Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

TRAP-rc, Sette ribosom Affinitetsrensing fra Rare celle populasjoner av Published: September 10, 2015 doi: 10.3791/52985
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Introduction

Forstå hvordan celler skaffe spesifikke egenskaper under utvikling er avgjørende for å sette pris på kompleksiteten av organer og deres potensial utvikling mot patologiske tilstander. Det er et stort forsknings push for å dechiffrere genet regulatoriske nettverk som underly celle spesifikasjon og differensiering av unrevealing globale genekspresjonsprofiler, Pol II bindende status, transkripsjon-faktor belegg på regulatoriske sekvenser eller post-translasjonelle modifikasjoner av histoner.

For å vurdere genekspresjon på et globalt nivå mikromatriser og RNA-seq tilnærminger brukes. Mikromatriser tillate å detektere mRNA overflod, mens RNA-seq er bedre rustet til å informere om de ulike typene RNA inkludert koding og ikke-kodende RNA som microRNAs, lncRNAs eller snRNAer. Imidlertid kan disse teknikkene ikke skille aktivt transkribert, steady-state mRNA, aktivt-sette mRNA, og mRNA inn i nedbrytingsprosessen. Måling steady-stspiste mRNA-nivåer er kjent for å være et dårlig estimering av proteom- sammensetning 1-3. I motsetning, identifisere aktivt-sette mRNA gir et mer nøyaktig bilde av proteinproduksjon.

Imidlertid har studier transcriptomic hovedsakelig blitt ledet ved hel organismen nivå ved å sammenligne gevinst eller tap av funksjon av en bestemt faktor for villtype tilstand 4-7 eller på dissekert vev, noe som gjør genekspresjonsprofiler vanskelige å tolke. Nylige fremskritt i celle målretting verktøy, affinitetsrensing og sensitivitets forbedringer nå tillate å utføre genome-wide analyser på små cellepopulasjoner eller enkeltceller i en levende organisme.

I Drosophila, store samlinger av transgene linjer aktivere spesifikk tidsmessig og romlig målretting av ulike vev og celle subpopulasjoner via GAL4 / UAS system 8-10 givende mer nøyaktig kvantifisering av de molekylære mekanismene som kreves for celle funksjon.

11. Denne metode basert på sukrose-gradient sentrifugering tillater valg av polysome fraksjon og bestemmelse av mRNA oversettes genom-wide når det analyseres med mikromatriser eller dyp-sekvensering. Polysome isolasjon kan være kombinert med nuklease-behandling for å identifisere ribosomale spor som svarer til RNA-fragmenter beskyttet av ribosomene under oversettelsesprosessen 12. Ribosomalt footprinting øker nøyaktigheten av kvantifisering av RNA oversettelse og RNA-sekvens-nivå oppløsning og ribosom posisjonering, gjør det mulig å måle frekvensen av oversettelse. Men hittil har det ikke blitt anvendt til celle-spesifikk isolering av translatomes, hovedsakelig på grunn av den sterke reduksjon i RNA utbytte oppnådd ved slutten av ribosomet footprinting prosessen. Gitt at valget av RNA størrelse kan generere potensielle falske-positives fra forskjellige RNPs som også kan beskytte RNA på en lignende måte, er ytterligere utvikling for å forbedre ribosomal spor og tilpasse den til celle-spesifikke tilnærminger.

En av slike metoder, kalt Sette ribosom Affinitetsrensing (TRAP) er blitt beskrevet i 2008 av Heiman et al. og anvendt for å isolere translatome fra en undergruppe av nevroner i mus. Av epitop-merkingen ribosomalt protein i en celletype-spesifikk måte, kan polysomes selektivt renses uten arbeidskrevende trinn i celle dissosiasjon og sortering. I dette tilfellet, ble 60S ribosomalt protein L10a på overflaten av ribosomet merket med EGFP 13. Siden 2008 har flere studier brukt denne metoden i ulike arter, fra mus 14-19 til X. laevis 20,21, sebrafisk 22,23 og Arabidopsis thaliana 24. Fellen Metoden har også blitt tilpasset Drosophila modell og brukes til purify celletype-spesifikk mRNA fra nerveceller 25 og 26 astrocytter. Den allsidige binære GAL4 / UAS systemet ble brukt til å uttrykke GFP-merket RpL10A i en vev-spesifikk måte. Hoder av voksne fluer ble dissekert å utføre polysome utvalg fra nerveceller (målrettet av pan-nevrale Elav-Gal4 driver) og isolerte RNA ble sekvensert. Det store antall oppregulert gener som tilsvarte de som er kjent for å bli uttrykt i nervesystemet, noe som indikerer at tilnærmingen har god spesifisitet og spørre oss å tilpasse den til sjeldne cellepopulasjoner (mindre enn 1% av cellene) som er tilstede i utviklings Drosophila embryo .

