Introduction
Feltet af regenerativ medicin og tissue engineering er hurtigt fremme, med gennembrud i tracheal og nyre regenerering to bemærkelsesværdige seneste resultater. De biomaterialer udviklet i tissue engineering bliver mere tilgængelige, med muligheder for at overføre sådanne protokoller til mindre specialiserede laboratorier. Et felt primet til gavn gennem øget brug af biomaterialer er in vitro diagnostik.
In vitro undersøgelser er en vigtig platform til at undersøge intracellulære signalveje inden enlige celletyper, og har hjulpet afgrænse mekanismerne bag mange sygdom patofysiologier. Disse undersøgelser generelt afhængige af en enkelt celletype, der dyrkes som et monolag på vævskulturplast (TCP); en todimensional (2D) stiv overflade langt mindre elastisk og porøs end de tredimensionale (3D) miljø celler udsættes for inden et væv eller organ. Dyremodeller har traditionelt været employed at bekræfte effekter fundet in vitro også oversætte til hele væv, og kan også anvendes som prækliniske platforme til at undersøge humane sygdomme. Men indbyrdes artsforskelle underminere denne afhængighed dyremodeller i vores forståelse af sygdom hos mennesker -. For eksempel er meget forståelse af lungesygdom astma baseret på en musemodel trods iboende forskelle mellem den menneskelige tilstand og denne model herunder få tegn på mastcelle infiltration af glatte muskler i luftvejene bundt, eller evnen til sygdomsudvikling spontan i dyret model 3,4. Der er også etiske overvejelser vedrørende brugen af dyremodeller, med "3R" standard "udskiftning, raffinement, og reduktion" i dyreforsøg bliver opmuntret i Storbritannien og andre lande.
Et attraktivt alternativ ville være sammenfatning af humant væv in vitro skabe strukturs til at undersøge den kooperative karakter mellem voksne humane celletyper i en enkelt enhed. Findes celler i 3D multi-cellulære strukturer i væv, hver især inden for et unikt mikro-miljø. Dyrkningen af celler på TCP kun tillader kulturen i cellemonolag, ude af stand til at replikere dette miljø, eller tilvejebringe evnen til multi-cellekultur. Biomaterialer avancement giver mulighed for at udvikle både naturlige og syntetiske 3D platforme for cellekultur. Decellulariseret ECM kan bruges til 3D cellekultur når recellularized med andre celletyper, herunder stamceller 1, men sådanne protokoller kan være komplekse og tidskrævende, med tilgængeligheden af væv begrænset og hovedsagelig af ikke-human oprindelse. Andre protokoller tillader større kontrol over de cellulære miljøer skabt såsom nanoimprinting, ECM deposition, celle ark teknologier eller elektrospinning. Elektrospinning skaber ikke-vævede 3D porøse måtter af fibre med diametre fra nanometer til mikrometer, replicating naturlige ECM dimensioner. Elektrospundne stilladser i stigende grad ansat som 3D-cell dyrkning platforme -. Manipulation af de elektrospinding parametre tillader indviklede kontrol over stillads egenskaber såsom porestørrelse, fiberdiameter, topografiske og justering og overfladekemi. Ændringer i sådanne parametre er blevet vist at direkte påvirke celleadhæsion og vækst, når cellerne blev dyrket i isolation.
