प्रमुख सीमा एक सटीक मात्रात्मक तरीके से प्रोटीन सामग्री को मापने के लिए या बाद translational संशोधन का पता लगाने के लिए अपनी असमर्थता है। एक सेल प्रकार विशिष्ट ढंग से, ऐसा करने में, mRNA के शरीर के साथ राइबोसोम घनत्व को मापने के द्वारा मात्रा का ठहराव में सुधार और राइबोसोम एक बहुत शक्तिशाली उपकरण footprinting के साथ संयुक्त जाल बनाने के कर सकते हैं। हाल ही में एक पेपर 34 में, इस संयोजन मानव भ्रूण गुर्दे 293 कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया था। लेखकों streptavidin मोतियों का उपयोग कर RpL10A की एक inducible biotinylated प्रपत्र की आत्मीयता शुद्धि के बाद nuclease footprinting भाग गया। इस तरह से यह सीमा उद्देश्य के लिए आवश्यक जैविक सामग्री की राशि से किया जा रहा है, एक विशिष्ट प्रकार की कोशिका को लक्ष्य करते हुए एक पूरे जीव में राइबोसोम footprinting प्रदर्शन करने के लिए संभव है कि सिद्धांत का एक सबूत है।

"> वैश्विक transcriptomic विश्लेषण के साथ समानांतर में जाल प्रयोगों प्रदर्शन के लिए यह संभव नव लिखित और आरएनए अनुवाद actively-। यह विशिष्ट विकास संदर्भों या विशेष सेल आबादी में जगह लेने के संभावित पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र का गहरा जानकारीपूर्ण किया जाएगा के बीच अनुपात को ट्रैक करने के लिए कर देगा उदाहरण के लिए -by microRNAs।

अंत में, जाल एक सेल विशिष्ट ढंग से सक्रिय रूप-अनुवाद राइबोसोम के लिए बाध्य आरएनए की पहचान करने के लिए एक अत्यधिक कुशल, विशिष्ट और संवेदनशील तरीका है। इस विधि जीवों और प्रकार के ऊतकों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ वर्णित नए जाल-आर सी प्रोटोकॉल दुर्लभ सेल आबादी (कुल सेल नंबर का 1% से कम) के लिए और पूरे जीनोम स्तर पर बाद के विश्लेषण के लिए पर्याप्त अंतिम सामग्री की मात्रा के लिए अनुकूलित किया गया था।

इस पद्धति का एक संभव सीमा कंप्यूटर अनुप्रयोग के लिए पर्याप्त राशि में टैग राइबोसोम निर्माण करने के लिए एक मजबूत ड्राइवर की आवश्यकता हैलक्षित सेल प्रकार में अंतर्जात untagged लोगों के साथ Ete। हाल के एक अध्ययन में 25 में, लेखकों 10-30% तक untagged राइबोसोम बनाम टैग किया के अनुपात का अनुमान है।

काफी इस संतुलन में सुधार करना चाहिए यूएएस RpL10A-EGFP प्रतिलिपि संख्या बढ़ रही इस समस्या को दूर करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, वर्णित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए एक यूएएस GAL4 ट्रांस्जीन जोड़ने GAL4 प्रोटीन का उत्पादन बढ़ाना होगा और परोक्ष रूप से RpL10A-EGFP की अभिव्यक्ति वृद्धि हुई है। इस mRNA पर टैग किया राइबोसोम की एक बेहतर अधिभोग एहसान चाहिए।

यह पहले से ही कुशल दृष्टिकोण भी अधिक शक्तिशाली एक और मात्रात्मक पहलू लाने के लिए या खोज और जीन अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के लिए जरूरी है कि आणविक तंत्र को खंडित करने के लिए पूरक के तरीकों द्वारा अनुकूल बनाया जा सकता है कि ध्यान दें।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma  H4034-1006
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine  Avanti Polar Lipids 850306P
Glycogen thermo scientific  R0561
Purified BSA 100X  Biolabs B9001
Yeast tRNA  Sigma R5636
Super RNase In  Ambion AM2694
Antibody GFP clone N86/38 UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated 75-132 
Nonidet P40  Roche 11754595001
Precellys 24 Lysis homogenisation  Bertin Technology
Nuclease free water  Nalgene
Dynabeads ProteinG Invitrogen 10004D
Potassium chloride (KCl) Applied Biosystem  AM96406
Magnesium Chloride (MgCl2)  Applied Biosystem  AM95306
Cellulose waddin unbleached  VWR 115-2597 
Sieves 112, 355, 710 um  Retsch
TRiZol  Invitrogen 15596-018
MagRack 6 GE HealthCare  28948964
Low binding filter tips  ClearLine
Rnase free tube 1.5 ml  ClearLine 390689DD
Tween 20  Fischer Bioreagent  BP337-500
Cycloheximide  Sigma  C1985
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free  Roche 11836170001

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 103 जाल translatome, भ्रूण अवस्था मांसपेशियों उपप्रकार
की दुर्लभ सेल आबादी से ट्रैप-आर सी, अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण
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Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (103), e52985, doi:10.3791/52985 (2015).

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