Innenfor Drosophila modell, er fosterstadiet en modell av valg for studier av utviklingsprosesser, som de molekylære skuespillere og morphogenetic bevegelser er evolusjonært konservert. De eneste vevsspesifikke transcriptomic tilnærminger gjennomført så langt i denne modellen er utført ved hjelp av mobiltelefon eller kjernekraft sårting og har bare vært i stand til å studere steady-state transkriptomet 27-31, skaper et behov for metoder som er dedikert til vev / cellespesifikke translatome profilering i flue embryo. Her rapporterer vi først FELLE protokollen dedikert til Drosophila embryoer. Med denne metoden er engasjert-in-translation mRNA i en meget begrenset cellepopulasjon på rundt 100 muskelceller pr embryo ble vellykket isolert med høy kvalitet og spesifisitet. Den binære GAL4 / UAS systemet brukes til å drive uttrykk for GFP-merket RpL10A i undergruppe av muskler uten toksisitet, ingen åpen fenotyper eller forsinket utvikling som vist tidligere 25. Drosophila embryoer har 30 muskler per hemisegment som vil gi opphav til muskulaturen av larven. Ved hjelp av et regulatorisk område oppdages i nærheten av henge slapt identitet genet, 6 av de 30 flerkjerneinne muskler er målrettet. I denne analysen blir ribosomer immobilisert på mRNA ved hjelp av oversettelses forlengelseinhibitor cycloheximide. Cytosoliske ekstrakter blir så brukt for affinitetsrensing med GFP-antistoff-belagte magnetiske kuler. Kvaliteten på renset RNA ble validert ved hjelp Bioanalyzer. Kvantitativ revers transkripsjon PCR (RT-qPCR) ble anvendt for å bestemme spesifisiteten og sensitiviteten av mRNA isolert og vist at vår optimalisert protokollen er svært effektiv.

Protocol

1. Fly Linje Generation

  1. Generere to forskjellige konstruksjoner. I den første konstruksjonen, er RpL10A cDNA (ribosomalt protein subenhet L10a) klonet nedstrøms GFP inn pUASP-PL-GFP-nter plasmid (modifisert versjon fra 32). Bruken av en germline promoter tillater en mer polyvalent bruk av den transgene linje.
    MERK: Skaff andre konstruere ved å klone regulatorisk sekvens kjører vevsspesifikt uttrykk for slentre genet oppstrøms GAL4 (TF) ved hjelp pPTGAL4 plasmid.
  2. Injisere plasmider separat i w 1118 fluer og sett konstruksjoner i fly genomet ved P-element innsetting (i henhold til standard prosedyre) 33.
  3. Velg trans for å gjenopprette snører med konstruksjoner på to forskjellige kromosomer. Den endelige TRAP linjen er laget ved å kombinere disse to linjer (genetiske kryss) for å oppnå en dobbel-stabil transgen linje. F0: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx W-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massivt forsterke denne linjen og samle ønsket-iscenesatt embryoer.