Disse fordele er blevet udnyttet i den foreliggende undersøgelse at tillade dyrkning af flere celletyper som en enkelt 3D vævskonstruktion, ved hjælp af luftvejs bronchiole som model 3D vævsstruktur. Den bronchiole væg består af tre vigtigste regioner (Figur 1). Slimhinden er hvor luftvejs-epitelceller sidde ved luft-væske-grænsefladen (ALI), hvilket giver en væsentlig hindring for det ydre miljø. De bor på reticular basalmembranen (RBM), en tæt kompakt ECM består hovedsageligt af collagen IV, perlecans og lamininer. Sub-mucosale lag findes direkte under slimhinden, en mere porøse område bestående af flere celletyper, herunder fibroblaster, myofibroblaster og infiltrerende leukocytter under sygdomstilstande. Endelig glatte muskelceller bundter wrap omkring luftvejene i en spiralformet måde og består af flugtende plader af luftvejenes glatte muskulatur (ASM). Det er den glatte muskulatur relative kontraktile tilstand, der styrer luftvejs tone. Ansættelse af elektrospundne stilladser i det pulmonale system var indtil for nylig været begrænset til regenerative formål; med en elektrospundne tracheal udskiftning med succes transplanteret. Mens vellykket, sådanne behandlinger er begrænsede i antal, og er fokuseret på luftrøret grund af den relative simple karakter af vævets funktion. Begrænsede eksempler på luftvejs-modeller, der anvendes til in vitro diagnostik findes, og er hovedsagelig fokuseret på glatmuskelkontraktion målinger. Den ikke-toksiske og ikken-nedbrydelig polymer polyethylenterephthalat (PET) tidligere er elektrospindes, og blev anvendt i den foreliggende undersøgelse at sikre stilladser producerede kunne opbevares i lange perioder uden at forringe (tillade dem at blive brugt "off the shelf"), og også være egnede for stabil cellekultur over lange tidsrum. Tidligere undersøgelser fra vores gruppe har vist, at anvendelse af tre varianter af en basisk elektrospinning-protokollen, kan tre individuelle PET elektrospundne scaffolds fremstilles for at tilvejebringe optimale topografi til dyrkning luftvejs epithelial, fibroblast, og glatte muskelceller i isolation 21,22 og cokultur af luftvejs epiteliale og fibroblastceller 22. Fiberdiameter blev fundet at høj grad påvirke epithelial funktionalitet 22, og fiber alignment tillod frembringelsen af flugtende plader af glat muskulatur 21. Disse undersøgelser blev udført uafhængigt af hinanden under statiske forhold. I den foreliggende undersøgelse, disse Forskelnt stilladser, der indeholder fuldt differentierede voksne humane celler er blevet samdyrket i en uge på ALI i et kommercielt tilgængeligt bioreaktor som 3D-sektion af luftvejen væg, hvilket giver en fysiologisk relevant in vitro model for at undersøge luftvejs inter-cellulære responser. Mens denne protokol bruger luftvejene bronchiole som modelsystem, kunne det tilpasses som en platform for 3D cokultur af slimhinde enheder fra andre organer.
Protocol
Primære ASM celler fra ikke-astmatiske individer blev isoleret fra bronkiale biopsier på Glenfield Hospital (Leicester, UK) som beskrevet tidligere. Forskningen blev godkendt af Leicestershire etiske komité og patienter gav deres skriftlige informerede samtykke.
1. Electrospinning PET Stilladser (figur 2)
- Der fremstilles en opløsning (10 ml) af drikke flasker, PET i en 1: 1 dichlormethan (DCMro) - trifluoreddikesyre (TFA) opløsning. PET koncentrationer på 8%, 30% og 10% vægt / volumen (vægt / volumen) er påkrævet for nanofiber, mikrofiber og tilpasset stilladser henholdsvis og derefter omrøres opløsningen O / N ved stuetemperatur i PET at opløse.
- Overfør PET opløsningen i en sprøjte og vedlægge en 23-G (til nanofiber) eller en 18-G (til mikrofiber og tilpasset) til sprøjten og placere sprøjten i en motoriseret sprøjtepumpe. Sørg for spidsen af nålen drejes til bunden.
- Placer mandrel 15 cm fra spidsen af nålen, hvilket sikrer nålen er rettet mod midten af tromlen.
- Fastgør elforsyningen til nålespidsen med krokodillenæb og jorde dornen (via banan stik) til jord. Tænd for strømforsyningen til dornen og indstille hastigheden til 60 rpm (svarende til ca. 13,2 m · min -1) for nanofiber og microfiber stilladser. Indstillede hastighed til 2.000 rpm (svarende til ca. 440 m · min -1) for justeret stilladser.
- Indstil sprøjtepumpen til en strømningshastighed på 0,5 ml · h-1 for nanofiber tilfældige og aligned stilladser eller 2,0 ml · h-1 for microfiber stilladser. Lad pumpen køre, indtil opløsningen ekstruderes fra nålespidsen for at fjerne eventuel luft i nålen. Derefter standse pumpen.
- På sprøjten pumpe, indstilles den samlede løsning at blive udvist til 2 ml, og start pumpen.
- Set spændingsforsyning til 14 kV, og tænd for strømmen supply.
- Electrospin indtil 2 ml opløsning er blevet elektrospindes (4 timer for nanofiber og afstemt stilladser, 1 time for microfiber stilladser).
