Introduction
rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanında hızla trakea ve böbrek rejenerasyon iki önemli yeni başarıları ile devrimler, ilerliyor. doku mühendisliği geliştirilen biyomalzemeler az özelleşmiş laboratuvarlarda tür protokolleri aktarmak için fırsatları ile daha erişilebilir hale gelmektedir. Biyomalzeme kullanımını artırarak faydalanmak için astarlanmalıdır bir alan vitro diagnostik bulunmaktadır.
In vitro çalışmalar tek hücre tipleri içinde hücre içi sinyal yolları araştırmak için önemli bir platform olduğunu ve çok sayıda hastalık patofizyolojilere yatan mekanizmaları tasvir yardımcı olmuştur. Bu çalışmalar genellikle doku kültürü plastik (TCP) bir tek tabaka olarak kültürlü olmanın bir tek hücre tipi güveniyor; daha az esnek ve gözenekli bir üç boyutlu (3D) bir ortam hücrelerden daha iki boyutlu (2D), sert yüzey, bir doku ya da organın içinde maruz kalmaktadır. Hayvan modelleri, geleneksel E olmuşturaynı zamanda bütün dokuya tercüme in vitro tespit etkilerini teyit etmek için mployed, ve aynı zamanda insan hastalıklarının araştırılması, klinik öncesi platformlar olarak kullanılabilir. Ancak, türler arası farklılıkların insan hastalığı anlayışımızda hayvan modellerinde bu güveni zayıflatmak -. Örneğin, akciğer hastalığı, astım çok anlayış küçük hava yolu düz kas demetinin mast hücresi infiltrasyonu kanıtı, ya da hayvan içinde kendiliğinden hastalık gelişimi için kapasite dahil olmak üzere insan durumuna ve bu model arasındaki içsel farklılıklara rağmen bir fare modelinde dayanır 3,4 modeli. İngiltere ve diğer ülkelerde teşvik ediliyor hayvan deney "yerine, arıtma ve azaltma" nin "3R" standardı ile hayvan modellerinde kullanımı ile ilgili etik hususlar da vardır.
Çekici bir alternatif yaratma in vitro yapısında insan dokusunun tekrarlama olacağınıs, tek bir ünitede yetişkin insan hücre türleri arasındaki işbirliği doğasını araştırmak için. Hücreler benzersiz bir mikro-çevre içinde her doku içinde 3D çoklu-hücresel yapılar var. TCP hücrelerin kültürlenmesi sadece bu ortamı çoğaltmak ya da çok hücreli kültür kapasitesi sağlayamaz hücre mono tabakaları, kültür sağlar. Biyomalzeme ilerleme hücre kültürü için doğal ve sentetik 3D platformları hem geliştirme fırsatı sunmaktadır. Kök hücre 1 de dahil olmak üzere başka hücre tipleri ile recellularized olduğunda hücresizleştirilmiş ECM doku sınırlı ve büyük ölçüde insan olmayan kökenli durumu ile, bununla birlikte bu protokoller, karmaşık ve zaman alıcı olabilir, 3D hücre kültürü için de kullanılabilir. Diğer protokoller nanoimprinting, ECM birikimi, hücre tabaka teknolojileri, ya da elektrospinning gibi oluşturulan hücresel ortamlar üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Elektrospinning nanometreden mikrometre arasında değişen çap, r elyafların dokunmamış 3D gözenekli tabakalar oluştururDoğal ECM boyutlarını eplicating. Electrospun iskeleleri giderek 3D hücre kültürü platformları olarak istihdam edilmektedir -. Elektrospinning parametreleri manipülasyonu gibi gözenek boyutu, elyaf çapı, topografya ve uyum ve yüzey kimyası olarak iskele özellikleri üzerinde karmaşık kontrol sağlar. Hücreler izole kültive edildiğinde, bu parametrelerin değişiklikler, doğrudan hücre yapışmasını ve büyümeyi etkilediği gösterilmiştir.
Bu avantajlar bir modeli 3D doku yapısı olarak hava yolu bronşiole kullanarak, tek bir 3D doku yapı olarak birden fazla hücre tiplerinin kültürlenmesini izin Bu çalışmada istismar edilmiştir. Bronşiyol duvarı, üç ana bölge (Şekil 1) oluşur. havayolu epitel hücreleri dış ortama önemli bir bariyer sağlayarak, hava-sıvı arayüzü (ALI) oturup nerede mukoza olduğunu. Onlar retiküler bazal membran (RBM) bulunması, sıkıca kompakt ECM esas collag oluşanen IV perlecans ve Lamininler. alt mukoza tabakası doğrudan mukoza, fibroblastlar, miyofibroblastlar de dahil olmak üzere hastalık koşullarında lökosit infiltre birden fazla hücre tiplerinden müteşekkildir, daha gözenekli bir bölümünün altında bulunur. Sonunda düz kas demetleri bir sarmal biçimde havayolu etrafında sarın ve hava yolu düz kasında (ASM) hizalanmış yaprak oluşmaktadır. Bu havayolu tonunu kontrol pürüzsüz kasının kasılma göreceli durumudur. Pulmoner sistem içinde electrospun iskelelerinin istihdam yakın zamana kadar rejeneratif amaçlı sınırlı olmuştu; bir electrospun trakeal yerine başarılı bir şekilde nakledilen edilir. Başarılı iken, bu tür tedaviler sayıda sınırlıdır ve bağlı dokusunun fonksiyonu göreceli basit doğasına trakea üzerine odaklanmıştır. In vitro teşhis için kullanılan havayolu modellerinin sınırlı örnekleri vardır, ve çoğunlukla düz kas kasılması ölçümlerine odaklanmıştır. toksik-olmayan ve hiçbirn-bozunur polimer polietilen tereftalat (PET) daha önce electrospun edilmiş ve uygun zamanda (onlara "kapalı raf" kullanılmasına izin) bozmadan uzun süre saklanabilir olabilir üretilen iskeleleri sağlamak için bu çalışmada kullanılan ve edildi uzun süreler boyunca kararlı hücre kültürü için. Grubumuzun Önceki çalışmalar temel elektrospinning protokolünün üç varyasyon istihdam üç ayrı PET electrospun iskeleleri kültür havayolu epitel, fibroblast için optimal topografyalarının ve izolasyon 21,22 düz kas hücreleri ve solunum yolu kokültürü sağlamak için üretilebilir göstermiştir epitel ve fibroblast hücreleri 22. Elyaf çapı büyük ölçüde epitel işlevselliği 22 etkilediği bulundu ve fiber hizalama düz kas 21 hizalanmış yaprak nesil izin verildi. Bu çalışmalar, statik koşullar altında, birbirinden bağımsız olarak yapıldı. Bu çalışmada, bu differetam olarak farklılaşmış yetişkin insan hücreleri içeren nt iskelesi, hava yolu arası hücresel yanıtları araştırmak için bir in vitro model fizyolojik ilgili sağlayan hava yolu duvarının 3B bölümü olarak bir ticari olarak temin edilebilir bir biyo-reaktörde ALI az bir hafta boyunca kültive edilmiştir. Bu protokol, bir model sistem olarak hava yolu bronş kullanarak iken, diğer organlarda mukozal birimlerinin 3B birlikte-kültür için bir platform olarak adapte edilebilir.
Protocol
Astmatik olmayan bireylerden alınan birincil ASM hücreleri Glenfield Hastanesi, daha önce tarif edildiği gibi (Leicester, UK) ile bronş biyopsilerinde izole edilmiştir. Araştırma Leicestershire Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve hastaların yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.
1. Elektrospinning PET iskeleleri (Şekil 2)
- - Trifloroasetik asit (TFA) çözelti 1 diklorometan (DCMro) bir 1: içki şişe sınıf PET içeren bir çözelti (10 mi) hazırlanır. 8,% 30 ve% 10,% ağırlık / hacim (ağırlık / hacim) PET konsantrasyonları nano, mikrofiber için gereklidir ve iskeleleri, sırasıyla hizalanır ve PET çözünmesi için daha sonra çözelti, oda sıcaklığında O / N karışmaya edilir.
- Bir şırınga içine PET çözüm aktarın ve şırıngaya (nanolif için) 23-G veya 18 G (mikrofiber ve hizalanmış) bir iğne takılır ve bir motorlu şırınga pompası içine şırınga yerleştirin. Iğne noktası altına döndürülür emin olun.
- Ma yerleştirinİğneyi sağlanması uzağa iğne ucundan ndrel 15 cm, tambur merkezinde işaret edilmektedir.
- Timsah klipler ile iğne ucu elektrik beslemesini takın ve yeryüzüne (muz soketi üzerinden) mandrel topraklayın. Nanolif ve mikrofiber iskeleleri (yaklaşık 13.2 m · min -1 eşdeğer) 60 rpm güç mandrel arz ve set hız açın. Için hizalanmış iskeleleri (yaklaşık 440 m min -1 eşdeğer) 2,000 rpm Set hızı.
- 0.5 ml akış hızına şırınga pompası ayarlayın · hr -1 nanolif rastgele ve hizalanmış iskeleler veya 2.0 ml · hr -1 mikrofiber iskeleleri için. Çözelti iğne herhangi bir havayı çıkarmak için iğne ucu kadar uzatılan kadar pompa çalışmasına izin verin. Sonra pompayı durdurun.
- Şırınga pompası üzerinde, solüsyonun toplam hacmi 2 ml bırakılırlar ve pompayı çalıştırmak üzere ayarlanmıştır.
- Güç SUPP Set gerilimi 14 kV besleme ve anahtarly.
- Electrospin çözeltisi 2 mi electrospun kadar (nano ve hizalanmış İskele 4 saat, mikrofiber iskeleler 1 saat).
- Mandrelin genişliği boyunca bir bıçak ile iskele kesin. Bu (bu durumda, dikdörtgen bir tabaka 22 cm x 11 cm), iskele 2B tabaka göbek yüzey alanı boyutu dikkatle mandrel kazınabilen) üretir. ) Elektrostatik yük azaltmak için alüminyum folyo ile iskele saklayın.
Not: İki fazlı iskeleleri sıralı mikrofiber iskelesi üzerine direkt olarak bir nano iskele Elektrospinning üretilir.
Hücre Kültürü Kullanım öncesi iskelelerinin 2. Sterilizasyon
- Iskele levhadan, 0.8 mm çaplı biyopsi kalem kullanarak bifazik veya hizalanmış iskelelerinin diskleri yumruk ve toksik olmayan akvaryum tutkal kullanarak conta sopa.
- Bir 20'de iliklerine önce iskelelerinin her iki tarafında 30 dakika süreyle ultra viyole radyasyon kullanarak iskeleleri sterilize% Hac / hac antibiyotik / antimikotik solüsyon ile (2x10 5 birim mi -1 penisilin G, 2.000 mg mi -1 streptomisin sülfat ve 500 ug ml -1 amfoterisin B) O / 4 ° C 'de N.
- Kullanılana kadar 4 ° C 'de PBS ile PBS içinde TCP yuvalı plakalar 3 kez ve sonra deposu iskeleleri iskeleleri yıkayın.
3. Hücre Kültürü Medya Bileşenleri
- DMEM-F12 ortam içinde kültür Calu3 epitel hücreleri (% 10 hacim / hacim, fetal sığır serumu (FCS), 2 nM L-glutamin çözeltisi,% 1 hacim / hacim antibiyotik / antimikotik çözümü ile 10,000 ünite ml -1 penisilin G, 100 mg desteklenmiş ml -1 streptomisin sülfat ve 25 ug ml -1 amfoterisin B).
- DMEM ortamında kültür MRC5 fibroblast ASM hücreleri (% 10 hacim / hacim, fetal sığır serumu (FCS), 2 nM L-glutamin çözeltisi,% 1 hacim / hacim antibiyotik / antimikotik çözümü ile 10,000 ünite ml -1 penisilin G, 1 desteklenmiş00 mg ml -1 streptomisin sülfat ve 25 ug ml -1 amfoterisin B).
- Kültür epitelyal fibroblast ASM hücresi ko-kültürler 70:30 DMEM-F12: DMEM ortamı karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
İki Fazlı Scaffold üzerine Fibroblast ve Epitel Hücreleri 4. Tohum
- Bir doku kültürü tabağında DMEM-takviye edilmiş ortam içinde iskeleleri emmek ve hücre tohumlamadan önce 1 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
- DMEM-takviye ortamları çıkarın apikal iskele mikrofiber aşamasını yerleştirin ve DMEM-desteklenmiş medya 30 ul 1.5 x10 4 MRC5 fibroblast hücreleri tohum. Hava O / N 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde bir kuluçka makinesi içinde ayrılmadan önce, 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka çalkalayın.
- Böylece iskele nanolif aşaması apikal yüzleri üzerinde iskele nanolif fazı üzerine DMEM-F12-desteklenmiş medya 30 ul, tohum 3,0 x10 4 Calu3 epitel hücreleri iskele çevirin ve fo inkübeR 70:30 DMEM-F12, skafoldu daldırılması önce havada, 37 ° C'de 2 saat,% 5 CO2: DMEM-takviye edilmiş ortam O / N önceden biyoreaktöre transfer etmek.
Bağlantısızlar Scaffold üzerine ASM Hücreleri 5. Tohum
- Bir doku kültürü tabağında DMEM-takviye edilmiş ortam içinde iskeleleri emmek ve 2 saat (37 ° C,% 5 CO DMEM-takviye edilmiş bir ortam, 30 ul 2.5 x10 4 hücrelerini tohumlama ve inkübe edildi, 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe 2 havada). Inkübatör ve O bırakmak DMEM-desteklenmiş medya karşılığında iskele Batmak / N biyoreaktörde bir tri-kültür kurmadan önce.
6. Ayar-up Biyoreaktör Sistemi kullanılarak Tri-kültür (Şekil 7)
- Epitel faz odasına yukarı bakacak şekilde tek odasının içinde oluğuna bifazik iskele conta yerleştirin.
- Bifazik iskele altına hizalanmış iskele yerleştirin (yani mi bitişikcrofiber bifazik iskele fazı) ve birlikte biyoreaktör iki odadan kilitleyin.
- (DMEM-F12 / DMEM-takviye edilmiş bazal haznesindeki ortam apikal haznesindeki DMEM-F12-takviye edilmiş bir ortam) iki devre çevresinde ve pompa ortam, yaklaşık 0.1 ml / dak bir peristaltik pompa kullanılarak iki orta rezervuar bağlı iki perfüzyon akış devreleri monte (40 mi ortamı her bir devre aracılığıyla geri dönüştürülmektedir). Ev 37 ° C'de, hava içinde% 5 CO2 ile kuluçka makinesi içindeki sistemin tüm parçalar.
- Bir hafta sonra, analizden önce bir başka hafta ALI de epitel hücreleri apikal odasından ortamı çıkarın ve kültür.
Representative Results
Decellularized havayolu dokusu ya da biz electrospun iskele topografyalarına içine tanıtmak istediği havayolu ECM istenen özellikleri tespit havayolu biyopsilerinden immünohistolojik görüntülerin Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri: Yerli RBM matris yaklaşık 30.6 nm ± nm 153 (n ortalama ± SD = 50 ölçümleri liflerden oluşur ) çapı (Şekil 3A ve 5A) RBM çevreleyen matris iken doğası (Şekil 3C) 'de daha çok gözenekli olmuştur. Düz kas demetlerinin aracılığıyla immünohistolojik bölümler hücreleri 21 (Şekil 3E) hizalanmış yaprak olarak ASM hediye gösterir. Bu bilgiler electrospun iskelelerinin sokulan özelliklerini rehberlik kullanıldı. Bir dönen mandrel stabil yüksek hızlarda döndürmek başardı (> 2.000 rpm / 440 m min -1) hizalanmış lifleri ile iskeleleri üretmek. Yavaş mandrel rotasyon (60 rpm 13.2 m · dk -1) lif yönünü etkilemediAma statik plaka Elektrospinning duruma göre daha muntazam kalınlıkta iskeleleri üretti. Elektro parametrelerini (PET konsantrasyonu ve çözelti akış hızı) değiştirerek, bu (elektro parametreleri Tablo 1 'de gösterilmiştir) bir kaç mikrometre veya nanometre yüzlerce çapları iskeleleri lifleri oluşturmak mümkün olmuştur.
Bununla birlikte, düşük PET konsantrasyonlarda doğal RBM liflerin (150 nm), bir% 6 PET çözeltisi kullanılarak üretilmiştir, eşdeğer elyaf çapları electrospun elyafları elyafların boncuk (Şekil 4A) oluştu. Bu 2.4 Nm ± mil 255 arasında bir ortalama çapa sahip düzgün nanolifler üretilen% 8 PET solüsyonu konsantrasyonunun arttırılması ile elimine edilmiştir (ortalama ± SEM) ve 1.43 um ± 0.02 um (Şekiller 4B, 5A ve B) ortalama gözenek boyutu. Nanolifler electrospin için daha yavaş akış hızları sağlayan, 23 G 18 G iğne boyutunu azaltmak için gerekli olduğunu whilsdaha yüksek bir akış hızını muhafaza ve iğne blokajı, büyük iğne ile yinelenen sorunu azaltmada t. Nedeniyle yüksek bir çözelti viskozitesine mikro-iğne ucunda birden tıkanmalar ek olarak, elyaf çapı (Şekil 4F) yeknesaklık eksikliğine>% 30 PET kurşun PET solüsyonundan bir artış electrospinning zaman. Um ± 0.02 um 2.50 arasında bir ortalama lif çapı sahip düzgün mikrofiber hasırlar 2 ml / st bir akış oranında bir% 30 ağırlık / hacim solüsyonu PET electrospinning, üretilen ve 10.45 mikron ± 0.13 um ortalama gözenek boyutuna (ortalama ± SEM) -1 (Şekil 4F, 5A & B). Mikrofiber iskele (hala mandrele bağlı) üzerine direkt olarak nano iskele Sıralı elektro bifazik iskele (Şekil 3D) oluşturuldu. ortalama lif çapları sırasıyla nanolif ve mikrofiber fazları için 20 nm ve 2.30 mikron ± 0.06 mikron ± nm 280 idiBireysel nanolif ve mikrofiber iskelelerinin boyutlarına karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, iki fazlı iskele kalınlığı bağımsız nano ve mikrofiber iskeleleri (Şekil 5C) toplamına benzemektedir. Mandrel hızını artırarak (2.000 rpm / 440 m · dk -1), son derece uyumlu nano veya mikrofiber iskelelerinin üretildi. % 8 ağırlık / hacim PET çözeltisi, bir dalga şeklinde bir yapıya (Şekil 3F) sahip hizalanmış nanolifler ve üretilen elyafın üretilmesi için uygun değildir. % 10 PET artış bu etkiyi iptal, ama yine de düşük bir lif çapı rastgele hizalanmış nano iskeleleri ile karşılaştırıldığında (2.2 nm (± SEM ortalama) ± nm 216) sonuçlandı. Fiber hizalama ortalama elyaf açısı, her elyafın açısının sapmasını belirlenerek hesaplandı. Hizalanmış Nanofiber iskelelerinin liflerin% 79 rastgele hizalanmış nanolif Scaff liflerin% 10,2 oranla (± 10 ° ortalama lif açısı) hizalanmış edildiyaşındakiler (Şekil 5D).
% 8 nano skafold epitel hücreleri bulunan üzerinde RBM özetlemek için kullanıldı ve Calu3 hücre kültürü (bir hava yolu epitel hücre hattı) desteklemek için kullanılmıştır. Doğada daha gözenekli olan% 30 ağırlık / hacim mikrofiber iskeleti, alt mukozal bölge taklit etmek için kullanılır ve MRC5 hücreleri (bir hava yolu fıbroblast hücre hattı) ile kültürlenmiştir edildi. Topolojik referans verilen% 10 ağırlık / hacim hizalanmış nanolif iskele ASM hücre uyum sağlamak için zaman iskele kültüre. 2 haftalık bir süre (Şekil 6A) içinde bireysel iskeleler üzerine kültürlenmiş ve 2 haftalık kültür dönemi (Şekil 6B, 6C, ve 6D) sonra hücre tipi belirli proteinleri eksprese edildiği zaman, tüm üç hücre tipi canlılığında bir artış göstermiştir. Tek tek hücre-iskele etkileşimlerinin daha fazla karakterizasyon, başka bir yerde 21 bildirilmiştir. nano skafoldun sıralı elektromikrofiber iskele sırasıyla nanolif ve mikrofiber aşamalarında üzerine Calu3 epitel hücreleri ve MRC5 fibroblast hücrelerinin kokültürü için bifazik iskele üretti üzerine. birlikte, statik koşullar altında, iki hücre kültür başka 22 bildirilmiştir. Statik koşullar altında 2 hafta ötesinde bifazik kültür kez diğer hücre katmanları eklemek veya genişletmek için çalışırken daha fazla çalışma (veriler gösterilmemiştir) başarısız oldu. Kültür için uzun bir süre boyunca bir üç katmanlı bir model, bir perfüzyon akış biyoreaktör kullanılır. Calu3 ve MRC5 hücreleri iki fazlı yapı iskelesi üzerine ekilir ve ASM Hücreler hizalanmış bir yapı iskelesi üzerinde, ve her ikisi de 2 gün boyunca ayrı ayrı kültürlendi edildi. İki iskeleleri sonra biyoreaktör içinde hava yolu duvarının bir tri-katmanlı modeli (Şekil 7) oluşturmak için bir araya satın alındı. Hem odalar apikal epitel haznesi ortam çıkarıldı olmadan önce 7 gün süreyle ortam ile perfüze ve epitel hücreler kültürlendi edildi7 gün daha ALI. Iskeleleri, sabit ve ya kesitli ve lekeli veya bütün iskeleleri hücreye özel markörler için immunohistokimyasal edildi. Üç-tabakalı kültürü yoluyla Bölümler kokültürü (Şekil 8B) her üç katman arasında dağıtılmaktadır hücre çekirdekleri göstermiştir. Hücreler, hücre spesifik belirteçler için immunosteyn edildi, epitel hücreler konfluent hücre katmanı olarak apikal nano faz doldurulur ve sitokeratin ile pozitif boyanmış (Şekil 8C), mikro elyaf faz, fibroblastlar S100A4 (Şekil 8D) için pozitif boyandı ve üzerine Hava yolu duvarının 3D model içinde her hücre tipi iyi hayatta kalma belirten SM22α (Şekil 8E) için pozitif boyandı hizalanmış% 10 iskele ASM hücreleri.
Şekil 1. havayolu bronşiyol. Şiddetli gelen Bronş biyopsisimezenkimal hücreler ile doldurulan altta yatan submukozal bölge ile retiküler bazal membran (RBM) üzerine epitel gösteren astım havayolu, ve düz kas alfa-aktin (kahverengi) için boyanmış düz kas hücreleri ile doldurulur çevreleyen düz kas demetleri. Ölçek çubuğu 200 mikron gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. elektro ekipmanın şeması. (Ekli bir iğne ile) polimeri / solvent solüsyonu ihtiva eden bir şırınga mandrel bakan bir şırınga pompa üzerine yerleştirilir. Bir elektrik potansiyeli iğne ve mandrel neden fiber iğne ucundan çıkarılır ve döner mandrel üzerine biriktirilecek arasında kurulur. Fiber atmosferi boyunca geçerken,mandrel polimer liflerin birikimi neden çözücü buharlaşır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yerli havayolu ECM electrospun iskelelerinin Şekil 3. karşılaştırılması. Decellularized bazal membran (A), enine kesiti (C) ve bir solunum yolu düz kas demetinin bir histolojik bölüm Bronşiyol decellularized havayolu Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri (haematoxylin ve eosin, ölçek ile boyandı çubuk 40 um) nanolif (B ile karşılaştırıldığında (E)) bifazik (D) ve hizalanmış (F) PET iskelelerinin. görmek için buraya tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonu.
Tablo 1. Parametreler mikrofiber, nanolif electrospinning için kullanılan tek tek ve iki fazlı skafold için iskeleler hizalanır.
PET konsantrasyonlarda Şekil 4. alterasyon elyaf vasıflarına.% 6,% 8,% 10 (AC),% 25,% 30 ve% 35 (EG), (ağırlık / hacim) PET çözeltilerinden ip electrospun iskelelerinin tarama elektron mikroskobu görüntülerini etkileyen . Ayrıca hizalanmış iskeleleri% 8 (D) ve% 30 den üretilmektedir (H) ağırlık / hacim PET çözümleri gösterildiği. AD 1,000X büyütmede görüntülü EH, 5,000X büyütme görüntülü. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.
Electrospun PET iskelelerinin Şekil 5. özellikleri. Retiküler bazal membran ekstrasellüler matriks (RBM ECM), rastgele hizalanmış nano ve mikro fiber iskeleleri ve hizalanmış nanolif iskele fiber çapı dağılımını gösteren (A) Dağıtım eğrileri. (B) Histogram nano ve mikro-fiber iskeleleri göreli gözenek boyutu dağılımını gösteren. (C) nanolif, mikrofiber, bifazik ve hizalanmış iskelelerinin ortalama kalınlığı (ortalama ± standart sapma n = 6). (D) İskele lif analizi ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir rastgele veya hizalanmış nano iskeleleri ortalama lif oryantasyonu sapma gösteren Histogram arsa. Pkira bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. bireysel iskeleleri bireysel hücre tiplerinin kültürü. (A) hizalanmış İskele üzerinde ASM hücreleri için AlamarBIue hücre canlılığı tahlil sonuçları, Calu3 nanofiber iskelelerinin üzerinde hücreleri ve mikrofiber iskeleleri üzerine MRC5 hücreleri (± SEM ortalama n = 3 20). Nanofiber, mikrofiber Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri ve hizalanmış lif iskeleleri (B, C ve D sırasıyla) ve SM22α lekeli vinkülin (kırmızı) ve ASM hücreleri için boyanmış E-kaderin (kırmızı) için boyanmış Calu3 hücreleri, MRC5 hücreleri immunofluorescent görüntüleri (sırasıyla, E, F ve G) ve tüm özel bir platform üzerinde (kırmızı). Hoechst çekirdekleri (mavi) leke için kullanılan, ölçek çubuğu gösterir 40# 181;. M bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Üç katmanlı hava yolu duvar modeli için Şekil 7. Perfüzyon sistemi. Peristaltik pompa ve 2x medya rezervuar bağlı biyoreaktör geminin (A) Fotoğraf. Tri-tabakalı iskeleleri (B) şematik. (C) şematik havayolu modeli hava-sıvı arayüzü düzenlenen iki biyoreaktör devrelerin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8. Tam 3D hava yolu duvar modeli. (A) kırmızıyla vurgulanır mukoza tabakası ile hava yolu duvarının Bronş biyopsisi, submukozal bölgede yeşil vurgulanır ve düz kas demeti altın vurguladı. Epitel, fibroblast ve 2 hafta kokültürü sonra sabit düz kas hücreleri ile doldurulur bifazik ve hizalanmış iskelelerinin oluşan üç katmanlı hava yolu duvarı boyunca (B) Bölüm. Hücre çekirdeği aynı anda görüntülü iskele yansıtma (gri) ile DAPI (mavi) ile boyandı. Iskeleleri da sitokeratin (yeşil) için boyandı Calu3 hücrelerinin (C), S100A4 (yeşil), (D) ve SM22α (kırmızı) için boyanmış yumuşak kas hücreleri için boyanmış MRC5 hücreleri ile (sabit ve 2 hafta sonra hücre spesifik belirteçler için immunohistokimyasal e). Ölçek çubuğu 200 mikron gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1.
Discussion
Doğal ECM'ye benzer yapısal özelliklere sahip polimer lifleri electrospin yeteneği, bu ortamları yeniden electrospun olan bir çok doğal ya da sentetik polimerler ya da polimer harmanları yol açmıştır. Geleni etkisi iskele özelliklerine (polimer seçimi, polimer konsantrasyonu, çözücü, iğne ucu mesafesi ve sıcaklık dahil) işlem parametrelerinin Manipülasyon; ancak bazı parametreler, diğerlerinden 25 den iskele özelliklerine büyük bir etkiye sahip olabilir. PET lif çapı modifiye zaman, kullanılan polimerin konsantrasyonu, polimer çözeltisi electrospun olduğu hızı ve iğne çapı için anahtar parametreler bulundu. Hizalanmış lifleri elektrospinning zaman anahtar parametreleri (dönen mandrel) kullanılan toplama yöntemi ve hızda mandrel döndüğü vardır. 60 rpm mandrel hızını azaltarak sayesinde, üretilen rastgele hizalanmış iskeleleri daha iskele uni gösterdi bulunduuyumunun düz kollektör plaka üzerine elektrospinning karşılaştırıldığında.
Decellularized havayolu dokusunun özellikleri, her havayolu hücre tipi kültürü için geliştirilen çeşitli iskele topografyalarına için rehberlik sağlamak için analiz edildi. Electrospun nanolifler hücre hareketini önleyen ve aynı zamanda artan metabolit difüzyonu için izin veren küçük bir gözenek boyutu, ancak yüksek oranda gözenekliliğine bağlı bazal membran yapıları çoğaltmak için çekici bir skafold olup. 9 elektro parametrelerini optimize ederken, PET konsantrasyonları ve akış oranlarının bir dizi test edildi. ince lifler, daha önce diğer gruplar tarafından kullanılan bir% 6 ağırlık / hacim PET çözeltisi kullanılarak elde edilmiştir. Ancak, yüksek boncuk düzeyleri ve tekdüzelik eksikliği sürekli sorunlar vardı. Boncuk kaldırmak için ilk girişimleri çeşitli kaynaklardan yüzey gerilimini düşürmek için çözeltiye, bir katyonik yüzey aktif madde, setiltrimetilamonyum bromür (CTAB), ekleme ve test dahilPET. surfaktan eklenmesi değil tamamen boncuk miktarı azalır. TFA çözücü solüsyonu: PET peletlerinin ticari kaynaklardan çok sayıda denemeden sonra, gıda sınıfı içecek şişesi PET içecek şişeleri kesme ve DCM içindeki bu çözülmesiyle kullanılmıştır. PET kaynağı fiber homojenliğini bir artış ve elyaf boncuk bir azalma ile sonuçlandı olarak kullanılması. Ağ / hac% 8 hafifçe Çözelti konsantrasyonu artar ve (23 g kadar 18G) İğne çapının azaltılması ile sürekli olarak yaklaşık 250 nm arasında bir lif çapına sahip hatasız nanolifler üretti. Electrospun Nanofiber iskeleleri zor iskelelerinin manuel kullanım yapım mandrelden koleksiyonunda üzerine yüksek elektrostatik olabilir. Bu eğirme ve kullanılmadan önce% 70 IMS ile yıkadıktan sonra, alüminyum folyo içine iskeleleri depolamak sureti ile geliştirilmiştir. Bu Elektrospinning işleminden iskele üzerinde kalan artık elektrostatik yük dağıtmak yardımcı olmak için ortaya çıktı.
Üst sağlamakyavaş yavaş, rastgele hizalanmış nanolifler oluşturulan düşük konsantrasyon PET çözümü elektrospinning: kaynakçalara hava yolu duvarının içinde üç ana havayolu hücre tipleri karşılaştığı bireysel mikroçevrelerde benzer bir temel elektrospinning protokolü bu hücre tipleri için üç benzersiz iskeleleri üretmek için uyarlanmıştır Üzerine epitel hücreleri (RBM taklit) ekilmiştir. Daha hızlı bir oranda daha yüksek bir konsantrasyonu, PET solüsyonundan electrospinning tarafından rastgele hizalanmış mikroelyaflar (daha gözenekli iskele üreten), içine fibroblastlar (RBM hemen altındaki alt-mukoza alan taklit) ekilmiştir oluşturulmuştur. Mandrel hizalanmış nanolifler dönen yüksek hızlı üzerine düşük bir konsantrasyonu, PET solüsyonundan electrospinning olarak, lif yönünde yönlendirilmiş düz kas hücrelerinin hücre yaprak hizalanmış üretilmesi, bunun üzerine, elde edilmiştir.
Artan lif çapı daha büyük hücre penetratio sağlayan artan gözenek boyutuna yoln iskelelerinin içine ve böylece, gerçek bir 3D ortamı oluşturmaya yardımcı olur. Mikrofiber iskeleleri hücrelerin iskele içinde birden düzlemlerde ikamet sağlamak için çalışmaya fibroblastların kültürü için kullanılmıştır. % 30 ağırlık / hacim PET konsantrasyonunu arttırarak, 2.5 um arasında bir ortalama çapa sahip PET lifler üretilmiştir. Daha çaplı elyafı (≈ 4 um)% 35 ağırlık / hacim, PET çözeltisi kullanılarak üretilmiştir, ama skafold kalınlığı homojenliği kayboldu ve tek tek lifler arasındaki yüksek farklılıklar belirgin oldu. Mikro fiber iskele gözenekler (sırasıyla 1.43 mikron vs 10.45 uM) nano iskeleleri ölçülenlerden daha 7 kat daha fazla, ama hücrelerin de statik tohumlama sınırlı hücre penetrasyonu sağlanır. Bu, dinamik bir orbital bir karıştırıcı, daha önce etkili olduğu gösterilmiştir bir yöntem kullanılarak tohum hücreleri ile iyileştirildi.
Son derece uyumlu Nanofiber iskeleleri 10% elektrospinning tarafından oluşturulanağırlık / mandrel üzerine hacim PET çözümü 2,000 rpm'de dönen (≈ 440 m min -1). PET konsantrasyonu elyaflar daha düşük konsantrasyonlarda sergilenen düzensiz bir dalga şeklinde bir yapıya önlemek için% 8 den yükseltilmiştir. Lifleri hizalamak konsantrasyonda artışa rağmen, (rastgele genel hizalanmış 216 nm genel 255 nm), ortalama elyaf çapı azalır. Kuruyan önce lifleri çekme mandreline yüksek hızda bu etkiye neden olması muhtemeldir. liflerin uyum ASM hücrelerinin uyum etkiledi ve aynı zamanda başka bir yerde, 21 karakterize edilmiştir ASM hücreleri üzerinde diğer fizyolojik etkileri vardır.
Bu protokolün en önemli sınırlama örnekleri ödün vermeden belirlemek mümkün uzun bir süre boyunca ilk hücre eki veya ayrıma iskeleleri / 'görüntü canlı hücrelere yetersizliğidir. Yani düzeltmek; Bu en iyi duruma getirme kültür döneminden sonra ortaya çıkar demektirörnekleri ing ve daha sonra, hücre kültürü, hücre kültürü sırasında sonra değil başarılı olup olmadığını ölçmek. (Pembe mavi) AlamarBIue inkübe iskeleler bir renk değişimi gözlemlemek hücreleri mevcut ve yaşayabilir gösterir ama ideal değil. Jelatin gibi elektrospinning daha şeffaf polimerler iskelelerinin üzerinde hücrelerin görselleştirme yardımcı olabilir. Bizim modeli içinde bir nanofibröz iskele Elektrospinning benzer epitel hücreleri ikamet hangi yoğun nanolifler oluşan hava yolu RBM'nin çoğaltma, izin verdi. Bu, daha önce immün hücreleri (veriler gösterilmemiştir) mümkün olmakla birlikte, yapısal hücreler, nano iskele 22 boyunca geçiremez gösterilmiştir. 3B yüzeyi üzerinde spesifik hücre tiplerinin kültür avantajlı iken (epitelyal ve endotelyal hücreleri gibi), nano yoluyla yapısal hücre göçü, bu koruma, diğer hücre tipleri kültürü için zararlı olabilir. Düz kas th yoluyla göç edemiyor gibiE hizalanmış nano skafold (İki hücre tipleri ayırma hizalanmış iskele karşı) birbirine bakan düz kas ve fibroblast tabakaları ile üç tabakalı birlikte-kültür toplandı. Bu hücreler yakın appozisyon içinde olmasını sağlar iken, bu çalışma bir hücre tipi (fibroblast veya düz kas ya) daha uzun bir süre boyunca bütün kültür katmanı sollamak edip sonuçlandırmak olamaz. Bu kısıtlamalara rağmen, hava yolu duvarının uygun bir üç katmanlı modeli bu çoklu hücre türleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için alternatif bir platform sağladığı geliştirilmiştir. Fibroblastlar bir lümen yüzeyi 17 içinde dış yüzey ve epitel hücreleri üzerinde tohumlandı düz kas hidrojel silindirik kollajen içinde gömülmüş olduğu benzer bir üç-tabakalı bir çalışma yakın zamanda yayımlanmıştır. içindeki boru şeklinde sağlayacak Burada geliştirilen electrospun iskelelerinin mekanik stabilite oluşturulacak oluşturur, ve bir akım resea kalırrch Grubumuzun içinde hedefliyoruz. Çalışma bu çalışmada vurgulanan, vücut payı içinde birkaç organları bu temel mukozal yapısal birim ve kiracı değiştirme yoluyla hava yolu odaklanmıştır iken, benzer platformlar kan damarları, mesane ve dahil olmak üzere bazal membran ünitesi içeren dokular için geliştirilmiş olabilir kolajen bazlı çok katmanlı modeller istihdam edilmiştir kornea,.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
| Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
| Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
| Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
| DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
| DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
| MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
| Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
| FCS | Gibco | Media supplement | |
| Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
| Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
| 3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Wenzel, S., Holgate, S. The mouse trap: it still yields few answers in asthma. American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).
- Zosky, G. R., Sly, P. D. Animal models of asthma. Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).
- Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. Animal models of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).
- Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns. Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).
- Paik, I., et al. Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes. Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).
- Williams, C., et al. Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns. Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).
- Schindler, M., et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).
- Schindler, M., et al. Living in Three Dimensions. Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).
- Ahmed, I., et al. Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces. Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).
- Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior. Biomaterials. 20, 573-588 (1999).
- Sun, T., et al. Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers. Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).
- Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).
- Jeffery, P. K. Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study. Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Miller, C., George, S., Niklason, L. Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).
- West, A. R., et al. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).
- Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation. Lab on a chip. , (2014).
- Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).
- Morris, G., et al. Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).
- Morris, G. E., et al. A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication. 6 (3), 035014 (2014).
- Sell, S., et al. The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues. Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).
- Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).
- Dalton, P. D., et al. Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies. Biomaterials Science. 1 (2), 171 (2013).
- Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning. Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).
- Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate). Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).
- Veleirinho, B. Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats. Journal of Polymer. , 460 (2008).
- Balguid, A., et al. Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).
- Shalumon, K. T., et al. Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique. IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).
- Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds. Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
- Rose, J., et al. Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering. Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).
- Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).
- Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium. Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).
- Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes. Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).
- Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).
