Introduction
Feltet av regenerativ medisin og tissue engineering er raskt fremme, med gjennombrudd i luftrør og nyre regenerering to bemerkelsesverdige siste prestasjoner. De biomaterialer utviklet i tissue engineering blir mer tilgjengelig, med muligheter til å overføre slike protokoller til mindre spesialiserte laboratorier. Ett felt primet å dra gjennom økende bruk av biomaterialer er in vitro diagnostikk.
In vitro-studier er en viktig plattform for å undersøke intracellulære signalveier innenfor encellete-typer, og har hjulpet avgrense mekanismene bak en rekke sykdoms pathophysiologies. Disse studiene generelt stole på en enkelt celletype som dyrkes som et monolag på vevskultur plast (TCP); en to-dimensjonal (2D) Hard overflate langt mindre elastisk og porøst enn de tre-dimensjonale (3D) miljø cellene blir utsatt for i løpet av et vev eller organ. Dyremodeller har tradisjonelt vært employed å bekrefte effektene vist in vitro også settes til hele vev, og kan også anvendes som pre-kliniske plattformer for å undersøke menneskelige sykdommer. Men forskjellene inter-arter undergrave denne avhengigheten av dyremodeller i vår forståelse av sykdom hos mennesker -. For eksempel er mye forståelse av lungesykdom astma basert på en musemodell på tross iboende forskjeller mellom den menneskelige tilstand, og denne modellen inkludert lite bevis for mastcelleinfiltrasjon av luftveisglattmuskelbunt, eller kapasiteten for spontan sykdomsutvikling inne i dyret modellere 3,4. Det er også etiske betraktninger om bruk av dyremodeller, med "3R" standard of "erstatning, avgrensning, og reduksjon" i dyreforsøk blir oppmuntret i Storbritannia og andre land.
Et attraktivt alternativ ville være reprisen av menneskelig vev in vitro skape strukturs å undersøke samarbeidende natur mellom voksne humane celletyper i en enkelt enhet. Celler eksistere i 3D flercellede strukturer i vev, hver innenfor et unikt mikromiljø. Dyrking av celler på TCP bare tillater kulturen av cellemonolagene, ute av stand til å replikere dette miljøet, eller gi kapasitet for multi-cellekultur. Biomaterialer avansement gir mulighet til å utvikle både naturlige og syntetiske 3D plattformer for cellekultur. Decellularized ECM kan benyttes for 3D cellekultur ved recellularized med andre celletyper, inkludert stamceller 1, men slike protokoller kan være komplisert og tidkrevende, med tilgjengeligheten av vev og i stor grad begrenset av ikke-human opprinnelse. Andre protokoller tillate større kontroll over mobil miljøer opprettet som nanoimprinting, ECM deponering, celle ark teknologier, eller electro. Electro skaper ikke-vevet 3D porøse matter av fiber med diameter fra nanometer til mikrometer, replicating naturlige ECM dimensjoner. Elektrospunnede stillaser blir i økende grad brukt som 3D celledyrknings plattformer -. Manipulering av elektrospinning parametrene muliggjør innviklet kontroll over stillas egenskaper som porestørrelse, fiberdiameter, topografi og innretting, og overflatekjemi. Endringer av slike parametre har blitt vist å direkte påvirke celle adhesjon og vekst, når cellene ble dyrket i isolasjon.
Disse fordelene har blitt utnyttet i den foreliggende studie for å tillate dyrkning av flere celletyper som et enkelt vev 3D-konstruksjon, ved hjelp av luftveiene bronchiole som modell 3D-vevet struktur. Den bronchiole vegg består av tre hovedregioner (Figur 1). Slimhinnene er der luftveis epitelceller sitte på luft-væske-grensesnittet (ALI), noe som gir en viktig barriere mot ytre miljø. De befinner seg på den retikulære basalmembran (RBM), et tett kompakt ECM består hovedsakelig av collagno IV, perlecans og laminins. Den sub-slimhinne lag er funnet direkte under mucosa, et mer porøst område består av flere celletyper, inkludert fibroblaster, myofibroblasts og infiltrerende leukocytter i henhold til sykdomstilstander. Endelig glatt muskelbunter vikle rundt luftveiene i en spiralformet måte, og består av innrettede ark av glatt muskulatur i luftveiene (ASM). Det er glatt muskulatur relative kontraktile tilstand som styrer luftveis tone. Ansettelse av elektrospunnede stillas innenfor lungesystemet hadde inntil nylig vært begrenset til regenerative formål; med en elektrospunnede tracheal erstatning blir vellykket transplantert. Mens vellykket, slik behandling ikke er begrenset i antall, og er fokusert på luftrøret på grunn av den relative enkle natur vevets funksjon. Begrensede eksempler på luftveis modeller som benyttes for in vitro diagnostikk eksisterer, og er i hovedsak fokusert på glattmuskelkontraksjon målinger,. De ikke-toksiske og ikke noen-nedbrytbar polymer polyetylentereftalat (PET) er tidligere blitt elektrospunnede, og ble anvendt i denne undersøkelsen for å sikre stillaser som produseres kan bli lagret i lange perioder uten å forringe (som tillater dem å bli brukt "hyllevare"), og også være passende for stabile cellekultur over lengre tidsperioder. Tidligere studier fra vår gruppe har vist at bruk av tre varianter av en grunnleggende electro protokollen, kan tre individuelle PET elektrospunnede stillaser produseres for å gi optimal topografi for dyrking luftveiene epitel, fibroblast, og glatte muskelceller i isolasjon 21,22 og coculture av luftveiene epiteliale og fibroblast celler 22. Fiber-diameter ble funnet å sterkt påvirke epitelial funksjonalitet 22, og fiberinnrettings tillot dannelse av innrettede ark av glatt muskulatur 21. Disse studier ble gjort seg uavhengig av hverandre under statiske betingelser. I denne studien, disse different stillasene, som inneholder fullt differensiert voksen menneskeceller har blitt cocultured for en uke på ALI i et kommersielt tilgjengelig bioreaktor som et 3D-delen av luftveiene veggen, og gir en fysiologisk relevant in vitro modell for å undersøke luftveis inter-cellulære responser. Mens denne protokollen er ved hjelp av luftveiene bronchiole som et modellsystem, kan det være innrettet som en plattform for 3D coculture av slimhinne enheter fra andre organer.
Protocol
Primære ASM celler fra ikke-astmatiske individer ble isolert fra bronkial biopsier ved Glenfield Hospital (Leicester, UK), som beskrevet tidligere. Forskningen ble godkjent av Leicestershire etikkomiteen og pasienter ga sin skriftlig, informert samtykke.
1. electro PET Stillas (figur 2)
- Fremstille en løsning (10 ml) av drikke flaskekvalitet PET i en 1: 1 diklormetan (DCMro) - trifluoreddiksyre (TFA) løsning. PET-konsentrasjoner på 8%, 30% og 10% vekt / volum (wt / vol) er nødvendig for nanofiber, mikrofiber og innrettet stillasene henholdsvis og deretter omrøres løsningen O / N ved RT i PET å oppløse.
- Overfør PET løsning i en sprøyte og fest en 23-G (for nanofiber) eller en 18-G (for mikrofiber og justert) nål til sprøyten og legg sprøyten i en motorisert sprøytepumpe. Kontroller at nålespissen er rotert til bunnen.
- Plasser mandrel 15 cm fra spissen av nålen, som sikrer nålen er rettet mot midten av trommelen.
- Fest strømtilførselen til nålespissen med krokodilleklemmer og jorde dor (via banan socket) til jorden. Slå på strømforsyningen til stammen og satt fart til 60 rpm (tilsvarer ca 13.2 m · min -1) for nanofiber og mikrofiber stillaser. Innstilt hastighet til 2000 rpm (tilsvarer ca 440 m · min -1) for justerte stillaser.
- Sett sprøytepumpe til en strømningshastighet på 0,5 ml · t -1 for nanofiber tilfeldige og justert stillas eller 2,0 ml · t -1 for microfiber stillaser. At pumpen kan løpe inntil oppløsningen blir ekstrudert fra nålespissen for å fjerne eventuell luft i nålen. Deretter stopper pumpen.
- På sprøytepumpe, sett det totale volum av løsningen for å bli utvist til 2 ml og starte pumpen.
- Set spenningsforsyning til 14 kV, og slå på strømmen supply.
- Electrospin inntil 2 ml oppløsning er elektrospunnede (4 timer for nanofiber og justert stillaser, en time for microfiber stillas).
- Skjær stillas med et blad langs bredden av doren. Dette gir en 2D-ark av stillaset størrelsen av doren overflateareal (i dette tilfelle et rektangulært ark 22 cm x 11 cm), som kan være nøye skrelles av spindelen). Oppbevar stillaset i aluminiumsfolie for å redusere statisk elektrisitet).
Merk: Bifasisk stillaser produseres ved sekvensiell electro en nanofiber stillaset direkte på en microfiber stillaset.
2. Sterilisering av stillas før bruk i cellekultur
- Fra stillaset ark, punch ut plater av bifasisk eller justert stillasene ved hjelp av en 0,8 mm diameter biopsi penn og hold deg til pakning med giftfri akvarium lim.
- Sterilisere stillasene som bruker ultrafiolett bestråling for 30 min på hver side av stillasene før soaking i en 20% Vol / vol antibiotisk / antimykotisk oppløsning (2x10 5 enheter ml -1 penicillin G, 2 000 mg ml streptomycin -1 sulfat og 500 ug ml -1 amfotericin B) O / N ved 4 ° C.
- Vask stillaser med PBS tre ganger, og deretter lagre stillas i TCP brønners plater i PBS ved 4 ° C inntil bruk.
3. Cell Culture Media Bestanddeler
- Culture CALU3 epitelceller i DMEM-F12 medium supplert med 10% volum / volum føtalt kalveserum (FCS), 2 nM L-glutamin-løsning, 1% vol / vol antibiotisk / antimykotisk oppløsning (10.000 enheter ml -1 penicillin G, ble 100 mg ml -1 streptomycinsulfat og 25 mikrogram ml -1 amfotericin B).
- Kultur MRC5 fibroblast og ASM celler i DMEM media supplementert med 10% volum / volum føtalt kalveserum (FCS), 2 nM L-glutamin-løsning, 1% vol / vol antibiotisk / antimykotisk oppløsning (10.000 enheter ml -1 penicillin G, 100 mg ml -1 streptomycinsulfat og 25 mikrogram ml -1 amfotericin B).
- Kultur epitel-fibroblast-ASM celle co-kulturer i en 70:30 DMEM-F12: DMEM media blanding.
4. Seeding fibroblast og Epitelceller på bifasisk Stillas
- I en vevskulturplate, suge stillasene i DMEM-media supplert og inkuber ved 37 ° C i 1 time før såing celle.
- Fjern de DMEM-supplert media, plasserer microfiber fasen av stillaset apikalt og frø 1.5 x10 4 MRC5 fibroblastceller i 30 mL av DMEM-supplert media. Agitere plate på en orbital-rystemaskin i 2 timer, før de forlater i en inkubator ved 37 ° C 5% CO2 i luft O / N.
- Snu stillaset over slik at nanofiber fasen av stillaset står overfor apikalt, frø 3.0 x10 4 CALU3 epitelceller i 30 mL av DMEM-F12-supplert media på nanofiber fase av stillaset og inkuberes for 2 timer ved 37 ° C, 5% CO2 i luft før nedsenke stillaset på 70:30 DMEM-F12: DMEM-media supplert O / N forut for overføring til bioreaktoren.
5. Seeding av ASM Cells på Aligned Stillas
- I en vevskulturplate, suge stillasene i DMEM-media supplert og inkuberes i 1 time ved 37 ° C før såing 2,5 x 10 4 celler i 30 ul DMEM-media supplert og inkubering i 2 timer (37 ° C, 5% CO 2 i luft). Senk stillas i DMEM-supplert media retur til inkubator og la O / N før du setter opp en tri-kultur i bioreaktor.
6. Sette opp Tri-kulturen med bioreaktor System (figur 7)
- Plasser bifasisk stillaset pakningen i sporet i et kammer med epithelial fase vendt opp inn i kammeret.
- Plasser justert stillaset under bifasisk stillaset (slik det er ved siden av microfiber fase av to-fase stillas), og låse de to kamrene i bioreaktoren sammen.
- Monter to perfusjon strømningskretser er koblet til to mellom reservoarer (DMEM-F12-supplert media i apikale reservoaret, DMEM-F12 / DMEM-supplert media i basal reservoar) og pumpe media rundt de to kretsene på ca 0,1 ml / min ved hjelp av en peristaltisk pumpe (40 ml media resirkuleres gjennom hver krets). Huset alle deler av systemet i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i luft.
- Etter en uke, fjerne mediet fra apikal kammeret og kultur epitelcellene på ALI for en ytterligere uke før analyse.
Representative Results
Scanning elektronmikroskop bilder av decellularized luftveisvev eller immunohistologiske bilder fra luftveis biopsier identifiserte ønskelige egenskaper ved luftveis ECM vi ønsket å innføre i elektrospunnede stillas topographies: Native RBM matrise består av fibre ca 153 nm ± 30,6 nm (gjennomsnitt ± SD n = 50 målinger ) i diameter (figur 3A og 5A), mens matrisen som omgir RBM var mer porøs natur (figur 3C). Immunohistologiske seksjoner gjennom glatte muskelbunter viser ASM stede som justert ark av celler 21 (Figur 3E). Denne informasjonen ble brukt til å lede egenskapene introdusert inn i elektrospunnede stillaser. En roterende dor var i stand til stabilt å rotere ved høye hastigheter (> 2000 rpm / 440 m x min -1) for å fremstille stillaser med orienterte fibre. Slow dor rotasjon (60 rpm 13.2 m · min -1) påvirket ikke fiber orientering, Men produserte stillas med mer ensartet tykkelse enn når electro på en statisk plate. Ved å endre den elektrospinnings parametrene (PET konsentrasjon og mengden vaskemiddel) var det mulig å lage stillas fibre med diametere på flere mikrometer eller flere hundre nanometer (elektrospinnings parametre er angitt i tabell 1).
Elektrospunnede fibre med tilsvar fiberdiametere til natur RBM fibre (150 nm) ble produsert ved hjelp av en 6% PET løsning, men på slike lave PET konsentrasjoner, skjedde beading av fibrene (Figur 4A). Dette ble eliminert ved å øke konsentrasjonen av PET-løsningen til 8% som produserte ensartede nanofibers besitter en midlere diameter på 255 nm ± 2,4 nm (gjennomsnitt ± SEM) og gjennomsnittlig porestørrelse på 1,43 um ± 0,02 um (figurene 4B, 5A og B). Å electrospin nanofibers det var nødvendig å redusere p fra 18 G til 23 G, slik tregere strømningsrater whilst opprettholde en høyere strømningshastighet og redusere nål blokkering, et tilbakevendende problem med større nål. Når electromikrofibre, en økning i PET-løsningen til> 30% PET føre til en mangel på ensartethet i fiberdiameter (figur 4F), i tillegg til flere blokkeringer på nålespissen på grunn av høy oppløsningsviskositet. Ensartede mikrofiber matter som har et gjennomsnittlig fiberdiameter på 2,50 um ± 0,02 mikrometer (gjennomsnitt ± SEM) og gjennomsnittlig porestørrelse på 10,45 ± 0,13 um um ble produsert når electro en 30% vekt / vol PET-løsningen ved en strømningshastighet på 2 ml / h -1 (Tall 4F, 5A & B). Sekvensiell electro av nanofiber stillaset direkte på en microfiber stillaset (fortsatt festet til spindelen) skapt en bifasisk stillas (Figur 3D). De gjennomsnittlige fiberdiametere var 280 nm ± 20 nm og 2,30 mikrometer ± 0,06 mikrometer for nanofiber og mikrofiber faser henholdsvissammenlignbare dimensjoner av individuelle nanofiber og mikrofiber stillaser. I tillegg, tykkelsen av den bifasiske stillaset var lik summen av de individuelle nanofiber og mikrofiber stillaser (figur 5C). Gjennom å øke stammen hastighet (2000 rpm / 440 m · min -1), ble svært justert nano- eller microfiber stillaser produseres. 8% vekt / vol PET-løsningen var ikke optimal for fremstilling av innrettede nanofibers og produserte fibre som har et bølgelignende morfologi (figur 3F). En økning til 10% PET opphevet denne effekten, men likevel resulterte i en redusert fiberdiameter (216 nm ± 2,2 nm (gjennomsnitt ± SEM)) sammenlignet med de tilfeldig innrettede nanofiber stillaser. Fiber innretting ble beregnet ved å bestemme avviket av hver fiber vinkelen fra den midlere fibervinkelen. I innrettede nanofiber stillasene 79% av fibrene ble justert (± 10 ° fiber midlere vinkel) sammenlignet med 10,2% av fibrene i tilfeldig innrettet nanofiber stillasåringer (Figur 5D).
8% nanofiber stillaset ble brukt til å rekapitulere RBM som epitelceller bor, og ble brukt til å støtte kultur av CALU3-celler (en luftveier epitelisk cellelinje). Den 30% vekt / vol mikrofiber stillaset, blir mer porøs karakter ble anvendt for å etterligne den sub-mucosal region, og ble dyrket med MRC5-celler (en luftvei fibroblast-cellelinje). 10% vekt / volum justert nanofiber stillaset gitt topologisk henvisning å sikre ASM celle innretting når dyrket på stillaset. Alle tre celletyper viste en økning i levedyktighet når de dyrkes på deres individuelle stillasene i løpet av en periode på 2 uker (figur 6A), og uttrykte celletypespesifikke proteiner etter 2 ukers kultur periode (figur 6B, 6C og 6D). Ytterligere karakterisering av enkeltcelle-stillas interaksjoner er rapportert andre steder 21. Den sekvensielle electro av nanofiber stillasetpå microfiber stillaset produsert en bifasisk stillas for coculture av CALU3 epitelceller og MRC5 fibroblastceller ned på nanofiber og mikrofiber faser hhv. Dyrkingen av de to cellene sammen under statiske betingelser er blitt rapportert andre steder 22. Videre arbeid forsøker å legge til andre cellelagene eller utvide bifasisk dyrknings ganger utover to uker under statiske forhold viste seg mislykket (data ikke vist). Til kultur en tri-lagdelt modell over en lengre periode, brukte vi en perfusjon flyt bioreaktor. Den CALU3 og MRC5 celler ble sådd ut på bifasisk stillaset, og ASM-celler sådd ut på en justert stillaset, og begge ble dyrket separat i 2 dager. De to stillaser ble deretter kjøpt sammen for å danne en tre-lags modell av luftveisveggen i bioreaktoren (figur 7). Begge kamre ble perfusert med media i 7 dager før den apikale epiteliale kammeret hadde sin mediet fjernet, og epitelcellene ble dyrket på denALI i ytterligere 7 dager. Stillasene ble fikset og enten seksjonert og farget, eller hele stillaser ble immunostained for celle-spesifikke markører. Snitt gjennom tri-lags kulturen viste cellekjerner fordelt gjennom alle tre lag av coculture (figur 8B). Når celler ble immunfarget for celle-spesifikke markører, epitelceller fylles den apikale nanofiber fasen som et konfluent cellelaget og farget positivt for cytokeratin (figur 8C), på mikrofiber fase, fibroblaster farget positivt for S100A4 (figur 8D), og videre de fluktende 10% stillaset ASM celler farget positivt for SM22α (figur 8E), noe som indikerer god overlevelse av hver celletype i 3D-modell av luftveisveggen.
Figur 1. airway bronchiole. Bronkial biopsi av en alvorligastmatiske airway epithelium viser på retikulære basalmembran (RBM), med den underliggende submucosal region befolket med mesenchymale celler, og de omkringliggende glatte muskelbunter befolket med glatte muskelceller farget for glatt muskel a-aktin (brun). Scale bar indikerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Et skjematisk av electro utstyret. En sprøyte inneholdende polymer / løsningsmiddel-løsning (med kanyle) plasseres på en sprøytepumpe som vender mot doren. Et elektrisk potensial etableres mellom nålen og doren forårsaker fibre som skal mates ut fra kanylen og avsatt på den roterende doren. Som fiber passerer gjennom atmosfæren,løsemiddel fordamper forårsaker avsetning av polymerfibre på spindelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenligning av elektrospunnede stillasene til mors airway ECM. Scanning elektronmikroskop bilder av decellularized basalmembran (A), decellularized airway bronchiole tverrsnitt (C) og histologisk seksjon av en luftveis glatt muskel bunt (farget med haematoxylin og eosin, skala bar 40 mikrometer) (E) sammenlignet med nanofiber (B) bifasisk (D) og justert (F) PET stillaser. Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Parametere brukt for electromicrofiber, nanofiber og justert stillaser individuelt og for bifasisk stillaset.
Figur 4. Endring i PET-konsentrasjoner påvirker fiberegenskaper. Scanning elektronmikroskop-bilder av elektrospunnede stillasene spunnet fra 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% og 35% (EG) (vekt / vol) PET løsninger . Også vist er i samsvar stillasene produsert fra 8% (D) og 30% (H) vekt / volum PET løsninger. AD fotografert på 5,000X forstørrelse, EH avbildes på 1,000X forstørrelse. Klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.
Figur 5. Egenskaper av elektrospunnede PET stillasene. (A) Distribusjons kurver som viser fiberdiameterfordeling fra retikulære basalmembran ekstracellulære matrise (RBM ECM), tilfeldig justert nano og mikrofiber stillas, og justert nanofiber stillaset. (B) Histogram som viser den relative fordelingen porestørrelsen i nano og mikrofiber stillaser. (C) Gjennomsnittlig tykkelse av nanofiber, mikrofiber, bifasisk og innrettede stillaser (gjennomsnitt ± standardavvik, n = 6). (D) Histogram plott som viser avviket fra middelverdien fiberorientering i tilfeldige eller innrettede nanofiber stillaser Stillas fiber-analyse ble utført ved anvendelse ImageJ programvare. Please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Kulturen i de enkelte celletyper på de enkelte stillaser. (A) alamarBlue celleviabiliteten analyseresultatene for ASM celler på linje stillaser, CALU3 celler på nanofiber stillaser og MRC5 celler på microfiber stillaser (gjennomsnitt ± SEM, n = 3- 20). Scanning elektronmikroskop bilder av nanofiber, mikrofiber og justert fiber stillas (B, C og D henholdsvis) og Immunofluorescent bilder av CALU3 celler farget for E-cadherin (rød), MRC5 celler farget for vinculin (rød) og ASM celler farget for SM22α (rød) på alle sine spesialiserte stillaset (E, F og G henholdsvis). Hoechst ble brukt til å farge kjerner (blå), indikerer skala bar 40 &# 181; m. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Perfusjonssystem for tri-lags airway veggmodell. (A) Fotografi av bioreaktor fartøy forbundet til slangepumpe og 2x media reservoarer. (B) Skjematisk av tri-lags stillaser. (C) Skjematisk av de to bioreaktor kretser når luftveiene modellen er holdt på luft-væske-grensesnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Komplett 3D Airway veggmodell. (A) Bronkial biopsi av luftveis veggen med slimhinnen uthevet i rødt, submucosal regionen uthevet i grønt, og den glatte muskelbunt markert i gull. (B) § gjennom tri-lag airway vegg bestående av bifasisk og justert stillaser befolket med epitel, fibroblast og glatte muskelceller fast etter 2 uker coculture. Cellekjerner ble farget med DAPI (blå) med stillas refleksjon (grå) samtidig avbildes. Stillasene ble også løst og immunostained for celle spesifikke markører etter 2 uker, med CALU3 celler farget for cytokeratin (grønn) (C), MRC5 celler farget for S100A4 (grønn) (D), og glatte muskelceller farget for SM22α (red) ( E). Scale bar indikerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1.
Discussion
Evnen til å electrospin polymere fibre med strukturelle egenskaper er sammenlignbare med naturlige ECM har ført til en rekke naturlige eller syntetiske polymerer eller polymerblandinger blir elektrospunnede å gjenskape disse miljøene. Manipulasjon av prosessparametre (inkludert polymer valg, polymerkonsentrasjon, løsemiddel, nålespissen avstand og temperatur) kan alle påvirke stillas kjennetegn; men noen parametere kan ha større innvirkning på stillas egenskaper enn andre 25,. Når modifiser PET fiberdiameter, har vi funnet nøkkelparametere for å være den konsentrasjon av polymer som anvendes, hastigheten ved hvilken polymerløsning ble elektrospunnede, og nålens diameter. Når electro orienterte fibre nøkkelparametrene er oppsamlingsmetoden (en roterende spindel), og hastigheten ved hvilken foringen roterer. Gjennom å redusere stammen hastighet til 60 rpm, vi fant tilfeldig justert stillasene produsert viste større stillas unimelse i forhold til electro på en flat samler plate.
Karakteristikken av decellularized luftveisvev ble analysert for å gi veiledning for de ulike stillas topographies utviklet for kulturen i hver luftveis celle-type. Elektrospunnede nanofibers er en attraktiv stillaset til å replikere basalmembranstrukturer på grunn av den lille porestørrelsen, men høy total porøsitet som gjør det mulig for økt metabolitt diffusjon samtidig begrenser cellulær bevegelse. 9. Mens optimalisere elektrospinnings parametere, ble en serie av PET-konsentrasjoner og strømningshastigheter testes. De tynneste fibrene ble oppnådd ved hjelp av en 6% vekt / volum PET-løsningen, som tidligere ble brukt av andre grupper. Imidlertid høye nivåer av perler, og en mangel på ensartethet var stadige problemer. Innledende forsøk på å fjerne perler inkludert tilsetning av et kationisk overflateaktivt middel, cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB), til løsningen for å senke overflatespenningen, og testing av forskjellige kilderPET. Tilsetningen av overflateaktivt middel reduseres mengden av perler, men ikke helt. Etter å ha prøvd en rekke kommersielle kilder til PET pellets, ble mat grade drikke flaske PET brukes, ved å kutte opp drikkeflasker og oppløse disse i DCM: TFA løsningsmiddel. Med dette som PET kilde resulterte i en økning i fiber ensartethet og en reduksjon i fiber beading. Ved å øke konsentrasjonen løsningen litt til 8% vekt / vol, og å redusere diameteren nål (18G til 23G) var konsekvent produsert defekt frie nanofibers med en fiberdiameter på tilnærmet 250 nm. Elektrospunnede nanofiber stillasene kan være svært elektro ved henting fra stammen gjør manuell håndtering av stillasene vanskelige. Dette ble forbedret ved å lagre stillasene i aluminiumsfolie etter spinning og suger i 70% IMS før bruk. Dette så ut til å hjelpe spre restelektrostatisk ladning igjen på stillaset fra electro prosessen.
Å yte toppographies ligner de enkelte mikromiljøer som oppdages av de tre hovedluftcelletyper innenfor luftveisveggen, ble en grunnleggende elektrospinning protokoll tilpasset for å frembringe tre unike stillas for disse celletyper: ved hjelp av elektro en lav konsentrasjon PET-løsningen langsomt ble tilfeldig innrettede nanofibers genereres hvorpå epiteliale celler ble sådd (ligne RBM). Ved hjelp av elektro en høyere konsentrasjon PET-løsningen i et raskere tempo, ble tilfeldig innrettede genererte mikrofibre (fremstilling av en mer porøs stillas), inn i hvilken fibroblaster ble sådd ut (ligne sub-slimhinne område umiddelbart under RBM). Ved hjelp av elektro en lav konsentrasjon PET-løsningen på en med stor hastighet roterende spindel innrettet nanofibers ble produsert, på hvilket det glatte muskelceller som er orientert i fiberretningen, produserer innrettet ark av celler.
Økte fiberdiametere føre til økt porestørrelsen, slik at større celle penetration inn i stillaser og så bidra til å skape en ekte 3D-miljø,. Mikrofiber stillaser ble anvendt for kulturen av fibroblaster i undersøkelsen for å sikre at cellene oppholdt seg på flere plan i stillaset. Ved å øke PET-konsentrasjonen til 30% vekt / volum, ble PET-fibre med en gjennomsnittlig diameter på 2,5 um produsert. Større diameter fibre (≈ 4 um) ble fremstilt ved anvendelse av en 35% vekt / vol PET-løsningen, men stillaset tykkelse ensartethet var tapt og større variasjon mellom individuelle fibrene var tydelig. Porene i mikrofiber stillaset var over 7 ganger større enn de som ble målt i nanofiber stillasene (10,45 um vs henholdsvis 1,43 um), men fremdeles statisk såing av cellene tilgjengelig begrenset cellulær penetrasjon. Dette ble forbedret ved dynamisk utsåing av cellene ved hjelp av en orbital mixer, en metode vist seg å være effektiv som tidligere.
Meget justert nanofiber stillaser ble skapt av electro en 10%vekt / vol PET-løsningen på doren roterer ved 2000 rpm (≈ 440 m x min-1). PET-konsentrasjonen ble øket fra 8% for å hindre en uregelmessig bølgelignende morfologi som fibre oppviste ved lavere konsentrasjoner. Til tross for økningen i konsentrasjonen, samkjøre fibrene reduseres den gjennomsnittlige fiber diameter (216 nm vs 255 nm, justert vs. tilfeldig). Den høye hastighet av doren å trekke fibrene ut før de er tørket er egnet til å forårsake denne effekten. Innrettingen av fibrene påvirkes justeringen av ASM celler, og har også andre fysiologiske virkninger på ASM celler som er blitt karakterisert steder 21.
Den store begrensning av denne protokollen er manglende evne til bilde levende celler på / i stillasene gjør første celle-vedlegg eller differensiering over en lengre tidsperiode umulig å fastslå uten å ofre prøver. Dette betyr at de fleste optimalisering skjer etter kultur perioden, dvs. fastsetteing prøver, og deretter måling av hvorvidt cellekulturen var vellykket etter ikke under cellekultur. Observere en fargeendring i stillaser ruges i alamarBlue (blå til rosa) viser celler er til stede og levedyktig, men er ikke ideelt. Electro mer transparente polymerer som gelatin kan hjelpe til med å visualisere celler på stillasene. Den elektrospinning av en nanofibrous stillas i vår modell tillates replikasjon av luftveiene RBM, likeledes består av tett nanofibers som epitelceller bor. Det har tidligere vært vist at strukturelle celler ikke kan migrere gjennom nanofiber stillaset 22, selv om immunceller er i stand til å (data ikke vist). Selv om fordelaktige for dyrking av spesifikke celletyper på en 3D-overflate (for eksempel epithelial og endotelceller), kan dette forhindre strukturell celle migrasjon gjennom nanofibers være skadelig for dyrking av andre celletyper. Som glatt muskulatur er i stand til å migrere gjennom the innrettet nanofiber stillaset vi samlet tri-lagdelte coculture med den glatte muskel og fibroblast lagene vendt mot hverandre (i motsetning til den innrettede stillaset som skiller de to celletyper). Mens dette gjør at cellene skal være i nær apposisjon, kan denne studien ikke fastslå hvorvidt en celletype (enten fibroblast eller glatt muskulatur) vil innhente hele lag over et mer langvarig dyrkningsperiode. Til tross for disse begrensninger, har en levedyktig tri-lags modell av luftveisveggen blitt utviklet som gir en alternativ plattform for å undersøke interaksjonen mellom disse flere celle-typer. En tilsvarende tri-lag studie har nylig blitt publisert hvor fibroblaster ble innleiret i en sylindrisk kollagen I hydrogel med glatt muskel podet på den ytre overflaten og epitelceller i den luminale overflaten 17. Den mekaniske stabilitet av elektrospunnede stillasene utviklede her vil tillate lignende rørformede konstruksjoner som skal dannes, og er fortsatt en strøm reseaRCH mål i gruppa vår. Mens undersøkelsen har fokusert på luftveiene, flere organer i kroppen dele denne grunnleggende mucosal strukturell enhet, og gjennom å endre beboerne fremhevet i denne studien, kan tilsvarende plattformer bli utviklet for vev inneholdende en basalmembran-enhet inkludert blodårer, blære og hornhinnen, hvor kollagen basert lagdelte modeller har blitt ansatt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
| Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
| Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
| Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
| DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
| DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
| MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
| Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
| FCS | Gibco | Media supplement | |
| Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
| Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
| 3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Wenzel, S., Holgate, S. The mouse trap: it still yields few answers in asthma. American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).
- Zosky, G. R., Sly, P. D. Animal models of asthma. Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).
- Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. Animal models of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).
- Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns. Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).
- Paik, I., et al. Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes. Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).
- Williams, C., et al. Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns. Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).
- Schindler, M., et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).
- Schindler, M., et al. Living in Three Dimensions. Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).
- Ahmed, I., et al. Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces. Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).
- Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior. Biomaterials. 20, 573-588 (1999).
- Sun, T., et al. Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers. Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).
- Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).
- Jeffery, P. K. Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study. Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Miller, C., George, S., Niklason, L. Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).
- West, A. R., et al. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).
- Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation. Lab on a chip. , (2014).
- Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).
- Morris, G., et al. Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).
- Morris, G. E., et al. A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication. 6 (3), 035014 (2014).
- Sell, S., et al. The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues. Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).
- Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).
- Dalton, P. D., et al. Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies. Biomaterials Science. 1 (2), 171 (2013).
- Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning. Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).
- Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate). Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).
- Veleirinho, B. Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats. Journal of Polymer. , 460 (2008).
- Balguid, A., et al. Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).
- Shalumon, K. T., et al. Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique. IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).
- Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds. Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
- Rose, J., et al. Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering. Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).
- Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).
- Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium. Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).
- Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes. Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).
- Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).