- Skær stilladset med et blad langs bredden af dornen. Dette frembringer en 2D ark af stillads størrelsen af dornen overfladeareal (i dette tilfælde en rektangulær plade 22 cm x 11 cm), som kan forsigtigt trækkes af dornen). Opbevar stilladset i aluminiumfolie for at reducere elektrostatisk ladning).
Bemærk: Bifasisk stilladser fremstilles ved sekventiel elektrospinding en nanofiber stillads direkte på en mikrofiber stillads.
2. Sterilisering af Stilladser inden brug i Cell Culture
- Fra stilladset arket, punch ud skiver af bifasisk eller justeret stilladser ved hjælp af en 0,8 mm diameter biopsi pen og holde sig til pakning ved hjælp af ikke-giftige akvarium lim.
- Sterilisere stilladser ved hjælp ultraviolet bestråling i 30 minutter på hver side af stilladserne før neddypning i en 20% Vol / vol antibiotisk / antimykotisk opløsning (2x10 5 enheder ml -1 penicillin G, 2.000 mg amphotericin B ml-1 streptomycin sulfat og 500 ug ml-1) O / N ved 4 ° C.
- Vaske stilladser med PBS 3 gange, og derefter gemme stilladser i TCP brøndsplader i PBS ved 4 ° C indtil anvendelse.
3. celledyrkningsmedier Bestanddele
- Kultur CALU3 epitelceller i DMEM-F12-medium suppleret med 10% vol / vol føtalt kalveserum (FCS), 2 nM L-glutamin opløsning, 1% vol / vol antibiotikum / antimykotisk opløsning (10.000 enheder ml -1 penicillin G, 100 mg ml-1 streptomycin sulfat og amphotericin B 25 ug ml-1).
- Kultur MRC5 fibroblast og ASM celler i DMEM-medium suppleret med 10% vol / vol føtalt kalveserum (FCS), 2 nM L-glutamin opløsning, 1% vol / vol antibiotikum / antimykotisk opløsning (10.000 enheder ml -1 penicillin G, 100 mg ml -1 streptomycinsulfat og amphotericin B 25 ug ml-1).
- Kultur epithelial-fibroblast-ASM celle co-kulturer i en 70:30 DMEM-F12: DMEM-medium blandingen.
4. Såning af fibroblast og epitelceller på bifasisk Scaffold
- I en vævskulturplade, sættetid stilladser i DMEM-supplerede medier og inkuberes ved 37 ° C i 1 time før cellepodning.
- Fjern DMEM-suppleret medier, placere microfiber fase af stillads apikalt og frø 1.5 x10 4 MRC5 fibroblastceller i 30 ul DMEM-suppleret medier. Agitere plade på en orbitalryster i 2 timer, før de forlader i en inkubator ved 37 ° C 5% CO2 i luft O / N.
- Vend stilladset over, så den nanofiber fase af stillads vender apikalt, frø 3.0 x10 4 CALU3 epitelceller i 30 pi DMEM-F12-medier suppleret på nanofiber fase af stilladset og inkuberes for 2 timer ved 37 ° C, 5% CO2 i luft, før nedsænkning stilladset i 70:30 DMEM-F12: DMEM-medier suppleret O / N før overførsel til bioreaktoren.
5. Såning af ASM Celler på Alliancefri Scaffold
- I en vævskulturplade, sættetid stilladser i DMEM-supplerede medier og inkuberes i 1 time ved 37 ° C før podning 2,5 x10 4 celler i 30 pi DMEM-supplerede medier og inkubering i 2 timer (37 ° C, 5% CO 2 i luft). Nedsænkes stillads i DMEM-suppleret medier tilbagevenden til inkubator og lade O / N før der fastlægges en tri-kultur i bioreaktoren.
6. Oprettelse Tri-kulturen ved hjælp af bioreaktor system (figur 7)
- Placer bifasisk stillads pakningen ind i rillen inden et kammer med epitel fase opad ind i kammeret.
- Placer justeret stillads under tofasede stillads (så det er tilstødende til microfiber fase af den tofasede stillads) og lås de to kamre i bioreaktoren sammen.
- Saml to perfusion flow kredsløb tilsluttet to mellemstore reservoirer (DMEM-F12-suppleret medier i apikal reservoir, DMEM-F12 / DMEM-suppleret medier i basal reservoir) og pumpe medier omkring de to kredsløb ved ca. 0,1 ml / min ved hjælp af en peristaltisk pumpe (40 ml medium recirkuleres gennem hvert kredsløb). House alle dele af systemet i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i luft.
- Efter en uge, fjerne mediet fra den apikale kammer, og kultur epithelcellerne på ALI i endnu en uge før analyse.
Representative Results
Scanningselektronmikroskop billeder af decellulariseret luftvej væv eller immunologiske billeder fra luftvejs biopsier identificerede ønskelige karakteristika af luftvejene ECM vi ønskede at indføre i elektrospundne stillads topografi: Native RBM matrix består af fibre ca. 153 nm ± 30,6 nm (middelværdi ± SD n = 50 målinger ) i diameter (figur 3A & 5A), mens matrixen omkring RBM var mere porøs i natur (figur 3C). Immunhistologiske snit gennem glatte muskelceller bundter viser ASM stede som aligned plader af celler 21 (figur 3E). Disse oplysninger blev brugt til at guide de egenskaber, der er indført i elektrospundne stilladser. En roterende dorn var i stand til stabilt at rotere ved høje hastigheder (> 2.000 rpm / 440 m · min -1) for at fremstille stilladser med justeret fibre. Langsom dorn rotation (60 rpm 13,2 m · min -1) påvirkede ikke fiberorienteringen, Men produceret stilladser med mere ensartet tykkelse end når elektrospinding på en statisk plade. Ved ændring af elektrospinning parametre (PET koncentrations- og opløsning flow rate), var det muligt at skabe scaffolds fibre med en diameter på flere mikrometer eller hundrede nanometer (elektrospinning parametre er angivet i tabel 1).
Elektrospundne fibre med ækvivalente fiberdiametre til fysiske RBM fibre (150 nm) blev fremstillet under anvendelse af en 6% opløsning PET, men i så lave koncentrationer PET, beading af fibrene indtraf (figur 4A). Dette blev elimineret ved at øge koncentrationen af PET-opløsningen til 8%, som producerede ensartede nanofibre besidder en gennemsnitlig diameter på 255 nm ± 2,4 nm (gennemsnit ± SEM) og gennemsnitlig porestørrelse på 1,43 um ± 0,02 um (fig 4B, 5A & B). At electrospin nanofibre var det nødvendigt at reducere nålens størrelse fra 18 G 23 G, giver langsommere flowhastigheder whilst opretholde en højere strømningshastighed og reducere nål blokering, et tilbagevendende problem med den større nål. Når elektrospinding mikrofibre, en stigning i PET løsning på> 30% PET føre til en mangel på ensartethed i fiber diameter (figur 4F) ud over flere blokeringer på nålespidsen grund af den høje opløsning viskositet. Ensartede microfiber måtter besidder en gennemsnitlig fiberdiameter på 2,50 um ± 0,02 um (gennemsnit ± SEM) og gennemsnitlig porestørrelse på 10,45 um ± 0,13 um blev produceret, når elektrospinding en 30% vægt / volumen PET opløsning ved en strømningshastighed på 2 ml / time -1 (figur 4F, 5A & B). Sekventiel elektrospinning af nanofiber stillads direkte på en mikrofiber stillads (stadig fastgjort til dornen) skabte en bifasisk stillads (figur 3D). De gennemsnitlige fiberdiametre var 280 nm ± 20 nm og 2,30 um ± 0,06 um for nanofiber og microfiber faser henholdsvissammenlignelig med dimensionerne af individuelle nanofiber og microfiber stilladser. Derudover er tykkelsen af den tofasede stillads var lig med summen af de individuelle nanofiber og microfiber stilladser (figur 5C). Ved at øge dornen hastighed (2.000 omdr / 440 m · min -1), var stærkt afstemt nano- eller microfiber stilladser produceret. 8% vægt / volumen PET løsning ikke var optimal til fremstilling aligned nanofibre og producerede fibre besidder en bølge-lignende morfologi (figur 3F). En stigning til 10% PET ophævet denne effekt, men stadig resulterede i en reduceret fiberdiameter (216 nm ± 2,2 nm (gennemsnit ± SEM)) sammenlignet med de tilfældigt aligned nanofiber stilladser. Fiber justering blev beregnet ved at bestemme afvigelse af hver fiber vinkel fra middelværdien fiber vinkel. I aligned nanofiber stilladser 79% af fibre blev justeret (± 10 ° gennemsnitlig fiber vinkel) sammenlignet med 10,2% af fibre i tilfældigt rettet ind nanofiber scaffårige (figur 5D).
8% nanofiber stillads blev anvendt til at rekapitulere ringmekanismen hvorpå epitelceller bor, og blev anvendt til at støtte kulturen af CALU3 celler (en luftvejs epithelial cellelinje). 30% vægt / volumen microfiber stillads, bliver mere porøs i natur blev anvendt til at efterligne den sub-mucosal region, og blev dyrket med MRC5 celler (en luftvej fibroblast celle-linje). 10% vægt / volumen justeret nanofiber stillads billede topologiske referering at sikre ASM cellejustering når de dyrkes på stilladset. Alle tre celletyper viste en stigning i levedygtighed, når de dyrkes på deres individuelle stilladser over en 2 ugers periode (figur 6A), og udtrykte celle-typespecifikke proteiner efter de 2 ugers dyrkningsperioden (figur 6B, 6C, og 6D). Yderligere karakterisering af individuelle celle-stillads interaktioner er blevet rapporteret andetsteds 21. Den sekventielle elektrospinning af nanofiber stilladspå microfiber stillads produceret en bifasisk stillads for cokultur af CALU3 epitelceller og MRC5 fibroblastceller onto nanofiber og microfiber faser henholdsvis. Dyrkning af de to celler sammen under statiske forhold er blevet rapporteret andetsteds 22. Yderligere arbejde forsøger at tilføje andre cellelag eller udvide tofasede dyrkning gange over to uger under statiske forhold viste sig forgæves (data ikke vist). Til kultur en tri-lagdelt model over en længere periode, vi anvendte en perfusion flow bioreaktor. Den CALU3 og MRC5-celler blev podet på den tofasede stillads, og ASM celler podes på en linie stillads, og begge blev dyrket separat i 2 dage. De to skeletter blev derefter købte sammen til dannelse af en tri-lags modellen af luftvejen væg i bioreaktoren (figur 7). Begge kamre blev perfunderet med medier til 7 dage før det apikale epitel kammer havde sine mediet fjernet, og de epiteliale celler blev dyrket vedALI i yderligere 7 dage. Stilladser blev fikseret og enten sektioneret og farves, eller hele stilladser blev immunfarvet for celle-specifikke markører. Snit gennem tri-lags kultur viste cellekerner fordelt gennem alle tre lag af den cokultur (figur 8B). Når celler blev immunfarvet for cellespecifikke markører, epitelceller befolket den apikale nanofiber fase som et konfluent celle-lag og farves positive for cytokeratin (figur 8C), om microfiber fase fibroblaster farvet positive for S100A4 (figur 8D), og på de aligned 10% stillads ASM celler farvet positive for SM22α (figur 8E), hvilket indikerer god overlevelse af hver celletype i 3D-model af luftvejene væg.
Figur 1. luftvejene bronchiole. Bronkial biopsi af en alvorligastmatisk luftvej viser epitel på retikulære basalmembran (RBM), med den underliggende submukøse region befolket med mesenchymale celler, og de omgivende glatte muskelceller bundter befolket med glatte muskelceller farvet for glatmuskel a-actin (brun). Scale bar indikerer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Et skematisk af elektrospinningsprocessen udstyr. En sprøjte indeholdende polymeren / opløsningsmidlet opløsning (med nål) placeres på en sprøjtepumpe vender dornen. Et elektrisk potentiale er etableret mellem nålen og dorn forårsager fibre, der skal udstødes fra nålespidsen og aflejret på roterende dorn. Som fiberen passerer gennem atmosfæren,opløsningsmidlet fordamper forårsager aflejring af polymere fibre på dornen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sammenligning af elektrospundne stilladser til nativt ECM luftveje. Scanningselektronmikroskop billeder af decellulariseret basalmembran (A), decellulariseret luftvej bronchiole tværsnit (C) og en histologisk sektion af en glat muskulatur i luftvejene bundt (farvet med hæmatoxylin og eosin, skala bar 40 um) (E) i forhold til nanofiber (B) bifasisk (D) og rettet ind (F) PET stilladser. Klik her for at seen større version af denne figur.
Tabel 1. Parametre anvendt til elektrospinding af microfiber, nanofiber og tilpasset stilladser individuelt og for bifasisk stilladset.
Figur 4. Ændring i PET koncentrationer påvirker fiber egenskaber. Scanningselektronmikroskop billeder af elektrospundne stilladser spundet fra 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% og 35% (EG) (vægt / vol) PET-løsninger . Vist også afstemt stilladser fremstillet af 8% (D) og 30% (H) vægt / vol PET-løsninger. AD afbildet på 5,000X forstørrelse, EH afbildet på 1.000X forstørrelse. Klik her for at se et størreversion af denne figur.
Figur 5. Egenskaber af elektrospundne PET stilladser. (A) Distribution kurver viser fordelingen fiber diameter fra reticular basalmembran ekstracellulære matrix (RBM ECM), tilfældigt på linie nano- og mikro-fiber stilladser, og justeret nanofiber stillads. (B) Histogram viser den relative porestørrelsesfordeling i nano- og mikro-fiber stilladser. (C) Gennemsnitlig tykkelse af nanofiber, microfiber, tofasede og aligned stilladser (middelværdi ± standardafvigelse, n = 6). (D) Histogram plot viser afvigelsen fra middelværdien fiber orientering i tilfældige eller justeret nanofiber stilladser Stillads fiber analyse blev udført ved hjælp af ImageJ software. Please klik her for en større version af dette tal.
Figur 6. Den kultur af de enkelte celletyper på de enkelte stilladser. (A) alamarBlue cellelevedygtighed analyseresultater for ASM celler på linie scaffolds, CALU3 celler på nanofiber stilladser og MRC5 celler på microfiber scaffolds (gennemsnit ± SEM, n = 3- 20). Scanningselektronmikroskop billeder af nanofiber, mikrofiber og aligned fiber stilladser (B, C og D henholdsvis) og immunofluorescensprocedurer billeder af CALU3 celler farvet for E-cadherin (rød), MRC5 celler farvet for vinculin (rød) og ASM-celler farvet for SM22α (rød) alle på deres specialiserede stillads (E, F og G). Hoechst blev brugt til at farve kerner (blå), skala bar angiver 40 &# 181; m. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Perfusion system til tri-lags luftveje vægmodel. (A) Fotografi af bioreaktor fartøj tilsluttet peristaltisk pumpe og 2x medier reservoirer. (B) Skematisk af tri-lag stilladser. (C) Skematisk af de to bioreaktor kredsløb når luftvejene modellen afholdt på luft-væske grænsefladen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Komplet 3D luftvejs vægmodel. (A) Bronkial biopsi af luftvejene væg med slimhindelaget markeret med rødt, det submukøse region markeret med grønt, og den glatte muskulatur bundt fremhævet i guld. (B) Snit gennem tri-lag luftvej væg bestående af tofasede og aligned stilladser befolket med epitel-, fibroblast og glatte muskelceller fastsat efter 2 uger cokultur. Cellekerner blev farvet med DAPI (blå) med stillads reflektans (grå) samtidigt afbildet. Stilladser blev også fast og immunofarvet for celle specifikke markører efter 2 uger, med CALU3 celler farvet for cytokeratin (grøn) (C), MRC5 celler farvet for S100A4 (grøn) (D), og glatte muskelceller farvet for SM22α (rød) ( E). Scale bar indikerer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1.
Discussion
Evnen til at electrospin polymere fibre med strukturelle egenskaber sammenlignelige med naturlig ECM har ført til talrige naturlige eller syntetiske polymerer eller polymerblandinger bliver elektrospundet at genskabe disse miljøer,. Manipulation af procesparametre (herunder polymer valg, koncentration polymer, opløsningsmiddel, nålespidsen afstand og temperatur) kan alle indflydelse stillads egenskaber; men nogle parametre kan have større indflydelse på stillads egenskaber end andre 25,. Når modificering PET-fiber diameter, fandt vi de vigtigste parametre for at være koncentrationen af den anvendte polymer, den hastighed, ved hvilken polymeropløsningen var elektrospundet, og nålen diameter. Når elektrospinding aligned fibre de vigtigste parametre er samlingen anvendte metode (en roterende dorn), og den hastighed, hvormed dornen roterer. Ved at reducere dornen hastighed til 60 rpm, fandt vi tilfældigt afstemt stilladser produceret viste større stillads uniensstemmelse forhold til elektrospinding på en flad solfanger plade.