2. Embryo Collection

  1. Forbered 8 store sylindriske befolknings merder med rundt 40 g av unge fluer per bur (rundt 180 000 fluer / bur).
  2. Fortsett med såkalte pre-Lays som gjør at fluene å fjerne utviklings embryoer fra sine oviduktene. For det, lå fluene for en time på to 11 cm diameter petriskåler som inneholder en blanding av størknet agar og druejuice og dekker ⅓ av overflaten med nylaget gjær lime. Etter 3 utveksling av druesaft plater samle de virkelige embryoer på lignende ferske plater.
    MERK: Inkubasjonstid vil variere i forhold til utviklingstidsvinduet studert.
  3. Fjerne platene fra burene og la dem ved den samme temperatur i den tid som er nødvendig for å oppnå riktig utviklingsstadiet (for eksempel 3 timer av egglegging + 10 h additional inkubasjon gir embryoer fra scenen 10-13 hr Etter egglegging (AEL)). Suspendere plate innhold (embryo, gjær lime, døde fluer) med 50 ml vann ved hjelp av en børste.
  4. Gå gjennom en serie sikter (700 um, 355 um, 112 um) for å skille embryoer fra døde fluer og øvrige kroppsdeler og samle embryoer beholdt på den mindre diameter sil, vask deretter raskt i avionisert vann. Ikke bruk mer enn 18 plater per samling som det kan tette de sikter.
  5. Dechorionate embryoene i 4,5% blekemiddel i avionisert vann i 2 min og skyll grundig med avionisert vann i 30-60 sekunder. Inkuber embryoene i PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml sykloheksimid, i 5-10 minutter ved RT under omrøring.
  6. Tørre embryoer på cellulose absorberende ark og overføre dem til mikrosentrifugerør. Vei rørene og flash-fryse embryoene ved nedsenkning i flytende nitrogen. På dette stadiet, kan de tørkede embryo lagres i flere måneder ved -80 ° C.
  1. Grundig suspendere Protein G magnetiske kuler i den opprinnelige flasken ved forsiktig risting.
  2. Overføring 90 mL av perler på en RNase-free tube og samle dem på en magnet (30-60 sek). 90 ul av perler er nødvendig for å utføre immunutfelling (IP) med 1 ml lysat som inneholdt 60-80 mg / ml proteiner. Respekter forholdstall for å hindre perle metning. Bruk flere rør i henhold til protein beløp.
  3. Vask perler med 1 x PBS 0,01% Tween 20 (500 mL) og samle perler på magneten å forkaste supernatant. Tilsett 30 ug av GFP-antistoff i 350 ul PBS 0,01% Tween 20 og kulene og inkuber med sakte ende-over-end blanding i 30 min ved RT.
  4. Samle perler på magneten (30-60 sek), kast supernatant og skyll i 500 mL av polysome ekstraksjon buffer (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, 0,5 mM DTT, 1% Triton, cykloheksimid 100 pg / ml , Protease inhibitor 1 ×, RNase inhibitor 100 U).
  5. Samle perler på magneten og tilsett 500 mL av blokkering buffer (BSA 0,1 ug / ul, gjær tRNA 0,1 mikrogram / mikroliter, glykogen 0,1 ug / ul i polysome utvinning buffer).
  6. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur og gjenta dette trinnet en gang med frisk blokkerende buffer.
  7. Samle perler på magneten og skyll i 500 mL av polysome utvinning buffer, så minnes perler og fortsett umiddelbart til immunorensing trinn (§ 6).

4. Lysate Forberedelse

  1. Før du starter, sette opp programmet på multi-directional rask hastighet perler kvern: 2 × 10 sek ved 5000 rpm, 15 sek pause. Overførings tørket embryoer (1,5 g) til 15 ml forhåndsavkjølt rør på is inneholdende polysome ekstraksjon buffer, og homogenisere umiddelbart. Homogen 1,5 g av embryoer i 4 ml polysome ekstraksjonsbuffer.
  2. Spredt homogenisert embryoer i to forhåndsavkjølt 2 ml rør og male Embryos ved å kjøre homogenisatoren program. Overfør lysatet til friske forhåndsavkjølt mikrosentrifugerør på is og forberede en postnuclear supernatant ved sentrifugering ved 4 ° C i 10 minutter ved 2000 g.
  3. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør forhåndsavkjølt på is, tilsett 1/100 prøvevolum på 10% Nonidet P-40 til den overliggende væske (endelig konsentrasjon = 0,1%), og bland forsiktig ved å vende røret.
  4. Puls-sentrifuge prøven i en minifuge for å samle opp væsken ved bunnen av røret, tilsett 1/9 prøvevolum på 300 mM 1,2-DIHEPTANOYL-sn-glysero-3-fosfokolin (DHPC) (sluttkonsentrasjon = 30 mM ), bland forsiktig ved å vende røret, og inkubere blandingen på is i 5 min (blanding ved å snu flere ganger under inkubasjon).
  5. Klargjør postmitokondriske supernatant ved sentrifugering ved 4 ° C i 10 minutter ved 20 000 g. Måle proteinkonsentrasjon ved hjelp av Bradford-metoden: konsentrasjon i lysatet bør være mellom 60-80 mg / ml. TÅke supernatanten til en frisk ny forhåndsavkjølt mikrosentrifugerør og fortsette umiddelbart til pre-absorpsjon trinn (§ 5).

