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Bioengineering

Electrospinning प्रक्रिया अपनाना एक त्रि-स्तरीय लिए तीन विशिष्ट वातावरण प्रदान करने के लिए Published: July 31, 2015 doi: 10.3791/52986
Automatic Translation
1, 2, 5, 3, 4, 6, 1, 1
1Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 2Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, School of Pharmacy, University of Nottingham, 3Division of Immunology and Allergy, School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 4Division of Respiratory Medicine, School of Clinical Sciences, University of Nottingham, 5NIHR Respiratory Biomedical Research Unit, University of Leicester, 6School of Sport, Exercise, and Health Sciences, Loughborough University

Introduction

पुनर्योजी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में तेजी से सांस की नली और गुर्दे उत्थान दो उल्लेखनीय हाल की उपलब्धियों के क्षेत्र में सफलताओं के साथ, आगे बढ़ रहा है। ऊतक इंजीनियरिंग में विकसित biomaterials के कम विशेष प्रयोगशालाओं के लिए इस तरह के प्रोटोकॉल का हस्तांतरण करने के लिए अवसरों के साथ, और अधिक सुलभ हो रहे हैं। Biomaterials के उपयोग में वृद्धि के माध्यम से लाभ प्राप्त करने के लिए primed एक क्षेत्र विट्रो निदान में है।

इन विट्रो अध्ययन में एकल कोशिका-प्रकार के भीतर अंतर सेलुलर संकेत दे रास्ते की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण मंच हैं, और कई रोग pathophysiologies अंतर्निहित तंत्र को चित्रित मदद की है। इन अध्ययनों से आम तौर पर टिशू कल्चर प्लास्टिक (टीसीपी) पर एक monolayer के रूप में संवर्धित किया जा रहा है एक एकल कोशिका-प्रकार पर निर्भर करते हैं; अब तक कम लोचदार और झरझरा तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण कोशिकाओं की तुलना में एक दो आयामी (2 डी) कठोर सतह एक ऊतक या अंग के भीतर करने के लिए सामने आ रहे हैं। पशु मॉडलों पारंपरिक रूप से ई गया हैभी पूरे ऊतक करने के लिए अनुवाद के लिए इन विट्रो में पाया प्रभाव पुष्टि करने के लिए mployed, और यह भी मानव रोगों की जांच के लिए पूर्व नैदानिक ​​प्लेटफॉर्म के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, अंतर-प्रजाति मतभेद मानव रोग के बारे में हमारी समझ में पशु मॉडल पर इस निर्भरता को कमजोर -। उदाहरण के लिए, फेफड़ों के रोग अस्थमा की ज्यादा समझ छोटे airway के चिकनी पेशी बंडल के मस्तूल सेल घुसपैठ का सबूत है, या जानवर के भीतर सहज रोग के विकास के लिए क्षमता सहित मानव हालत और इस मॉडल के बीच निहित मतभेद के बावजूद एक माउस मॉडल पर आधारित है 3,4 मॉडल। ब्रिटेन और अन्य देशों में प्रोत्साहित किया जा रहा पशु प्रयोगों में "प्रतिस्थापन, शोधन, और कमी" के "3Rs" मानक के साथ पशु मॉडल के उपयोग के संबंध नैतिक आधार भी हैं।

एक आकर्षक विकल्प इन विट्रो बनाने संरचना में मानव ऊतकों की आवृत्ति होगाएक एकल इकाई में वयस्क मानव प्रकार की कोशिकाओं के बीच सहकारी प्रकृति की जांच करने के लिए। प्रकोष्ठों एक अद्वितीय सूक्ष्म वातावरण के भीतर प्रत्येक, ऊतक के भीतर 3 डी बहु सेलुलर संरचनाओं में मौजूद हैं। टीसीपी पर कोशिकाओं के संवर्धन केवल इस माहौल को दोहराने, या बहु-सेल संस्कृति के लिए क्षमता प्रदान करने में असमर्थ सेल monolayers, की संस्कृति की अनुमति देता है। बायोमैटिरियल्स उन्नति सेल संस्कृति के लिए प्राकृतिक और सिंथेटिक 3 डी प्लेटफार्मों दोनों विकसित करने का अवसर प्रदान करता है। स्टेम कोशिकाओं 1 सहित अन्य सेल प्रकार के साथ recellularized जब decellularized ईसीएम ऊतक सीमित है और काफी हद तक गैर मानव मूल के की उपलब्धता के साथ, फिर भी इस तरह के प्रोटोकॉल जटिल और समय लेने वाली हो सकती है, 3 डी सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्य प्रोटोकॉल nanoimprinting, ईसीएम बयान, सेल चादर प्रौद्योगिकी, या electrospinning रूप में इस तरह बनाया सेलुलर वातावरण पर अधिक नियंत्रण अनुमति देते हैं। Electrospinning नैनोमीटर से माइक्रोमीटर से लेकर व्यास, आर के साथ फाइबर की गैर बुना 3 डी झरझरा मैट बनाता हैप्राकृतिक ईसीएम आयाम eplicating। Electrospun scaffolds के तेजी से 3 डी सेल संवर्धन प्लेटफॉर्म के रूप में नियोजित किया जा रहा -। Electrospinning मापदंडों के हेरफेर में इस तरह के छेद के आकार, फाइबर व्यास, स्थलाकृति और संरेखण, और सतह के रसायन शास्त्र के रूप में पाड़ विशेषताओं पर जटिल नियंत्रण की अनुमति देता है। कोशिकाओं अलगाव में सुसंस्कृत थे जब इस तरह के मापदंडों का परिवर्तन, सीधे कोशिका आसंजन और विकास को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है।

