Introduction
Zu verstehen, wie Zellen während der Entwicklung bestimmte Eigenschaften zu erwerben, ist, um die Komplexität der Organe und deren potenzielle Entwicklung hin zu pathologischen Bedingungen zu schätzen wissen von entscheidender Bedeutung. Es gibt einen großen Forschungs Push, um die Gen-regulatorischen Netzwerke, die das Zell Spezifizierung und Differenzierung zugrunde liegen durch unrevealing globalen Genexpressionsprofile zu entziffern, Pol II bindenden Status, Transkriptionsfaktor-Belegung am regulatorischen Sequenzen bzw. post-translationale Modifikationen von Histonen.
Um die Genexpression auf globaler Ebene Microarrays zu bewerten und RNA-seq Ansätze verwendet. Microarrays erlauben, mRNA-Häufigkeit zu erkennen, während RNA-seq ist besser auf die Information über die verschiedenen Arten von RNAs einschließlich codierenden und nichtcodierenden RNAs wie microRNAs, lncRNAs oder snRNAs. Jedoch können diese Techniken nicht zu unterscheiden aktiv transkribierten, stationären mRNA aktiv umsetze mRNA und mRNA in die Abbauprozess. Mess stationären staß mRNA-Spiegel ist bekannt, dass eine schlechte Schätzung des Proteoms Zusammensetzung 1-3 sein. Im Gegenteil, die Identifizierung aktiv-Übersetzung von mRNA ergibt ein genaueres Bild der Proteinproduktion.
Allerdings transkriptomischen Studien vor allem auf ganze Organismus Ebene durch den Vergleich Gewinn oder Verlust der Funktion eines bestimmten Faktor zu Wildtyp-Zustand 4-7 oder seziert Gewebe, so dass Genexpressionsprofile schwer zu interpretieren geführt worden. Jüngste Fortschritte in der Zell-Targeting-Tools, Affinitätsreinigung und Empfindlichkeit Verbesserungen erlauben jetzt ausführen genomweiten Analysen zu kleinen Zellpopulationen oder sogar einzelne Zellen in einem lebenden Organismus.
In Drosophila, große Sammlungen von transgenen Linien ermöglichen es, bestimmte zeitliche und räumliche Ausrichtung der verschiedenen Geweben und Zellpopulationen über den GAL4 / UAS-System 8-10 wodurch genauere Quantifizierung der molekularen Mechanismen für die Zellfunktion notwendig.
11 beschrieben. Diese Methode basiert auf Sucrosegradientenzentrifugation ermöglicht die Auswahl der Polysomen-Fraktion und Bestimmung von mRNA übersetzt genomweite, wenn sie mit Microarrays oder tiefe Sequenzierung analysiert. Polysom Isolation kann mit Nucleaseverdau um ribosomale Fußabdrücke entsprechenden RNA-Fragmente durch die Ribosomen während des Übersetzungsprozesses 12 geschützt identifizieren gekoppelt werden. Ribosomalen Footprinting erhöht die Genauigkeit der Quantifizierung der RNA-Translation und RNA-Sequenzlevel Auflösung und Ribosom Positionierung ermöglicht es, Translationsrate zu messen. Jedoch ist es bis heute nicht zellspezifische Isolierung translatomes aufgebracht worden ist, vor allem aufgrund der starken Abnahme der RNA-Ausbeute am Ende des Ribosoms Footprinting Verfahren erhalten. Da die Größenauswahl der RNA kann potenzielle Falsch p zu erzeugenositives aus verschiedenen RNPs, die auch sein könnte Schutz RNA auf ähnliche Weise werden weitere Entwicklungen notwendig, um ribosomale Fußabdruck zu verbessern und ihre Anpassung an zellspezifische Ansätze.
Eines dieser Verfahren, die so genannte Translating Ribosom Affinitätsreinigung (TRAP) wurde im Jahr 2008 von Heiman et al. und auf die translatome aus einer Untergruppe von Neuronen bei Mäusen zu isolieren. Durch Epitop-Markierung des ribosomalen Proteins in einem zelltypspezifischen Weise kann Polysomen selektiv ohne den mühsamen Schritt der Zelldissoziation und Sortierung gereinigt werden. In diesem Fall wurde die 60S ribosomale Protein L10a an der Oberfläche des Ribosoms mit eGFP 13 markiert. Seit 2008 haben mehrere Studien diese Methode in verschiedenen Arten verwendet werden, die von Mäusen 14-19 bis X laevis 20,21, Zebrafisch 22,23 und Arabidopsis thaliana 24. Die TRAP-Methode wurde auch auf die Drosophila-Modell angepasst und verwendet nach Purify Zelltyp-spezifischen mRNAs von neuronalen Zellen 25 und 26 Astrozyten. Die vielseitige binären GAL4 / UAS-System wurde verwendet, um die GFP-markierten RpL10A in einer gewebespezifischen Weise exprimieren. Leiter der erwachsenen Fliegen wurden seziert, um Polysom Auswahl aus neuronalen Zellen (von pan-neuronalen Elav-Gal4-Treiber gezielte) und isolierten RNAs durchzuführen, wurden sequenziert. Die große Zahl der hochregulierten Genen entsprachen denen bekannt ist, im Nervensystem exprimiert werden, was darauf hinweist, dass der Ansatz eine gute Spezifität und uns eingibt, um es in seltenen Zellpopulationen anzupassen (weniger als 1% der Zellen) vorhanden entwickeln Drosophila-Embryonen .
Innerhalb der Drosophila-Modell ist das Embryonalstadium ein Modell der Wahl für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, wie die molekularen Akteure und Gestaltungsbewegungen sind evolutionär konserviert. Die einzigen Gewebe-spezifische transkriptomischen Ansätze bisher in diesem Modell durchgeführt wurden unter Verwendung von Zellen oder Kern sorting und haben nur einen stabilen Zustand für Transkriptom 27-31 Studie nachgewiesen, wodurch ein Bedarf für Verfahren, um Gewebe / Zell-spezifische translatome Profilierungsfliegenembryo gewidmet. Hier haben wir die erste TRAP-Protokoll, um Drosophila-Embryos gewidmet melden. Mit diesem Verfahren Eingriff-in-Übersetzung mRNA in einer sehr begrenzten Zellpopulation von etwa 100 Muskelzellen pro Embryo wurde erfolgreich mit hoher Qualität und Spezifität isoliert. Der binäre GAL4 / UAS-System wird verwendet, um die Expression von GFP-markierten RpL10A in Subpopulation von Muskeln ohne Toxizität zu fahren, da keine scheinbare Phänotypen oder Entwicklungsverzögerung zuvor. 25 gezeigt Drosophila-Embryos besitzen 30 Muskeln pro hemisegment, die Anlass zu der Muskulatur geben der Larve. Durch Verwendung einer regulatorischen Region in der Nähe der Niete Identität Gen entdeckt, 6 der 30 mehrkernigen Muskeln, werden angezeigt. In diesem Test werden die Ribosomen auf der mRNA unter Verwendung des immobilisierten TranslationselongationInhibitor Cycloheximid. Cytosolische Extrakte werden dann zur Affinitätsreinigung mit GFP Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen verwendet. Qualität der gereinigten RNA wurde unter Verwendung Bioanalyzer validiert. Quantitative reverse Transkriptions-PCR (RT-qPCR) wurde verwendet, um die Spezifität und Empfindlichkeit der Isolierung der mRNA zu bestimmen, und gezeigt, dass unsere verbesserte Protokoll ist sehr effizient.
Protocol
1. Fliegenschnur Erstellung
- Generieren Sie zwei verschiedene Konstrukte. In dem ersten Konstrukt wird RpL10A cDNA (ribosomale Protein-Untereinheit L10a) stromabwärts von GFP kloniert in pUASP-PL-GFP-Nter Plasmid (modifizierte Version von 32). Die Verwendung einer Keimbahn-Promotor erlaubt eine polyvalente Nutzung der transgenen Linie.
ANMERKUNG: Beziehen Sie das zweite Konstrukt durch Klonierung des regulatorischen Sequenz Fahrgewebespezifische Expression des slouch Gen stromaufwärts von GAL4 (TF) mit pPTGAL4 Plasmid. - Injizieren Plasmide getrennt in w 1118 Fliegen und legen Konstrukte in-the-fly-Genom durch P-Element-Insertion (nach Standard-Verfahren) 33.
- Wählen Sie Trans um Fliegenlinien mit Konstrukten auf zwei verschiedenen Chromosomen erholen. Die endgültige TRAP Linie wird durch die Kombination dieser beiden Linien (genetische Kreuze), um ein Doppel-transgenen stabile Linie zu bekommen erstellt. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massiv verstärken diese Linie und sammeln Sie die gewünschten inszeniert Embryonen.
2. Embryonen
- Bereiten Sie 8 große zylindrische Bevölkerung Käfige mit jeweils etwa 40 g junger Fliegen pro Käfig (rund 180.000 Fliegen / Käfig).
- Fahren Sie mit dem so genannten Pre-Lays, die Fliegen zu entwickelnden Embryonen aus ihren Eileitern löschen lassen. Dafür lag die Fliegen für 1 Stunde auf zwei 11 cm-Durchmesser Petrischalen, die eine Mischung aus erstarrtem Agar und Traubensaft und decken ⅓ der Oberfläche mit frisch zubereiteten Hefepaste. Nach 3 Austausch von Traubensaft Platten sammeln die realen Embryos auf ähnliche frisch zubereiteten Platten.
Hinweis: Die Inkubationszeit wird nach Entwicklungszeitfenster untersucht variieren. - Platten entfernen von Käfigen und lassen Sie sie bei der gleichen Temperatur für den Zeitaufwand für die richtige Entwicklungsstufe (zB 3 Stunden der Eiablage + 10 h addit erhaltenional Inkubation erhält man Embryonen aus Stadium 10 bis 13 Stunden nach der Eiablage (AEL)). Resuspendieren Platte Inhalt (Embryonen, Hefepaste, tote Fliegen) mit 50 ml Wasser mit einer Bürste.
- Gehen durch eine Reihe von Sieben (700 & mgr; m, 355 & mgr; m, 112 & mgr; m) Embryonen aus toten Fliegen und restlichen Körperteilen zu trennen und sammeln Embryonen auf dem kleinerem Durchmesser Sieb zurückgehalten, dann kurz waschen in VE-Wasser. Verwenden Sie nicht mehr als 18 Platten pro Sammlung, wie es die Siebe verstopfen.
- Dechorionate Embryonen in 4,5% Bleichmittel in VE-Wasser für 2 Minuten und gründlich mit VE-Wasser für 30-60 Sekunden. Inkubieren Embryonen in PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml Cycloheximid für 5-10 min bei RT unter Rühren.
- Trockener Embryonen auf Celluloseabsorptionslagen und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen. Wiegen Sie die Rohre und Flash-Einfrieren der Embryonen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff. In diesem Stadium können die getrockneten Embryonen für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden.
- Gründlich resuspendieren Protein G magnetischen Kügelchen in der Originalflasche durch leichtes Schütteln.
- Transfer 90 ul von Perlen auf ein RNase-freies Rohr und sammeln sie auf einem Magneten (30-60 sec). 90 ul Perlen notwendig ist, Immunpräzipitation (IP) mit 1 ml Lysat, 60-80 mg / mL Proteine führen. Respektieren Verhältnisse zu Wulst Sättigung zu verhindern. Verwenden mehrere Rohre nach Proteinmenge.
- Wash Perlen mit 1 x PBS 0,01% Tween 20 (500 ul) und sammeln Perlen auf dem Magneten, um Überstand verwerfen. Werden 30 ug des GFP-Antikörper in 350 ul PBS 0,01% Tween 20 auf die Kügelchen und Inkubation bei langsamen Kopfüber-Mischung für 30 min bei RT.
- Sammeln Perlen auf dem Magneten (30-60 sec), Überstand verwerfen und gründlich in 500 ul Extraktionspuffer Polysomen (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl 2 5 mM, DTT 0,5 mM Triton 1%, Cycloheximid 100 ug / ml , Protease Inhibitor 1 ×, RNase-Inhibitor 100 U).
- Sammle Perlen auf dem Magneten und fügen Sie 500 ul Blockierungspuffer (BSA 0,1 ug / ul, Hefe-tRNA 0,1 ug / ul, Glykogen 0,1 ug / ul in Polysom Extraktionspuffer).
- Inkubation für 30 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Blockierungspuffer.
- Sammle Perlen auf dem Magneten und spülen in 500 ul Polysom Extraktionspuffer, dann erinnern Perlen und gehen sofort in den Immun Schritt (Abschnitt 6).
4. Lysatherstellung
- Bevor Sie beginnen, das Programm einzurichten auf der multidirektionale schnelle Geschwindigkeit Perlen Grinder: 2 x 10 sec bei 5000 Umdrehungen pro Minute, 15 Sekunden Pause. Transfer getrockneten Embryonen (1,5 g), um 15 ml Röhrchen auf Eis enthält Polysom Extraktionspuffer vorgekühlt, und homogenisieren sofort. Homogenisieren 1,5 g Embryonen in 4 ml Extraktionspuffer Polysomen.
- Spread homogenisiert Embryonen in zwei vorgekühlt 2 ml-Röhrchen und schleifen die embryos, indem Sie den Homogenisator Programm. Übertragen Sie das Lysat in frische vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und bereiten eine postnukleäre Stand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 2000 g.
- Überstand in ein frisches vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, fügen 1/100 Probenvolumen von 10% Nonidet P-40 zu dem Überstand (Endkonzentration = 0,1%), und mischen Sie sie vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens.
- Puls Zentrifuge die Probe in einer Minifuge um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln, fügen 1/9 Probenvolumen von 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (DHPC) (Endkonzentration = 30 mM ), mischen Sie es vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens, und Inkubation der Mischung auf Eis für 5 min (Mischung durch mehrmaliges Wenden während der Inkubation).
- Vorbereitung der post-mitochondrialer Überstand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 Minuten bei 20.000 g. Messung der Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode: Konzentration im Lysat sollte zwischen 60-80 mg / ml sein. Take den Überstand in ein frisches neues vorgekühltem Mikrozentrifugenröhrchen und gehen sofort in den Pre-Absorptionsstufe (Abschnitt 5).
5. Pre-Absorption
- Die Magnetperlen gründlich durch vorsichtiges Schütteln resuspendieren und Transfer 30 ul Kügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur (30 & mgr; l Perlen / 1 ml embryonalen Lysat).
- Sammle Perlen auf dem Magneten, einer Pipette aus dem Überstand und resuspendieren die Perlen in Polysom Extraktionspuffer (500 ul). Sammle Perlen auf dem Magneten, fügen embryonalen Lysat, und Inkubation für 1 h bei 4 ° C auf einem Rotator.
- Perlen bringen und Überstand auf Eis zur Immun Schritt. Vor Immun, halten 100 ul Überstand (Eingang) zur globalen RNA-Probe mit der RNA-Probe, nachdem Immun gesammelt, durch RT-qPCR zum Beispiel zu vergleichen.
6. Immunreinigung
- 1 ml (entspricht 60-80 mg / ml Protein)pre-absorbiert Lysats auf ein RNase-freies Röhrchen mit 90 ul blockierter Perlen GFP-Antikörper gekoppelt ist. Inkubieren der Proben bei 4 ° C für 2 Stunden unter leichtem end-over-end Mischen in einem Rohrdrehgelenk. Alternativ führen die Inkubation O / N bei 4 ° C.
- Nach der Inkubation, sammeln Perlen auf dem Magneten. Verwenden Sie einen Minifuge sich zu drehen, die Perlen, so resuspendieren sie in 500 ul Waschpuffer (Hepes 10 mM, KCl 350mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1% DTT 0,5 mM, Cycloheximid 100 ug / ml, RNase-Inhibitor 100 U ) und sammeln sie auf dem Magneten. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal.
- Ändern Sie die Perlen auf eine neue vorgekühltem RNase-freies Rohr und zwei Mal waschen. Sammle Perlen auf einem Magneten und zur RNA-Extraktion durch Zugabe von 1 ml Trizol direkt an die Beads und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
7. RNA Sanierung und Qualitätsbewertung
- Verwenden Sie eine RNeasy Micro Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Bei Fertigstellung Elute-RNA mit (x) & mgr; l RNase-freies Wasser. Warm für 2 min bei 60 ° C, und speichern schockgefroren Proben bei -80 ° C. Überprüfen RNA-Qualität mit Bioanalyzer (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers).
- Um die Spezifität des Traped RNA zu testen, führen die reverse Transkription von 3 ng gereinigte RNA (Ein- und IP) nach den Anweisungen des Herstellers (hochgestellte III). Verwenden Sie das für die qPCR mit Gen-spezifischen Primer-Sets erhalten cDNA.