5. Pre-absorpsjon

  1. Grundig resuspender magnetiske kuler ved forsiktig omrøring og overføre 30 ul av perler inn i et mikrosentrifugerør ved romtemperatur (30 pl av perler / 1 ml embryonale lysat).
  2. Samle perler på magneten, pipette av supernatant og resuspender perler i polysome ekstraksjon buffer (500 pl). Samle perler på magneten, tilsett embryonale lysat, og inkuberes i en time ved 4 ° C på en rotator.
    1. Fjerne kulene og holde supernatant på is for immunorensing trinnet. Før immunorensing, holde 100 ul supernatant (input) for å sammenligne global RNA prøven med RNA prøven samles etter immunorensing, ved RT-qPCR for eksempel.

6. immunorensing

  1. Tilsett 1 ml (svarende til 60-80 mg / ml protein) ipre-absorbert-lysat til en RNase-frie rør inneholdende 90 ul av blokkerte perler koblet til GFP antistoff. Prøvene inkuberes ved 4 ° C i 2 timer med forsiktig ende-over-ende-blanding i et rør rotator. Alternativt utføre inkubasjon O / N ved 4 ° C.
  2. Etter inkubering, samle perler på magneten. Bruk en minifuge å spinne ned kulene, og deretter resuspender dem i 500 ul vaskebuffer (Hepes 10 mM, KCl 350mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1% DTT 0,5 mM, cykloheksimid 100 ug / ml, RNase inhibitor 100 U ) og samle dem på magneten. Gjenta dette trinnet to ganger til.
  3. Bytt perlene til en ny forhåndsavkjølt RNase-frie rør og vask to ganger. Samle perler på en magnet, og fortsett til RNA ekstraksjon ved å tilsette 1 ml TRIzol direkte til perlene og følg produsentens anvisninger.

7. RNA Clean-up og kvalitetsvurdering

  1. Bruk en RNeasy Micro Kit i henhold til produsentens anvisninger. Ved ferdigstillelse, Elute RNA med (x) ul RNase-fritt vann. Varm i 2 minutter ved 60 ° C, og lagre snap-frosne prøver ved -80 ° C. Sjekk RNA kvalitet ved hjelp Bioanalyzer (følg produsentens anvisninger).
  2. For å teste spesifisitet av traped RNA, utføre revers transkripsjon på 3 ng av renset RNA (input og IP) i henhold til produsentens instruksjoner (hevet III). Bruk cDNA oppnådd for qPCR ved hjelp av genspesifikke primersettene.

Representative Results

Drosophila embryonale somatiske muskel-systemet består av 30 muskler per hemisegment, og hver muskel har et bestemt sett med egenskaper: code of identitets gener, stilling, antall fusjonsbegivenheter, festeplasser og innervasjon. Identifisere oversatt mRNA i en spesifikk muskel undergruppe vil gi informasjon om de proteiner som kreves for å danne disse spesifikke muskel egenskaper. Ved hjelp av TRAP-baserte metode, RNA fra en subpopulasjon av muskler som uttrykker genet henge slapt identitet ble renset (figur 1A-B). Et stort problem med denne tilnærmingen er kvaliteten og spesifisitet av det isolerte RNA. Den optimaliserte protokollen angitt her aktivert systematisk utvinning av høy kvalitet RNA vurderes med Bioanalyzer analyse. Profil innhentet viser ingen degradering av RNA (figur 1C).