ये लाभ एक मॉडल के 3 डी ऊतक संरचना के रूप में वायु-मार्ग bronchiole का उपयोग करते हुए, एक भी 3 डी ऊतक निर्माण के रूप में अनेक प्रकार की कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति के लिए वर्तमान अध्ययन में शोषण किया गया है। bronchiole दीवार के तीन मुख्य क्षेत्रों (चित्रा 1) के होते हैं। वायु-मार्ग उपकला कोशिकाओं बाहरी वातावरण के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा प्रदान, हवा तरल इंटरफेस (अली) में बैठने के लिए जहां म्यूकोसा है। वे जालीदार तहखाने झिल्ली (RBM) पर रहते हैं, एक कसकर कॉम्पैक्ट ईसीएम मुख्य रूप से collag के शामिलएन चतुर्थ, perlecans, और laminins। उप-श्लैष्मिक परत सीधे म्यूकोसा, fibroblasts, myofibroblasts सहित और रोग की शर्तों के तहत ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ अनेक प्रकार की कोशिकाओं के शामिल एक और अधिक असुरक्षित क्षेत्र के नीचे पाया जाता है। अंत में चिकनी पेशी बंडलों एक चक्करदार फैशन में airway के आसपास लपेटो, और airway चिकनी मांसपेशियों (एएसएम) की गठबंधन पत्रक के शामिल हैं। यह airway के स्वर को नियंत्रित करता है कि चिकनी पेशी के सापेक्ष सिकुड़ा राज्य है। फेफड़े प्रणाली के भीतर electrospun scaffolds के रोजगार हाल ही में जब तक पुनर्योजी प्रयोजनों के लिए सीमित कर दिया गया था; के साथ एक electrospun सांस की नली प्रतिस्थापन सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित किया जा रहा है। सफल जबकि, इस तरह के उपचार की संख्या में सीमित कर रहे हैं, और वजह से ऊतक के समारोह के रिश्तेदार सरल प्रकृति के श्वासनली पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। इन विट्रो निदान के लिए किया airway के मॉडल का सीमित उदाहरण मौजूद हैं, और मुख्य रूप से चिकनी मांसपेशियों में संकुचन माप पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। गैर विषैले और कोईएन-सड़ सकने बहुलक polyethylene terephthalate (पीईटी) पहले electrospun किया गया है, और उपयुक्त हो भी उन्हें ("शेल्फ" में इस्तेमाल किया जा करने के लिए) की अनुमति के बिना अपमानजनक लंबी अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है उत्पादन मचान सुनिश्चित करने के लिए वर्तमान अध्ययन में कार्यरत था, और विस्तारित समय अवधि में स्थिर सेल संस्कृति के लिए। हमारे समूह से पिछले अध्ययनों से एक बुनियादी electrospinning प्रोटोकॉल के तीन रूपों को रोजगार, तीन अलग-अलग पीईटी electrospun scaffolds के संवर्धन के लिए airway उपकला, तंतुप्रसू के लिए इष्टतम topographies, और अलगाव 21,22 में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और airway के coculture प्रदान करने के लिए उत्पादन किया जा सकता है कि पता चला है उपकला और fibroblast कोशिकाओं 22। फाइबर व्यास बहुत उपकला कार्यक्षमता 22 को प्रभावित करने के लिए मिला है, और फाइबर संरेखण चिकनी पेशी 21 की गठबंधन चादरों की पीढ़ी की अनुमति दी थी। इन अध्ययनों से स्थिर शर्तों के तहत एक दूसरे से स्वतंत्र प्रदर्शन किया गया। वर्तमान अध्ययन में, इन विभिन्नपूरी तरह से विभेदित वयस्क मानव कोशिकाओं से युक्त NT scaffolds के airway, अंतर-सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए इन विट्रो मॉडल में एक physiologically प्रासंगिक उपलब्ध कराने, airway दीवार के एक 3 डी खंड के रूप में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बायोरिएक्टर में अली से कम एक सप्ताह के लिए cocultured किया गया है। इस प्रोटोकॉल एक मॉडल प्रणाली के रूप में वायु-मार्ग bronchiole उपयोग कर रहा है जबकि, यह अन्य अंगों से श्लैष्मिक इकाइयों की 3 डी coculture के लिए एक मंच के रूप में रूपांतरित किया जा सकता है।

Protocol

गैर दमा व्यक्तियों से प्राथमिक एएसएम कोशिकाओं Glenfield अस्पताल रूप में पहले वर्णित (लीसेस्टर, ब्रिटेन) में ब्रोन्कियल बायोप्सी से अलग थे। अनुसंधान लीसेस्टरशायर आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और रोगियों को उनके लिखा है, सूचित सहमति दे दी है।

1. Electrospinning पीईटी Scaffolds (चित्रा 2)

  1. - Trifluoroacetic एसिड (TFA) के समाधान 1 dichloromethane (DCMro): एक 1 में पेय की बोतल ग्रेड पीईटी का एक समाधान (10 एमएल) तैयार करें। 8%, 30% और 10% वजन / मात्रा (WT / खंड) की पीईटी सांद्रता nanofiber, microfiber के लिए आवश्यक और scaffolds के क्रमश गठबंधन और पीईटी भंग करने के लिए तो समाधान हे आरटी पर / एन हलचल कर रहे हैं।
  2. एक सिरिंज में पीईटी समाधान स्थानांतरण और सिरिंज (nanofiber के लिए) एक 23-जी या एक 18-जी (microfiber के लिए और गठबंधन) सुई देते हैं और एक मोटर चालित सिरिंज पंप में सिरिंज जगह है। सुई के बिंदु नीचे करने के लिए घुमाया जा रहा है सुनिश्चित करें।
  3. मा स्थित करेंसुई को सुनिश्चित दूर सुई की नोक से ndrel 15 सेमी, ड्रम के केंद्र में बताया जाता है।
  4. मगरमच्छ क्लिप के साथ सुई टिप करने के लिए बिजली की आपूर्ति देते हैं और पृथ्वी पर (केले सॉकेट) के माध्यम से खराद का धुरा जमीन। Nanofiber और microfiber scaffolds के लिए (लगभग 13.2 मीटर · मिनट -1 के बराबर) 60 rpm के लिए बिजली की खराद का धुरा के लिए आपूर्ति और सेट गति पर स्विच करें। के लिए गठबंधन मचान (लगभग 440 मीटर · मिनट -1 के बराबर) 2,000 rpm के लिए निर्धारित गति से।
  5. 0.5 मिलीलीटर की एक प्रवाह की दर से सिरिंज पंप सेट · घंटा -1 nanofiber यादृच्छिक और गठबंधन मचान या 2.0 मिलीग्राम के लिए · घंटा -1 microfiber scaffolds के लिए। समाधान सुई में किसी भी हवा निकालने के क्रम में सुई की नोक से extruded है जब तक पंप चलाने की अनुमति दें। फिर पंप बंद करो।
  6. सिरिंज पंप पर, समाधान की कुल मात्रा 2 मिलीलीटर के लिए निष्कासित कर दिया और पंप शुरू होने के लिए निर्धारित किया है।
  7. बिजली supp पर सेट वोल्टेज 14 केवी की आपूर्ति, और स्विचly है।
  8. Electrospin समाधान के 2 मिलीलीटर electrospun कर दिया गया है जब तक (nanofiber और गठबंधन scaffolds के लिए 4 घंटा, microfiber scaffolds के लिए 1 घंटा)।
  9. खराद का धुरा की चौड़ाई के साथ एक ब्लेड के साथ पाड़ काटें। यह (इस मामले में, एक आयताकार चादर 22 सेमी x 11 सेमी) पाड़ की एक 2 डी चादर खराद का धुरा सतह क्षेत्र के आकार को ध्यान से खराद का धुरा से खुली किया जा सकता है) पैदा करता है। ) Electrostatic प्रभारी को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में पाड़ स्टोर।
    नोट: Biphasic scaffolds के अनुक्रमिक एक microfiber पाड़ पर सीधे एक nanofiber पाड़ electrospinning द्वारा उत्पादित कर रहे हैं।

सेल संस्कृति में उपयोग करने से पहले scaffolds के 2. बंध्याकरण

  1. पाड़ चादर से, एक 0.8 मिमी व्यास बायोप्सी कलम का उपयोग Biphasic या गठबंधन scaffolds के बाहर डिस्क पंच और गैर विषैले मछलीघर गोंद का उपयोग गैस्केट से चिपके रहते हैं।
  2. एक 20 में भिगोने से पहले scaffolds के प्रत्येक पक्ष पर 30 मिनट के लिए अल्ट्रा वायलेट विकिरण का उपयोग कर scaffolds के जीवाणुरहित% वॉल / खंड antimycotic / एंटीबायोटिक समाधान (2x10 5 इकाइयों मिलीलीटर -1 पेनिसिलिन जी, 2,000 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट और 500 माइक्रोग्राम मिलीलीटर -1 Amphotericin बी) हे / 4 डिग्री सेल्सियस पर एन।
  3. उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के साथ पीबीएस में टीसीपी अच्छी तरह से प्लेट में 3 बार, और उसके बाद दुकान मचान मचान धो लें।

3. सेल संस्कृति मीडिया संघटक

  1. DMEM-F12 के मीडिया में संस्कृति CALU3 उपकला कोशिकाओं (10% वॉल / खंड भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 2 एनएम एल glutamine समाधान, 1% वॉल / खंड एंटीबायोटिक / antimycotic समाधान के साथ 10,000 इकाइयों मिलीलीटर -1 पेनिसिलिन जी, 100 मिलीग्राम पूरक मिलीलीटर -1 स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट और 25 माइक्रोग्राम मिलीलीटर -1 Amphotericin बी)।
  2. DMEM मीडिया में संस्कृति MRC5 तंतुप्रसू और एएसएम कोशिकाओं (10% वॉल / खंड भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 2 एनएम एल glutamine समाधान, 1% वॉल / खंड एंटीबायोटिक / antimycotic समाधान के साथ 10,000 इकाइयों मिलीलीटर -1 पेनिसिलिन जी, 1 पूरक00 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट और 25 माइक्रोग्राम मिलीलीटर -1 Amphotericin बी)।
  3. संस्कृति उपकला-तंतुप्रसू-एएसएम सेल सह संस्कृतियों एक 70:30 DMEM-F12 में: DMEM मीडिया मिश्रण।

Biphasic पाड़ पर तंतुकोशिका और उपकला कोशिकाओं के 4. सीडिंग

  1. एक टिशू कल्चर प्लेट में, DMEM के पूरक मीडिया में scaffolds लेना और सेल बोने से पहले 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. , DMEM के पूरक मीडिया निकालें apically पाड़ की microfiber चरण जगह और DMEM पूरक मीडिया के 30 μl में 1.5 X10 4 MRC5 fibroblast कोशिकाओं बीज। हवा हे / एन में 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 पर एक मशीन में जाने से पहले, 2 घंटे के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर थाली आंदोलन।
  3. इसलिए पाड़ की nanofiber चरण apically चेहरों पर पाड़ की nanofiber चरण पर DMEM-F12 के पूरक मीडिया के 30 μl में, बीज 3.0 X10 4 CALU3 उपकला कोशिकाओं पाड़ मुड़ें और के लिए सेतेआर 70:30 DMEM-F12 में पाड़ जलमग्न होने से पहले हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा, 5% सीओ 2: DMEM के पूरक मीडिया हे / एन पूर्व बायोरिएक्टर को स्थानांतरित करने के लिए।

गुट निरपेक्ष पाड़ पर एएसएम प्रकोष्ठों के 5. सीडिंग

  1. एक टिशू कल्चर प्लेट में, DMEM के पूरक मीडिया में scaffolds लेना और 2 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ के लिए DMEM के पूरक मीडिया के 30 μl में 2.5 X10 4 कोशिकाओं बोने और incubating से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते 2 हवा में)। इनक्यूबेटर और हे छोड़ने के लिए DMEM के पूरक मीडिया बदले में पाड़ डूब / एन बायोरिएक्टर में एक त्रि-संस्कृति को स्थापित करने से पहले।

6. स्थापित करने bioreactor प्रणाली का उपयोग करते हुए त्रि-संस्कृति (चित्रा 7)

  1. उपकला चरण चेंबर में ऊपर का सामना करना पड़ के साथ एक कक्ष के भीतर नाली में Biphasic पाड़ गैसकेट रखें।
  2. Biphasic पाड़ के नीचे गठबंधन पाड़ प्लेस (इसलिए यह मील के निकट हैcrofiber Biphasic पाड़ की चरण) और एक साथ बायोरिएक्टर के दो कक्षों ताला।
  3. (DMEM-F12 / DMEM के पूरक बेसल जलाशय में मीडिया शिखर जलाशय में DMEM-F12 के पूरक मीडिया) दो सर्किट के आसपास है और पंप मीडिया लगभग 0.1 मिलीग्राम / मिनट एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करने में दो मध्यम जलाशयों से जुड़ा दो छिड़काव प्रवाह सर्किट इकट्ठे (40 एमएल मीडिया प्रत्येक सर्किट के माध्यम से साफ किया है)। सदन में 37 डिग्री सेल्सियस, हवा में 5% सीओ 2 में एक मशीन के भीतर प्रणाली के सभी भागों।
  4. एक सप्ताह के बाद, विश्लेषण से पहले एक और सप्ताह के लिए अली पर उपकला कोशिकाओं शिखर कक्ष से मीडिया को दूर, और संस्कृति।

Representative Results

Decellularized airway के ऊतक या हम electrospun पाड़ topographies में शुरू करने की कामना की airway के ईसीएम के वांछनीय विशेषताओं की पहचान की वायु-मार्ग बायोप्सी से immunohistological छवियों की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों: देशी RBM मैट्रिक्स लगभग 30.6 एनएम ± एनएम 153 (एन एसडी मतलब ± = 50 माप तंतुओं के होते हैं ) व्यास में (चित्रा 3 ए व 5 ए), RBM आसपास के मैट्रिक्स, whilst प्रकृति (चित्रा -3 सी) में और अधिक असुरक्षित था। चिकनी पेशी बंडलों के माध्यम से Immunohistological वर्गों कोशिकाओं 21 (3E चित्रा) की गठबंधन शीट के रूप में एएसएम उपस्थित दिखा। यह जानकारी electrospun scaffolds के रूप में शुरू की विशेषताओं मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक घूर्णन खराद का धुरा स्थिरतापूर्वक उच्च गति पर बारी बारी से करने में सक्षम था (> 2,000 आरपीएम / 440 मी · मिनट -1) गुट निरपेक्ष फाइबर के साथ scaffolds के निर्माण करने के लिए। धीरे खराद का धुरा रोटेशन (60 आरपीएम 13.2 मीटर · मिनट -1) फाइबर उन्मुखीकरण को प्रभावित नहीं कियाहै, लेकिन एक स्थिर थाली पर electrospinning जब अधिक से अधिक एक समान मोटाई के साथ scaffolds का उत्पादन किया। Electrospinning मापदंडों (पीईटी एकाग्रता और समाधान प्रवाह की दर) में फेरबदल करके, यह (electrospinning मापदंडों तालिका 1 में कहा जाता है) कई माइक्रोमीटर या नैनोमीटर के सैकड़ों के व्यास के साथ scaffolds फाइबर बनाने के लिए संभव था।

हालांकि इस तरह के कम पीईटी सांद्रता में प्राकृतिक RBM फाइबर (150 एनएम) एक 6% पीईटी समाधान का उपयोग कर उत्पादन किया गया था, के बराबर फाइबर व्यास के साथ Electrospun फाइबर, फाइबर के बीड (चित्रा -4 ए) हुआ। यह 2.4 एनएम ± एनएम 255 के एक औसत व्यास रखने वर्दी nanofibers का उत्पादन किया जो 8% करने के लिए पीईटी समाधान की एकाग्रता में वृद्धि से हटा दिया गया (SEM ± मतलब है) और 1.43 माइक्रोन ± 0.02 माइक्रोन (आंकड़े 4 बी, 5 ए और बी) का औसत ताकना आकार। Nanofibers electrospin करने के लिए यह धीमी प्रवाह दर की अनुमति, 23 जी के लिए 18 जी से सुई के आकार को कम करने के लिए जरूरी हो गया था Whilsएक उच्च प्रवाह वेग को बनाए रखने और सुई रुकावट, बड़ी सुई के साथ एक आवर्ती समस्या को कम करने के टी। कारण उच्च समाधान चिपचिपापन को microfibers, सुई नोक पर कई रुकावटों के अलावा फाइबर व्यास (चित्रा 4F) में एकरूपता की कमी के> 30% पीईटी का नेतृत्व करने के लिए पीईटी समाधान में वृद्धि electrospinning है। माइक्रोन ± 0.02 माइक्रोन 2.50 की औसत फाइबर व्यास रखने वर्दी microfiber मैट 2 एमएल / घंटे की एक प्रवाह की दर में एक 30% WT / खंड पीईटी समाधान electrospinning जब उत्पादन किया गया था और 10.45 माइक्रोन ± 0.13 माइक्रोन की औसत ताकना आकार (± SEM के मतलब है) -1 (आंकड़े 4F, 5 ए और बी)। एक microfiber पाड़ (अब भी खराद का धुरा के साथ संलग्न) पर सीधे nanofiber पाड़ की अनुक्रमिक electrospinning एक Biphasic पाड़ (चित्रा 3 डी) बनाया। औसत फाइबर व्यास, क्रमशः nanofiber और microfiber चरणों के लिए 20 एनएम और 2.30 माइक्रोन ± 0.06 माइक्रोन ± एनएम 280 थेव्यक्तिगत nanofiber और microfiber scaffolds के आयाम के लिए तुलनीय। इसके अतिरिक्त, Biphasic पाड़ की मोटाई व्यक्ति nanofiber और microfiber मचान (चित्रा 5C) की राशि के समान था। खराद का धुरा गति बढ़ाने के माध्यम से (2,000 आरपीएम / 440 मी · मिनट -1), अत्यधिक गठबंधन नैनो या microfiber मचान तैयार किए गए। 8% WT / खंड पीईटी समाधान के लिए एक लहर की तरह आकृति विज्ञान (चित्रा 3F) रखने गठबंधन nanofibers और उत्पादित तंतुओं के उत्पादन के लिए इष्टतम नहीं था। 10% पीईटी के लिए एक वृद्धि इस आशय निरस्त माना है, लेकिन अभी भी एक कम फाइबर व्यास में बेतरतीब ढंग से गठबंधन nanofiber scaffolds के लिए की तुलना में (2.2 एनएम (SEM ± मतलब है) ± एनएम 216) हुई। फाइबर संरेखण मतलब फाइबर कोण से प्रत्येक फाइबर के कोण के विचलन का निर्धारण द्वारा गणना की गई। गठबंधन nanofiber scaffolds में फाइबर की 79% बेतरतीब ढंग से गठबंधन nanofiber Scaff में फाइबर की 10.2% की तुलना में (± 10 ° मतलब फाइबर कोण) गठबंधन किया गयाबच्चों (चित्रा 5D)।

8% nanofiber पाड़ उपकला कोशिकाओं रहते हैं, जिस पर RBM पुनरावृत्ति करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और CALU3 कोशिकाओं की संस्कृति (एक airway उपकला कोशिका लाइन) का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रकृति में और अधिक असुरक्षित जा रहा है 30% WT / खंड microfiber पाड़, उप-श्लैष्मिक क्षेत्र नकल करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और MRC5 कोशिकाओं (एक airway तंतुप्रसू सेल लाइन) के साथ सुसंस्कृत था। Topological संदर्भित प्रदान की 10% WT / खंड गठबंधन nanofiber पाड़ एएसएम सेल संरेखण सुनिश्चित करने के लिए जब पाड़ पर सुसंस्कृत। एक 2 सप्ताह की अवधि (चित्रा 6A) पर अपनी व्यक्तिगत scaffolds पर सुसंस्कृत, और 2 सप्ताह संस्कृति अवधि (चित्रा 6B, 6C, और 6D) के बाद सेल प्रकार विशिष्ट प्रोटीन व्यक्त की है जब सभी तीन सेल प्रकार व्यवहार्यता में वृद्धि देखी गई। अलग-अलग सेल पाड़ बातचीत के आगे लक्षण वर्णन, कहीं और 21 सूचित किया गया है। nanofiber पाड़ की अनुक्रमिक electrospinningmicrofiber पाड़ क्रमशः nanofiber और microfiber चरणों पर CALU3 उपकला कोशिकाओं और MRC5 fibroblast कोशिकाओं के coculture के लिए एक Biphasic पाड़ उत्पादन पर। एक साथ स्थिर शर्तों के तहत दो कोशिकाओं के संवर्धन कहीं और 22 सूचित किया गया है। स्थिर शर्तों के तहत 2 सप्ताह से परे Biphasic संवर्धन बार अन्य सेल परतों को जोड़ने या विस्तार करने का प्रयास कर आगे काम (नहीं दिखाया डेटा) असफल साबित हुई। संस्कृति के लिए एक विस्तारित अवधि के दौरान एक त्रि-स्तरीय मॉडल, हम एक छिड़काव प्रवाह बायोरिएक्टर का इस्तेमाल किया। CALU3 और MRC5 कोशिकाओं Biphasic पाड़ पर वरीयता प्राप्त है, और एएसएम कोशिकाओं वरीयता प्राप्त एक गठबंधन पाड़ पर, और दोनों को 2 दिनों के लिए अलग से सुसंस्कृत थे गया। दो मचान तो बायोरिएक्टर भीतर airway दीवार का एक सप्ताह में तीन परत मॉडल (चित्रा 7) के रूप में करने के लिए एक साथ खरीदा गया था। दोनों कक्षों के शिखर उपकला चैम्बर अपने मीडिया हटा दिया था इससे पहले 7 दिनों के लिए मीडिया के साथ perfused, और उपकला कोशिकाओं में सुसंस्कृत थेएक और 7 दिनों के लिए अली। Scaffolds तय की और या तो sectioned और दाग, या पूरे scaffolds के सेल विशिष्ट मार्करों के लिए immunostained थे। त्रि-परत संस्कृति के माध्यम से धारा coculture (चित्रा 8B) की सभी तीन परतों के माध्यम से वितरित सेल नाभिक दिखाया। कोशिकाओं सेल विशिष्ट मार्करों के लिए immunostained थे, उपकला कोशिकाओं मिला हुआ सेल-परत के रूप में शिखर nanofiber चरण आबादी और cytokeratin के लिए सकारात्मक दाग (चित्रा 8C), microfiber चरण पर, fibroblasts के S100A4 (चित्रा 8D) के लिए सकारात्मक दाग, और पर airway दीवार का 3 डी मॉडल के भीतर प्रत्येक सेल प्रकार की भलाई के अस्तित्व का संकेत SM22α (चित्रा 8E) के लिए सकारात्मक दाग गठबंधन 10% पाड़ एएसएम कोशिकाओं,।

चित्र 1
चित्रा 1. वायु-मार्ग bronchiole। एक गंभीर से ब्रोन्कियल बायोप्सीmesenchymal कोशिकाओं के साथ आबादी अंतर्निहित submucosal क्षेत्र के साथ जालीदार तहखाने झिल्ली (RBM) पर उपकला दिखा दमा वायु-मार्ग, और चिकनी पेशी अल्फा-एक्टिन (ब्राउन) के लिए दाग चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ आबादी के आसपास के चिकनी पेशी बंडलों। स्केल बार 200 माइक्रोन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. electrospinning उपकरण का एक योजनाबद्ध। (संलग्न सुई के साथ) बहुलक / विलायक समाधान युक्त एक सिरिंज खराद का धुरा सामना करना पड़ रहा एक सिरिंज पंप पर रखा गया है। एक बिजली के संभावित सुई और खराद का धुरा के कारण तंतुओं सुई की नोक से निकली और घूर्णन खराद का धुरा पर जमा किया जा करने के लिए के बीच स्थापित है। फाइबर वातावरण के माध्यम से गुजरता है,खराद का धुरा पर बहुलक फाइबर के बयान के कारण विलायक evaporates। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
देशी airway के ईसीएम को electrospun scaffolds के चित्रा 3. तुलना करें। Decellularized तहखाने झिल्ली (ए), क्रॉस सेक्शन (सी) और एक airway चिकनी मांसपेशियों बंडल के ऊतकीय खंड bronchiole decellularized airway की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों (haematoxylin और eosin, पैमाने के साथ दाग बार 40 माइक्रोन) nanofiber (बी के साथ तुलना में (ई)) Biphasic (डी) और गठबंधन (एफ) पीईटी मचान। देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण।

तालिका 1 पैरामीटर microfiber, nanofiber electrospinning के लिए इस्तेमाल किया है और व्यक्तिगत रूप से और Biphasic पाड़ के लिए scaffolds गठबंधन।

चित्रा 4
पीईटी सांद्रता में चित्रा 4. बदलाव फाइबर विशेषताओं। 6%, 8%, 10% (एसी), 25%, 30% और 35% (ईजी) (WT / खंड) पीईटी समाधान से काता electrospun scaffolds के स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों को प्रभावित करता है । इसके अलावा गठबंधन scaffolds के 8% (डी) और 30% से उत्पादित कर रहे हैं (एच) WT / खंड पीईटी समाधान दिखाया। ई 1,000X बढ़ाई imaged एह, 5,000X बढ़ाई imaged। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के संस्करण।

चित्रा 5
Electrospun पीईटी scaffolds के चित्रा 5. गुण। जालीदार तहखाने झिल्ली बाह्य मैट्रिक्स (RBM ईसीएम), बेतरतीब ढंग से गठबंधन नैनो और सूक्ष्म फाइबर मचान, और गठबंधन nanofiber पाड़ से फाइबर व्यास वितरण दिखा (ए) के वितरण घटता। (बी) हिस्टोग्राम नैनो और सूक्ष्म फाइबर scaffolds में रिश्तेदार ध्यान में लीन होना आकार वितरण दिखा। (सी) nanofiber, microfiber, Biphasic और गठबंधन scaffolds के औसत मोटाई (मानक विचलन ± मतलब एन = 6)। (डी) पाड़ फाइबर विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बाहर किया गया था यादृच्छिक या गठबंधन nanofiber scaffolds में मतलब फाइबर उन्मुखीकरण से विचलन दिखा हिस्टोग्राम साजिश है। पीपट्टा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 व्यक्ति scaffolds पर अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं की संस्कृति। (ए) गठबंधन scaffolds पर एएसएम कोशिकाओं के लिए alamarBlue सेल व्यवहार्यता परख परिणाम, CALU3 nanofiber scaffolds पर कोशिकाओं और microfiber scaffolds पर MRC5 कोशिकाओं (SEM के मतलब ± एन = 3- 20)। Nanofiber, microfiber का स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों और गठबंधन फाइबर मचान (बी, सी और डी क्रमशः) और SM22α के लिए दाग vinculin (लाल) और एएसएम कोशिकाओं के लिए दाग ई cadherin (लाल) के लिए दाग CALU3 कोशिकाओं, MRC5 कोशिकाओं की Immunofluorescent छवियों (क्रमशः ई, एफ और जी) अपने सभी विशेष पाड़ पर (लाल)। Hoechst के नाभिक (नीला) के दाग के लिए इस्तेमाल किया गया था, पैमाने बार इंगित करता है 40 &# 181;। एम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
त्रि-परत airway दीवार मॉडल के लिए 7 चित्रा छिड़काव प्रणाली। क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और 2x मीडिया जलाशयों से जुड़ा बायोरिएक्टर पोत (ए) तस्वीर। त्रि-स्तरीय scaffolds के (बी) के योजनाबद्ध। (सी) योजनाबद्ध airway के मॉडल हवा तरल इंटरफेस में आयोजित किया जाता है जब दो बायोरिएक्टर सर्किट की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा पूर्ण 3डी airway दीवार मॉडल। (ए) लाल रंग में डाला श्लैष्मिक परत के साथ airway दीवार की ब्रोन्कियल बायोप्सी, submucosal क्षेत्र हरे रंग में प्रकाश डाला है, और चिकनी पेशी बंडल सोने में प्रकाश डाला। उपकला, तंतुप्रसू और 2 सप्ताह coculture के बाद तय की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ आबादी Biphasic और गठबंधन मचान से मिलकर त्रिकोणीय स्तरित airway दीवार के माध्यम से (बी) की धारा। सेल नाभिक समवर्ती imaged पाड़ reflectance (ग्रे) के साथ DAPI (नीला) के साथ दाग रहे थे। Scaffolds भी cytokeratin (हरा) के लिए दाग CALU3 कोशिकाओं (सी), S100A4 (हरा) (डी), और SM22α (लाल) के लिए दाग चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए दाग MRC5 कोशिकाओं (के साथ, फिक्स्ड और 2 हफ्तों के बाद सेल विशिष्ट मार्करों के लिए immunostained गया ई)। स्केल बार 200 माइक्रोन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


तालिका एक।

Discussion

प्राकृतिक ईसीएम के लिए तुलनीय संरचनात्मक गुणों के साथ पोलीमेरिक तंतुओं electrospin करने की क्षमता, इन वातावरण विश्राम करने के लिए electrospun जा रहा है कई प्राकृतिक या सिंथेटिक पॉलिमर, या बहुलक मिश्रणों के लिए प्रेरित किया। सब कर सकते हैं प्रभाव पाड़ विशेषताओं (बहुलक विकल्प है, बहुलक एकाग्रता, विलायक, सुई टिप दूरी और तापमान सहित) प्रक्रिया मापदंडों का हेरफेर; हालांकि कुछ मानकों, दूसरों के 25 की तुलना में पाड़ गुणों पर अधिक से अधिक प्रभाव हो सकता है। पीईटी फाइबर व्यास को संशोधित करते हैं, तो हम इस्तेमाल बहुलक की एकाग्रता, बहुलक समाधान electrospun था, जिस पर दर, और सुई व्यास होने के लिए मुख्य मापदंडों पाया। गठबंधन तंतुओं electrospinning जब मुख्य मापदंडों (एक घूर्णन खराद का धुरा) का इस्तेमाल किया संग्रह विधि, और जिस गति से खराद का धुरा घूमता रहे हैं। 60 rpm के लिए खराद का धुरा गति को कम करने के माध्यम से, हम उत्पादन बेतरतीब ढंग से गठबंधन scaffolds के अधिक से अधिक पाड़ यूनी दिखाया पायाformity एक फ्लैट कलेक्टर की थाली पर electrospinning की तुलना में।

decellularized airway के ऊतक की विशेषताओं प्रत्येक वायु-मार्ग सेल प्रकार की संस्कृति के लिए विकसित विभिन्न पाड़ topographies के लिए मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए विश्लेषण किया गया। Electrospun nanofibers सेलुलर आंदोलन को प्रतिबंधित करने, whilst वृद्धि हुई मेटाबोलाइट प्रसार के लिए अनुमति देता है कि छोटे से छेद के आकार, लेकिन उच्च समग्र सरंध्रता के कारण तहखाने झिल्ली संरचनाओं को दोहराने के लिए एक आकर्षक पाड़ हैं। 9 electrospinning मापदंडों के अनुकूलन नदीम, पीईटी सांद्रता और प्रवाह दरों की एक सीमा परीक्षण किया गया। सबसे पतला तंतुओं पहले से अन्य समूहों द्वारा इस्तेमाल के लिए एक 6% WT / खंड पीईटी समाधान है, का प्रयोग कर प्राप्त कर रहे थे। बहरहाल, उच्च beading के स्तर, और एकरूपता की कमी लगातार समस्याओं थे। बीड को दूर करने के आरंभिक प्रयास विभिन्न स्रोतों सतह तनाव कम करने के लिए समाधान के लिए, एक cationic surfactant, cetyltrimethylammonium ब्रोमाइड (CTAB) जोड़ने, और परीक्षण शामिलपीईटी की। surfactant के अलावा, लेकिन पूरी तरह से नहीं है, beading की मात्रा कम है। TFA के विलायक समाधान: पीईटी छर्रों का वाणिज्यिक सूत्रों के एक नंबर की कोशिश के बाद, खाना ग्रेड पेय की बोतल पीईटी पेय की बोतलों को काटने और डीसीएम में इन भंग करके, इस्तेमाल किया गया था। पीईटी स्रोत फाइबर एकरूपता में वृद्धि हुई है और फाइबर beading में कमी के परिणामस्वरूप के रूप में इस का उपयोग करना। WT / खंड 8% करने के लिए थोड़ा समाधान एकाग्रता बढ़ती है और (23g करने के लिए 18G) सुई व्यास को कम करके हम लगातार लगभग 250 एनएम के एक फाइबर व्यास के साथ दोष मुक्त nanofibers का उत्पादन किया। Electrospun nanofiber scaffolds के मुश्किल scaffolds के मार्गदर्शन से निपटने बनाने खराद का धुरा से संग्रह पर अत्यधिक इलेक्ट्रोस्टैटिक हो सकता है। इस कताई और उपयोग करने से पहले 70% आईएमएस में भिगोने के बाद एल्यूमीनियम पन्नी में scaffolds भंडारण के द्वारा सुधार किया गया। इस electrospinning प्रक्रिया से पाड़ पर छोड़ दिया अवशिष्ट electrostatic प्रभारी फैलने में मदद करने के लिए दिखाई दिया।

शीर्ष प्रदान करने के लिएधीरे बेतरतीब ढंग से गठबंधन nanofibers उत्पन्न किया गया एक कम एकाग्रता पीईटी समाधान electrospinning द्वारा: ographies airway दीवार के भीतर तीन मुख्य airway के प्रकार की कोशिकाओं के द्वारा सामना करना पड़ा व्यक्तिगत microenvironments के समान है, एक बुनियादी electrospinning प्रोटोकॉल इन प्रकार की कोशिकाओं के लिए तीन अद्वितीय scaffolds के निर्माण करने के लिए अनुकूलित किया गया था पर जो उपकला कोशिकाओं (RBM नकल उतार) वरीयता प्राप्त थे। एक तेज दर से एक उच्च एकाग्रता पीईटी समाधान electrospinning करके, बेतरतीब ढंग से गठबंधन microfibers (एक और अधिक असुरक्षित पाड़ उत्पादन), जो में fibroblasts (RBM नीचे तुरंत उप-श्लैष्मिक क्षेत्र नकल उतार) वरीयता प्राप्त थे उत्पन्न किया गया। खराद का धुरा गठबंधन nanofibers घूर्णन एक उच्च वेग पर एक कम एकाग्रता पीईटी समाधान electrospinning करके, फाइबर दिशा में केंद्रित चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं कोशिकाओं की चादरों गठबंधन, जो उत्पादन पर, उत्पादन किया गया था।

बढ़ी हुई फाइबर व्यास अधिक से अधिक सेल penetratio की इजाजत दी वृद्धि हुई छेद के आकार के लिए नेतृत्वएन मचान में और हां, एक सच्चे 3 डी वातावरण बनाने में मदद। Microfiber के मचान कोशिकाओं पाड़ के भीतर कई विमानों पर बसता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए अध्ययन में fibroblasts की संस्कृति के लिए कार्यरत थे। 30% WT / खंड के लिए पीईटी एकाग्रता में वृद्धि करके, 2.5 माइक्रोन के एक औसत व्यास के साथ पीईटी फाइबर के उत्पादन किया गया था। ग्रेटर व्यास फाइबर (≈ 4 माइक्रोन) एक 35% WT / खंड पीईटी समाधान का उपयोग कर उत्पादन किया गया था, लेकिन पाड़ मोटाई एकरूपता खो गया था, और व्यक्तिगत फाइबर के बीच उच्च परिवर्तनशीलता स्पष्ट किया गया था। Microfiber पाड़ में pores (क्रमशः 1.43 माइक्रोन बनाम 10.45 माइक्रोन) nanofiber scaffolds में मापा जाता है उन लोगों की तुलना में 7 गुना अधिक थे, लेकिन कोशिकाओं की अभी भी स्थिर बोने सीमित सेलुलर पैठ प्रदान की है। इस गतिशील रूप से एक कक्षीय मिक्सर, पहले से प्रभावी होना दिखाया एक विधि का उपयोग कोशिकाओं बोने से सुधार हुआ है।

अति गठबंधन nanofiber scaffolds के एक 10% electrospinning द्वारा बनाया गया थाWT / खराद का धुरा पर वॉल्यूम पीईटी समाधान 2,000 rpm पर घूर्णन (≈ 440 मीटर · मिनट -1)। पीईटी एकाग्रता तंतुओं कम सांद्रता में प्रदर्शित कि एक अनियमित लहर की तरह आकृति विज्ञान को रोकने के लिए 8% से वृद्धि हुई थी। तंतुओं aligning एकाग्रता में वृद्धि हुई है, बावजूद (यादृच्छिक बनाम गठबंधन 216 एनएम बनाम 255 एनएम), औसत फाइबर व्यास कम कर दिया। वे सूख गए पहले बाहर तंतुओं ड्राइंग खराद का धुरा के उच्च गति इस आशय पैदा होने की संभावना है। फाइबर के संरेखण एएसएम कोशिकाओं के संरेखण को प्रभावित किया है, और भी कहीं और 21 विशेषता किया गया है जो एएसएम कोशिकाओं पर अन्य मनोवैज्ञानिक प्रभाव पड़ता है।

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख सीमा के नमूनों का त्याग किए बिना यह निर्धारित करने के लिए असंभव एक विस्तारित समय अवधि में प्रारंभिक सेल लगाव या भेदभाव कर रही है scaffolds में / पर छवि जीवित कोशिकाओं की अक्षमता है। यानी, ठीक कर, यह सबसे अधिक उपयोग संस्कृति अवधि के बाद होता है इसका मतलब हैनमूने आईएनजी और फिर सेल संस्कृति सेल संस्कृति के दौरान नहीं करने के बाद सफल रहा था कि क्या मापने। (गुलाबी) नीले alamarBlue में incubated scaffolds में एक रंग परिवर्तन देखने कोशिकाओं वर्तमान और व्यवहार्य हैं इंगित करता है, लेकिन आदर्श नहीं है। ऐसे जिलेटिन के रूप में Electrospinning अधिक पारदर्शी पॉलिमर scaffolds पर कोशिकाओं visualizing में सहायता कर सकते हैं। हमारे मॉडल के भीतर एक nanofibrous पाड़ की electrospinning इसी तरह उपकला कोशिकाओं रहते हैं, जिस पर घने nanofibers के शामिल वायु-मार्ग RBM की प्रतिकृति, की अनुमति दी। यह पहले से प्रतिरक्षा कोशिकाओं (नहीं दिखाया डेटा) करने में सक्षम हैं, हालांकि संरचनात्मक कोशिकाओं, nanofiber पाड़ 22 के माध्यम से विस्थापित नहीं किया जा सकता है कि दिखाया गया है। एक 3 डी सतह पर विशेष सेल प्रकार के संवर्धन के लिए फायदेमंद नदीम (उपकला और endothelial कोशिकाओं के रूप में), nanofibers के माध्यम से संरचनात्मक सेल प्रवास के इस रोकथाम अन्य प्रकार की कोशिकाओं के संवर्धन के लिए हानिकारक हो सकता है। चिकनी पेशी वीं के माध्यम से विस्थापित करने में असमर्थ हैई गठबंधन nanofiber पाड़ हम (दो प्रकार की कोशिकाओं को अलग गठबंधन पाड़ के लिए विरोध) एक दूसरे का सामना चिकनी मांसपेशियों और fibroblast परतों के साथ त्रि-स्तरीय coculture इकट्ठे हुए। यह कोशिकाओं करीब समानाधिकरण में होने की अनुमति देता है जबकि, वर्तमान अध्ययन एक प्रकार की कोशिका (तंतुप्रसू या चिकनी मांसपेशियों या तो) एक और अधिक लंबे समय तक संस्कृति की अवधि में पूरे परत से आगे निकल जाएगा कि क्या समाप्त नहीं कर सकता। इन सीमाओं के बावजूद, airway दीवार का एक व्यावहारिक सप्ताह में तीन परत मॉडल इन कई सेल प्रकार के बीच बातचीत की जांच के लिए एक वैकल्पिक मंच प्रदान करता है कि विकसित किया गया है। Fibroblasts मैं luminal सतह से 17 के भीतर बाहरी सतह और उपकला कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त चिकनी मांसपेशियों के साथ हाइड्रोजेल एक बेलनाकार कोलेजन के भीतर एम्बेडेड रहे थे, जहां ऐसा ही एक त्रि-स्तरीय अध्ययन हाल ही में प्रकाशित किया गया है। इसी तरह ट्यूबलर अनुमति होगी यहाँ विकसित electrospun scaffolds के यांत्रिक स्थिरता का गठन किया जाना constructs, और एक मौजूदा resea बनी हुई हैआरसीएच हमारे समूह के भीतर लक्ष्य। अध्ययन इस अध्ययन में प्रकाश डाला है, शरीर में हिस्सेदारी के भीतर कई अंगों इस बुनियादी श्लैष्मिक संरचनात्मक इकाई है, और किरायेदारों को संशोधित करने के माध्यम से वायु-मार्ग पर ध्यान केंद्रित किया है जबकि, इसी तरह प्लेटफार्मों रक्त वाहिकाओं, मूत्राशय और सहित एक तहखाने झिल्ली इकाई युक्त ऊतकों के लिए विकसित किया जा सकता है कोलेजन आधारित बहुस्तरीय मॉडल नियोजित किया गया है जहां कॉर्निया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene terephthalate (PET) Lucozade (GSK) bottles N/A Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary
Dichloromethane (DCM) Solvent for PET
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Solvent for PET
Rotating Mandrel Built in house Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented
Syringe Pump Harvard apparatus used in the electrospinning process
DMEM-F12 Gibco Culture medium for CALU3 cells
DMEM Gibco Culture medium for HASM cells
MEM Gibco Culture medium for MRC5 cells
Antibiotic/ antimycotic solution Gibco Media supplement
FCS Gibco Media supplement
Orbital mixer (Orbital shake 503) Stuart Scientific For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds
Peristaltic Pump  Watson Marlow For providing media flow through bioreactor
3DKube Kiyatec Bioreactor for 3D cell culture

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