De karakteristiske træk ved decellulariseret luftveje væv blev analyseret for at give vejledning til de forskellige stillads topografier udviklet til kulturen i hver luftvejs celle-type. Elektrospundne nanofibre er en attraktiv stillads til at replikere membranstrukturer basement grund af det lille porestørrelse men høj samlet porøsitet, der giver mulighed for øget metabolit diffusion samtidig begrænse cellulær bevægelse. 9 Mens optimere elektrospinning parametre, blev en række PET koncentrationer og strømningshastigheder testet. De tyndeste fibre blev opnået ved anvendelse af en 6% vægt / volumen PET opløsning, der tidligere blev anvendt af andre grupper. Men høje niveauer af beading, og manglende ensartethed var konstant problemer. Indledende forsøg på at fjerne den beading inkluderet tilsætning af et kationisk overfladeaktivt middel, cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), til opløsningen for at nedsætte overfladespændingen og teste forskellige kilderaf PET. Tilsætningen af overfladeaktive reduceret mængden af beading, men ikke helt. Efter forsøger en række kommercielle kilder til PET-pellets blev fødevarekvalitet drikkeflaske anvendte PET, ved at skære op drikkeflasker og opløse disse i DCM: TFA solvent opløsning. Bruge dette som PET kilde resulterede i en stigning i fiber ensartethed og en reduktion i fiber beading. Ved at øge opløsningens koncentration smule til 8% vægt / volumen og reducere nålens diameter (18G til 23G) vi konsekvent fremstilles defekt frie nanofibre med en fiberdiameter på omkring 250 nm. Elektrospundne nanofiber stilladser kan være meget elektrostatisk ved afhentning fra dornen gør manuel håndtering af stilladser vanskelige. Dette blev forbedret ved lagring af stilladser i alufolie efter spinding og iblødsætning i 70% IMS før brug. Dette syntes at hjælpe sprede den resterende elektrostatiske ladning tilbage på stilladset fra elektrospinningsprocessen.
At give topographies svarer til de enkelte mikromiljøer støder de tre vigtigste luftveje celletyper inden luftvejene væg blev en basisk elektrospinning protokol indrettet til at frembringe tre unikke stillads til disse celletyper: ved elektrospinding en lav koncentration PET opløsningen langsomt, blev tilfældigt aligned nanofibre genereret, hvorpå epitelceller blev podet (efterligne RBM). Ved elektrospinding en højere koncentration PET opløsning ved en hurtigere hastighed, blev tilfældigt aligned mikrofibre genereret (fremstilling af et mere porøst stillads), ind i hvilken fibroblaster blev podet (efterligne sub-mucosale område umiddelbart under RBM). Ved elektrospinding en lav koncentration PET opløsningen på en høj hastighed roterende dorn afstemt nanofibre blev produceret, på hvilken glatte muskelceller orienteret i fiberretningen, producerer justeret ark af celler.
Øget fiberdiametre føre til øget porestørrelse, så større celle penetration ind stilladser og så hjælpe med at skabe en ægte 3D-miljø,. Microfiber stilladser blev anvendt til dyrkning af fibroblaster i undersøgelsen for at sikre, at cellerne boet på flere planer inden stilladset. Ved at øge PET koncentrationen til 30% vægt / volumen, blev PET fibre med en gennemsnitlig diameter på 2,5 um produceret. Fibre større diameter (≈ 4 um) blev fremstillet under anvendelse af en 35% vægt / volumen PET løsning, men stillads tykkelsesensartethed var tabt, og højere variabilitet mellem individuelle fibre var tydelig. Porer i microfiber stillads var over 7 gange større end dem, måles i nanofiber stilladser (10.45 pm vs 1,43 um), men stadig statisk podning af celler forudsat begrænset cellulær penetration. Dette blev forbedret ved dynamisk podning af celler under anvendelse af en orbital mixer, en fremgangsmåde vist at være effektiv tidligere.
Stærkt justeret nanofiber stilladser blev skabt ved elektrospinding en 10%vægt / volumen PET løsning på dornen roterer ved 2.000 rpm (≈ 440 m · min -1). PET-koncentrationen blev forøget fra 8% for at forhindre et uregelmæssigt bølge-lignende morfologi at fibre udstillet ved lavere koncentrationer. Trods stigningen i koncentrationen, tilpasse fibrene reduceret den gennemsnitlige fiber diameter (216 nm vs 255 nm, justeret vs tilfældig). Den høje hastighed af dornen trække fibrene ud, før de er tørret, er tilbøjelige til at forårsage denne virkning. Tilpasningen af fibrene påvirket tilpasningen af ASM celler, og har også andre fysiologiske virkninger på ASM celler, som er blevet karakteriseret andetsteds 21.