I andre studier utviklet rundt TRAP-metoden ble det stilt spørsmål over spesifisiteten av dataene. Her er vi improve metode for å undertrykke bakgrunns knyttet til ikke-spesifikk binding av RNA til kulene eller rørene, og ved optimalisering av vaskebufferen. For å kunne vurdere bakgrunnsnivået, og effektiviteten av isolering slouch-uttrykkende celler, førte vi RT-qPCR forsøk på 3 replikater av den samme fosterstadiet. Brett-enrichments av 4 forskjellige gener (mef2, slentre, Prospero, soxNeuro) ble beregnet i forhold til innspill og normalisert mot RpL32 genet (figur 1D). Resultatene viste 2,3 ganger berikelse av pan-muskulære genet mef2 og 5,6 ganger anrikning av slentre genet. I motsetning til dette, ble de to gener uttrykt i nervesystemet utarmet i forhold til inngangen. Svært like fold endre verdier ble observert på 3 biologiske replikater, viser at protokollen er robust. Med Slouch-Gal4 driver og starter med 1,5 g, rundt 1.5x10 ^ 6 befruktede egg ble hentet som inneholder 100 GFP celler / embryo (totalt 150 × 10 ^ 6 positiveceller).

Etter å ha kjørt FELLE eksperimentet, er avkastningen rundt 25-45 ng av spesifikt RNA avhengig av stadium-of-interesse. Dette materialet er nok til å kjøre microarray analyse eller RNA-seq bruker en forsterkning protokollen til å bygge en RNA-seq bibliotek. Effektivitet vil avhenge sterkt av styrken av driveren som brukes for å uttrykke RpL10A-EGFP.

Figur 1
Figur 1. Kvalitet og spesifisitet vurdering av TRAP-isolert RNA fra Slouch-GAL4> UASRpL10A-EGFP embryoer.

(AB) konfokale bilder av en scene-16 embryo som viser RpL10A-EGFP ekspresjon spesifikt i de seks Slouch muskelceller pr hemisegment (A). Samlokalisering av RpL10A-EGFP med generell muskel markør Beta3tubulin er observert på merge bilde (B). (C) Kvalitetskontroll av traped RNA ran på Bioanalyzer viser perfekt integritet rRNA 18S og 28S. (D) RT-qPCR analyse som viser høy spesifisitet trap-isolert mRNA eksperimenter på 3 biologiske replikater av scene-16 embryoer. Brett endringen er beregnet i forhold til innspill og normalisert mot RpL32 genet. Mef2 transkripsjoner stede i alle muskel linjene er 2,3 ganger beriket forhold til innspill mens mer begrensede slouch transkripsjoner er 5,6-fold-beriket. Neuralceller uttrykker Prospero og soxN gener er oppbrukt 2,2 ganger og 5,5 ganger hhv. Feilfelt representerer standardavvik (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette notatet beskriver en modifisert Sette ribosom Affinitetsrensing protokoll (kalt 'TRAP-rc') dedikert til studiet av sjeldne celle populasjoner i Drosophila embryoer. Det gis informasjon om de viktigste trinnene for vellykket isolering av spesifikke RNA med en yield egnet for microarray eller RNA-seq analyse, dvs. 1) mengden av biologisk materiale som kreves og optimalisert prosedyre for embryo lyse og polysome utvinning; 2) perler / antistoff-til-lysat-forhold for optimal immunpresipitering; 3) trinn som tillater reduksjon av bakgrunnen inkludert vaskebuffer sammensetning, slik som å kjøre TRAP-rc eksperimenter med høy spesifisitet og sensitivitet.

Denne protokollen gir reproduserbare data som gjør det lett anvendes på andre celletyper. Denne teknikken gjør det mulig å analysere differensial genekspresjon på nivå med aktivt-sette mRNA og derved legge forholdene til rette for å forstå protein ekspresjon i en spec ific celletype på et bestemt tidsvindu. Merk imidlertid at protein mengde vil avhenge av graden av omregnings og nedbrytningsprosesser. En vesentlig begrensning av TRAP-metoden er dens manglende evne til å måle proteininnholdet i en nøyaktig kvantitativ måte, eller for å detektere post-translasjonell modifikasjon. Forbedring av kvantifisering ved å måle ribosom tetthet langs mRNA legemet og ved å gjøre dette, i en celletype-spesifikk måte kan foreta TRAP kombinert med ribosom footprinting et meget kraftig verktøy. I en nyere artikkel 34, ble denne kombinasjonen utført i humane embryonale nyre 293 celler. Forfatterne kjørte nuclease footprinting fulgt av affinitetsrensing av en induserbar biotinylated form av RpL10A bruker streptavidin perler. Dette er et bevis på prinsippet om at det er mulig å utføre ribosom spor i en hel organisme mens rettet mot en bestemt celletype, den begrensning er mengden av biologisk materiale som kreves for formålet.