Representative Results
Die Drosophila embryonalen somatischen Muskulatur wird von 30 Muskeln pro hemisegment zusammengesetzt, und jeder Muskel hat einen bestimmten Satz von Eigenschaften: Codeidentitätsgene, Position, Anzahl der Fusionsereignisse, Befestigungsstellen und Innervation. Identifizieren übersetzt mRNA in einer bestimmten Muskeluntergruppe geben Informationen über die erforderlich ist, um diese spezifische Muskel Eigenschaften bilden Proteine. Verwenden des TRAP-basierte Verfahren, RNA aus einer Subpopulation von Muskeln, die Identität Gen slouch exprimiert, wurde gereinigt (1A-B). Ein wichtiges Anliegen für diesen Ansatz ist die Qualität und die Spezifität der isolierten RNA. Die optimierte Protokoll hier berichteten aktiviert systematische Verwertung von hochwertigen RNA mit Bioanalyzer-Analyse beurteilt. Die erhaltenen Profil zeigt keinen Abbau von RNA (Abbildung 1c).
In anderen Studien in der Trap-Verfahren entwickelt wurden Fragen über die Spezifität der Daten erhöht. Here we imü ssen die Methode zum Hintergrund nicht-spezifischer Bindung der RNA an die Kügelchen oder die Rohre und durch die Optimierung des Waschpuffers verbunden drücken. Um die Hintergrundebene und Effizienz der Isolierung slouch-exprimierenden Zellen zu bewerten, führten wir RT-qPCR-Studien auf 3 Wiederholungen des gleichen embryonalen Stadium. Fold-Anreicherungen von 4 verschiedenen Genen (MEF2, slouch, Prospero, soxNeuro) wurden im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gen (1D) berechnet. Diese Ergebnisse zeigten, 2,3-fache Anreicherung der pan-Muskelgens MEF2 und 5,6-fache Anreicherung der slouch Gens. Dagegen sind die beiden Gene in das Nervensystem exprimiert wurden, verglichen mit abgereichertem Eingang. Sehr ähnlich fache Änderung Werte wurden auf 3 biologischen Replikaten beobachtet, was zeigt, dass das Protokoll ist robust. Mit Slouch-Gal4-Treiber und ausgehend von 1,5 g, rund 1,5x10 ^ 6 Embryonen wurden gewonnen, die 100 GFP Zellen / Embryos (insgesamt 150 x 10 ^ 6 positive enthaltenZellen).
Nach dem Ausführen des TRAP Experiment ist die Ausbeute in der Umgebung von 25 bis 45 ng spezifische RNA je auf der Bühne von Interesse. Dieses Material ist genug, um Microarray-Analyse oder RNA-seq Verwendung eines Amplifikationsprotokoll um ein RNA-seq-Bibliothek zu erstellen ausführen. Effizienz wird stark von der Stärke der verwendet wird, um RpL10A-EGFP exprimieren Treiber abhängen.
Abbildung 1. Qualität und Spezifität Beurteilung der TRAP-isolierte RNA aus Slouch-GAL4> UASRpL10A-EGFP Embryonen.
(AB) Konfokale Bilder von einem Stadium 16-Embryo, welches RpL10A-EGFP-Expression spezifisch in den sechs Slouch Muskelzellen pro hemisegment (A). Co-Lokalisation von RpL10A-EGFP mit dem allgemeinen Muskelmarkierung Beta3tubulin auf Merge-Bild (B) beobachtet. (C) Qualitätskontrolle von RNA Traped ran auf Bioanalyzer zeigt perfekte Integrität rRNA 18S und 28S. (D) RT-qPCR-Analyse, die hohe Spezifität der TRAP-isolierte mRNA Experimente an biologischen 3 Wiederholungen der Stufe-16-Embryonen. Falten Änderung im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gens berechnet. In allen Muskelabstammungslinien vorhanden MEF2 Transkripte sind 2,3-fach angereicherte im Vergleich zum Eingang der Erwägung, dass mehr eingeschränkt slouch Transkripte sind 5,6-fach angereicherte. Nervenzellen prospero ausdrücken und soxN Gene sind erschöpft 2,2-fach und 5,5-fach auf. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Dieses Papier beschreibt eine modifizierte Translating Ribosom Affinitätsreinigung Protokoll (genannt "TRAP-rc ') auf die Untersuchung von seltenen Zellpopulationen in Drosophila-Embryos gewidmet. Informationen über die wesentlichen Schritte für eine erfolgreiche Isolierung von spezifischen RNA mit einer Ausbeute geeignet für Microarray-oder RNA-seq-Analyse, dh 1) Menge an biologischem Material erforderlich ist und optimierte Verfahren für die Embryo-Lyse und Polysom Extraktion bereitgestellt; 2) Perlen / Antikörper-to-Lysat Verhältnissen für eine optimale Immunfällung; 3) die Schritte ermöglicht Reduzierung der Hintergrund einschließlich Waschpuffer-Zusammensetzung, um TRAP-rc Experimente mit hoher Spezifität und Sensitivität geführt.
Dieses Protokoll liefert reproduzierbare Daten macht es leicht auf andere Zelltypen verwendet. Diese Technik ermöglicht es, differentiellen Genexpression auf der Ebene der aktiv-Übersetzung von mRNA zu analysieren und damit den Weg zum Verständnis der Proteinexpression in einer spec ific Zelltyp in einem bestimmten Zeitfenster. Man beachte jedoch, dass Proteinmenge wird auf die Geschwindigkeit der Übersetzung und Abbauprozesse abhängen. Eine Hauptbeschränkung der Trap-Verfahren ist die Unfähigkeit, Proteingehalt in einer genauen quantitativ zu messen oder posttranslationale Modifikation detektieren. Verbesserung der Quantifizierung durch Messung Ribosom Dichte entlang der mRNA Körper und, damit, in einem zelltypspezifische Weise können TRAP kombiniert mit Ribosomen-Footprinting ein sehr leistungsfähiges Werkzeug zu machen. In einer aktuellen Arbeit 34 wurde diese Verbindung in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen durchgeführt. Die Autoren lief Nuklease Footprinting, gefolgt von Affinitätsreinigung eines induzierbaren biotinylierten Form RpL10A mit Streptavidin-Kügelchen. Dies ist ein Beweis für das Prinzip, daß es möglich ist, Ribosom-Footprinting in einem gesamten Organismus durchzuführen, während Targeting eines spezifischen Zelltyps, die Begrenzung wobei die Menge des biologischen Materials zum Zwecke erforderlich.
"> Darstellende TRAP Experimenten parallel globale Transkriptom Analysen ermöglichen es, Proportionen zwischen neu transkribiert und actively- übersetzen RNA. Diese wird tief informative der potenziellen posttranskriptionale Mechanismen, die sich in spezifischen Entwicklungszusammenhängen oder spezifischer Zellpopulationen sein verfolgen -durch microRNAs zum Beispiel.Zusammenfassend ist TRAP eine hoch effiziente, spezifische und sensitive Methode zur Identifizierung RNAs aktiv umsetze Ribosomen in einer zellspezifischen Weise gebunden. Dieses Verfahren kann in einer breiten Vielfalt von Organismen und Gewebetypen verwendet werden. Das hier beschriebene neue TRAP-rc-Protokoll wurde für seltene Zellpopulationen (weniger als 1% der Gesamtzellzahl) und für eine Menge von Endmaterial ausreichend für spätere Analysen bei Gesamtgenom-Niveau optimiert.
Eine mögliche Einschränkung dieses Verfahrens ist das Erfordernis einer starken Treiber, den markierten Ribosomen in ausreichender Menge zu produzieren, um compete mit endogenen untagged diejenigen in der Zielzelltyp. In einer neueren Studie 25. geschätzten Autoren zu 10-30% das Verhältnis von markierten gegen unmarkierte Ribosomen.
Um dieses Problem zu steigenden UAS-RpL10A-EGFP Kopienzahl sollte dieses Gleichgewicht deutlich verbessern zu überwinden. Alternativ, zusätzlich zu den beschriebenen genetischen Hintergrund ein UAS-GAL4-Transgens wird die Produktion von GAL4-Protein zu verstärken und die Expression von RpL10A-EGFP indirekt zu erhöhen. Dies sollte eine bessere Auslastung von markierten Ribosomen auf mRNA begünstigen.
Beachten Sie, dass dies bereits effizienten Ansatz kann noch leistungsfähiger durch Anpassung komplementäre Methoden, um einen quantitativen Aspekt zu bringen oder zu entdecken und zu entwirren, die molekularen Mechanismen, die für die Genexpression Kontrolle vorgenommen werden.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
| 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
| Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
| Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
| Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
| Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
| Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
| Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
| Nuclease free water | Nalgene | ||
| Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
| Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
| Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
| Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
| TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
| MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
| Low binding filter tips | ClearLine | ||
| Rnase free tube 1.5 ml | ClearLine | 390689DD | |
| Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
| Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
| Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |
References
- Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
- Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
- Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
- Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
- Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).
- Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
- Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
- Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
- Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
- Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605 (2011).
- Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965 (2012).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
- Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419 (2010).
- Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276 (2012).
- Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
- Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
- Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
- Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
- Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).