Den største begrænsning ved denne protokol er den manglende evne til at afbilde levende celler på / i strukturerne gør initial celle-vedhæftning eller differentiering over en længere tidsperiode umuligt at afgøre uden at ofre prøver. Det betyder mest optimering opstår efter kulturen periode dvs fixing prøver og derefter måle, om cellekultur lykkedes efter ikke under cellekultur. Observere en farveændring i stilladser inkuberet i alamarBlue (blå til pink) angiver celler er til stede og levedygtige, men er ikke ideel. Elektrospinding mere transparente polymerer, såsom gelatine kunne hjælpe med at visualisere celler på stilladser. Elektrospinningsprocessen af en nanofibrous stillads i vores model tillod replikationen af luftvejen ringmekanismer, ligeledes består af tætte nanofibre, hvor epitelcellerne bor. Det er tidligere blevet vist, at strukturelle celler ikke kan migrere gennem nanofiber stillads 22, selv immunceller er i stand til (data ikke vist). Mens fordelagtigt til dyrkning af bestemte celletyper på en 3D overflade (såsom epitel- og endotelceller), kan dette forebyggelse af strukturel cellemigration gennem nanofibre være skadeligt for dyrkning af andre celletyper. Så glat muskel er ikke i stand til at vandre gennem the aligned nanofiber stillads vi samlet tri-lags cokultur med den glatte muskulatur og fibroblast lag vender mod hinanden (i modsætning til den linie stillads adskiller de to celletyper). Mens dette gør det muligt for cellerne at være i tæt apposition, kan den aktuelle undersøgelse ikke konkludere, om den ene celletype (enten fibroblast eller glat muskulatur) vil overhale hele lag over et mere forlænget dyrkningsperiode. På trods af disse begrænsninger, har en levedygtig tri-lags model af luftvejene væg blevet udviklet, som et alternativ platform til at undersøge samspillet mellem disse mange celletyper. En lignende tri-lags undersøgelse er for nylig blevet offentliggjort, hvor fibroblaster blev indlejret i en cylindrisk collagen I Hydrogel med glat muskulatur podet på den ydre overflade og epitelceller i luminale overflade 17. Den mekaniske stabilitet af elektrospundne stilladser her udviklede ville tillade lignende rørformede konstruktioner, der skal dannes, og er stadig en aktuel reseaRCH sigte inden for vores gruppe. Mens undersøgelsen har fokuseret på luftvejene, flere organer i kroppen deler denne grundlæggende slimhinde strukturel enhed, og gennem modificering lejerne fremhævet i denne undersøgelse, kunne udvikles lignende platforme til væv, som indeholder en basalmembran enhed, herunder blodkar, blæren og hornhinden, hvor kollagen baserede multi-lag modeller er blevet anvendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
| Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
| Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
| Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
| DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
| DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
| MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
| Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
| FCS | Gibco | Media supplement | |
| Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
| Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
| 3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Wenzel, S., Holgate, S. The mouse trap: it still yields few answers in asthma. American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).
- Zosky, G. R., Sly, P. D. Animal models of asthma. Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).
- Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. Animal models of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).
- Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns. Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).
- Paik, I., et al. Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes. Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).
- Williams, C., et al. Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns. Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).
- Schindler, M., et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).
- Schindler, M., et al. Living in Three Dimensions. Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).
- Ahmed, I., et al. Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces. Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).
- Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior. Biomaterials. 20, 573-588 (1999).
- Sun, T., et al. Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers. Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).
- Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).
- Jeffery, P. K. Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study. Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Miller, C., George, S., Niklason, L. Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).
- West, A. R., et al. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).
- Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation. Lab on a chip. , (2014).
- Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).
- Morris, G., et al. Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).
- Morris, G. E., et al. A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication. 6 (3), 035014 (2014).
- Sell, S., et al. The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues. Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).
- Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).
- Dalton, P. D., et al. Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies. Biomaterials Science. 1 (2), 171 (2013).
- Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning. Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).
- Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate). Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).
- Veleirinho, B. Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats. Journal of Polymer. , 460 (2008).
- Balguid, A., et al. Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).
- Shalumon, K. T., et al. Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique. IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).
- Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds. Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
- Rose, J., et al. Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering. Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).
- Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).
- Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium. Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).
- Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes. Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).
- Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).