"> Performing TRAP eksperimenter parallelt med globale transcriptomic analyser vil gjøre det mulig å spore proporsjoner mellom nylig transkribert og actively- sette RNA. Dette vil være dypt informative av de potensielle post-transkripsjonelle mekanismer som finner sted i spesifikke utviklings sammenhenger eller spesifikke cellepopulasjoner -Ved microRNAs for eksempel.

I konklusjonen, er TRAP en svært effektiv, spesifikk og sensitiv metode for å identifisere RNA bundet til aktivt-sette ribosomer i en celle-spesifikk måte. Denne metoden kan brukes i en rekke forskjellige organismer og vevstyper. Den nye TRAP-rc-protokollen beskrevet her var optimalisert for sjeldne celle populasjoner (mindre enn 1% av total celle nummer) og for en mengde endelige materialet tilstrekkelig for senere analyser på hel-genom nivå.

En mulig begrensning ved denne metode er kravet til en sterk driver for å fremstille merkede ribosomer i tilstrekkelig mengde til å compete med endogene umerkede de i målrettede celletype. I en fersk undersøkelse 25, forfattere estimert til 10-30% av forholdet mellom merket versus umerkede ribosomer.

For å bøte på dette problemet øker UAS-RpL10A-EGFP kopiantallet bør betraktelig bedre denne balansen. Alternativt vil legge til den beskrevne genetisk bakgrunn et UAS-GAL4 transgenet forsterke produksjonen av GAL4-proteinet og indirekte øke ekspresjonen av RpL10A-EGFP. Dette bør favorisere et bedre belegg på merket ribosomer på mRNA.

Legg merke til at dette allerede effektiv tilnærming kan gjøres enda kraftigere ved å tilpasse komplementære metoder for å bringe en mer kvantitativ aspekt eller å oppdage og løse molekylære mekanismer som er avgjørende for genekspresjon kontroll.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma  H4034-1006
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine  Avanti Polar Lipids 850306P
Glycogen thermo scientific  R0561
Purified BSA 100X  Biolabs B9001
Yeast tRNA  Sigma R5636
Super RNase In  Ambion AM2694
Antibody GFP clone N86/38 UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated 75-132 
Nonidet P40  Roche 11754595001
Precellys 24 Lysis homogenisation  Bertin Technology
Nuclease free water  Nalgene
Dynabeads ProteinG Invitrogen 10004D
Potassium chloride (KCl) Applied Biosystem  AM96406
Magnesium Chloride (MgCl2)  Applied Biosystem  AM95306
Cellulose waddin unbleached  VWR 115-2597 
Sieves 112, 355, 710 um  Retsch
TRiZol  Invitrogen 15596-018
MagRack 6 GE HealthCare  28948964
Low binding filter tips  ClearLine
Rnase free tube 1.5 ml  ClearLine 390689DD
Tween 20  Fischer Bioreagent  BP337-500
Cycloheximide  Sigma  C1985
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free  Roche 11836170001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
  2. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
  3. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
  4. Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
  5. Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
  6. Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).
  7. Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
  9. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
  10. Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
  11. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  12. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
  13. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  14. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
  15. Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
  16. Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605 (2011).
  17. Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965 (2012).
  18. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  19. Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).
  20. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  21. Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
  22. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
  23. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
  24. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419 (2010).
  25. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276 (2012).
  26. Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
  27. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
  28. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
  29. Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
  30. Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
  31. Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
  32. Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
  33. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  34. Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).

Tags

Molecular Biology TRAP translatome, Fosterstadiet muskel subtyper
TRAP-rc, Sette ribosom Affinitetsrensing fra Rare celle populasjoner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., … More

Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (103), e52985, doi:10.3791/52985 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter