Abstract
インビトロ nanotoxicological研究の大多数は、その実用性のための不死化細胞株を使用しています。しかし、不死化細胞株または初代細胞中でのナノ粒子の毒性試験からの結果は、in vitroアッセイのための一次細胞の使用を拡張する必要性を強調し、不一致を示しています。このプロトコルは、マウス肝臓マクロファージの単離、というクッパー細胞、およびナノ粒子の毒性を研究するためのそれらの使用が記載されています。クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、循環するナノ粒子の取り込みを担う細網内皮系（RES）の一部を構成します。ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。コラゲナーゼ消化および密度遠心分離に基づく方法は、Smedsrød らによって開発されたオリジナルのプロトコルから適合されています。ラット肝細胞のために設計さisolationおよび高い収率を提供し、クッパー細胞の高純度（> 95％）（14×10 6マウス当たりの細胞まで）。この分離方法は、洗練された、または高価な装置を必要とし、したがって、複雑さと細胞収量の間の理想的な妥協点を表していません。重いマウス（35〜45グラム）の使用は、単離方法の収率を向上させるだけでなく、非常に門脈カニュレーションの手順を容易にします。 -CNTs F官能基化カーボンナノチューブの毒性は、変性されたLDHアッセイにより、このモデルで測定しました。この方法は、F -CNTsとのインキュベーション後のクッパー細胞膜の構造的完全性の欠如を測定することによって、細胞の生存率を評価します。 F -CNTsにより誘発される毒性は、単離されたクッパー細胞は、ナノ粒子の毒性試験のために有用であることを強調し、このアッセイを使用して、一貫して測定することができます。 nanotoxicologyの全体的な理解は、臨床の翻訳よりEFFIためのナノ粒子の選択を行うこと、そのようなモデルから利益を得ることができますcient。
Introduction
nanotoxicology研究の分野は、ナノ粒子の生物学的効果を特徴づけることを目的とします。 in vivoでの調査に基づいて、毒性試験は、最も正確な方法のまま。しかし、その使用は、コスト、労力と時間の要件1によって制限されます。その試験した条件の数を拡張する-代替案としては、in vitroアッセイであるため、そのシンプルさとインビトロ試験プラットフォーム2 に高スループットの開発の可能性を使用されています。ほとんどnanotoxicological研究は、不死化細胞株を用いたin vitro アッセイを用いて実施されます。しかし、in vivoでの毒性効果3に、これらの実験結果の外挿に関する懸念があります。実際には、不死化細胞株の特性は、それらが由来した組織、 例えば、遺伝的形質転換4、鍵の形態学的特徴の劣化が著しく異なる可能性が5、携帯極性6などの炎症性メディエーター7の調節などの機能変化の損失。
クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、肝臓の類洞の壁の内側を覆うことにより、血液と直接接触しています。細網内皮系（RES）の一環として、これらのマクロファージは、ナノ粒子を循環、したがってのキャプチャを担当している、ナノ粒子の毒性を研究するために非常に適したモデルを構成している。 インビボ 8 in vitroでのナノ粒子に曝露されクッパー細胞に関連する炎症反応の9研究が他の場所で公開されています。クッパー細胞はまた、アルコール性肝疾患10、肝線維症11またはウイルス性肝炎12のような肝疾患の病因に関与しています。これは、INV、単離されたクッパー細胞は、細胞メカニズムを説明するための有用な洞察を提供することが報告されました肝臓破壊13,14にolved。
いくつかの方法は、クッパー細胞を単離し、精製することが報告されています。細胞の単離は、機械的または酵素的解離15から生じ得ます。コラゲナーゼ消化は高クッパー細胞収率16につながるながら、クッパー細胞の機能的完全性を保存することの利点を示しています。複雑さとコストが異なる多くの実験的なアプローチは、他の肝細胞集団からのクッパー細胞を分離するために使用されています。例えば、クッパー細胞の純度は、イムノ17、フロー電気泳動18、選択的接着16によって、またはそれらのサイズおよび密度に応じてセルを選択し、遠心技術16、によって達成することができます。これらの方法の組み合わせは、人口16の純度を高めるように選択することができます。それは、ほとんどのアプリケーションと利用可能なequipmenに依存するようにクッパー細胞の単離のための理想的な方法についての合意はありませんが、T。しかし、ナノ粒子の毒性試験の場合には、単純さとクッパー細胞の機能維持に関連付けられた技術の高い収率は、このアプリケーションのために最も適していると思われました。
ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。この方法は、Smedsrød らが開発した独自プロトコルから変更されました。16は、ラット肝細胞の単離のために設計されています。ほとんどの研究が報告され、ラットの肝臓のクッパー細胞の単離を記載しています。ここで、我々は、高い収率及び純度で、マウス肝臓のクッパー細胞を単離する方法を記載します。マウスの使用は、実験のコストを削減し、いくつかの肝臓の処理は、ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞を大量に得ることができます。
以下のプロトコルは、クッパー細胞を官能基化カーボンナノチューブ（Fと共にインキュベートしました、即ち高い長さ、治療および診断目的のためのベクターとしてのCNTの興味深い候補を行いました。しかし、懸念は、カーボンナノチューブ19の毒性に関して提起されており、in vitro試験で 、新しいの開発は、CNTの生物学的効果の理解を高めることを目指しています。クッパー細胞における毒性は、細胞膜の構造的完全性の欠如に関連しています。これは、上清中に細胞から細胞質酵素LDHの損失によって測定されます。この方法の原理は、従って、任意の放出されたLDHを除去し、セル20に残っているものを測定することです。上清中のカーボンナノチューブの存在は、アッセイ21に干渉するので、これは上清中に放出されたLDHの測定に優先して行われます。
我々は、このシンプルでコスト効率のクッパー細胞の単離メトの使用を提案していますdは、機能クッパー細胞の数が多いを単離します。これは、関連する主要なマクロファージモデルでは、ナノ粒子の範囲の毒性のスクリーニングを可能にします。
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Protocol
全ての動物実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局に準拠して実施されました。実証されているプロトコルは、英国のホームオフィスの規制の指導と承認の下で実施しました
1.灌流および細胞コレクション（図1）
図1：肝灌流マウスを麻酔した後に、消化管は、横方向に門脈（PV）がアクセスできるようにするために、腹部の左側に移動します。 PVはすぐに肝臓内の任意の過剰な圧力を避けるために、破壊されるEGTA / HBSSソリューションと劣るveina静脈（IVC）の遅い流速（1-3 ml /分）を用いてカニューレを挿入します。灌流の最初の分以内、流速は徐々に7ml /分に増加させます。その完全な消化が達成されるまで、コラゲナーゼ溶液を、次いで、10 ml /分で灌流されます。
- Prepaたての材料表に記載されているすべての試薬を再度。
- EGTA（エチレングリコール四酢酸）/ HBSS（ハンクス液）溶液（マウス当たり50ml）と40℃で30分間、コラゲナーゼ溶液（マウス当たり100ミリリットル）を温めます。
- 最初の70％エタノールでポンプフレキシブルチューブを洗浄します。水浴に浸漬遠心分離管にEGTA / HBSS溶液40mlを注ぎ、予め温めておいたEGTA / HBSSソリューションとポンプフレキシブルチューブをすすぎます。
- 確実に呼吸抑制と死の前に無意識を生成するためにバルビツール酸塩を用いて端末麻酔を実行します。女性または男性のCD1マウス（35〜45グラム）には1mg / kg、腹腔内でのフェノバルビトンを注入します。つま先のピンチによって麻酔を確認します。
- 腹部の毛を剃る、70％エタノール溶液を用いて腹部表面を殺菌。
- 腹腔を切断し、腹部の左側に横方向に腸を動かすことにより、門脈および下大静脈を露出させます。
- スターT EGTA / HBSS溶液で1〜3ミリリットル/分の速度でポンプと23グラム蝶の針を使用して、門脈にカニューレを挿入（翼はカット）。 23 G針でカニューレを挿入し、門脈の部分をクランプした後、開かれたマウスの腹部の表面に止血小鉗子鉗子を反転。肝臓は迅速にEGTA / HBSS溶液灌流の最初の30秒以内に淡い必要があります。
- 急速に肝臓での過剰な圧力の建物を避けるために、 下大静脈の下部を切開し、その後灌流の最初の分を介して、7ミリリットル/分に徐々に流量を増加させます。動物は、大静脈穿刺を静脈する二次出血による死亡します。
- EGTA / HBSSソリューション未満の5mlを遠心分離管に残っている場合には、コラゲナーゼ溶液（40〜50ミリリットル）でそれを埋めます。 30秒かけて、10ml /分に徐々に流量を増加させます。
- 5-10秒間隔のために、ピンセットを使用して、 下大静脈に圧力を適用することにより、肝臓うねりを作ります。ティSは（消化中に5〜10倍）を定期的に行うことができます。このステップは、肝細胞の分離を改善し、コラゲナーゼ潅流時間を減少させます。
- コラゲナーゼ溶液未満の10mlを遠心分離管の中に残っている場合には、遠心分離管に予め温めたコラゲナーゼ溶液を40〜50ミリリットル注ぎます。
- 灌流の10〜15分後、約70〜80ミリリットルのコラゲナーゼ溶液の灌流、鉗子で肝臓の表面に小さな圧力を加えます。圧力の記録は、肝細胞が解離されることを示しています。
- ワンピースとして腹腔から肝臓を取り出して、クッパー細胞の単離中20〜30 mlを含む遠心管に入れます。肝細胞の生存率への影響を回避するために3時間の最大期間氷上または4℃で肝細胞を保管してください。
- 氷の上に灌流肝臓を維持しながら、必要に応じていくつかの動物で灌流手順を繰り返します。プールを精製するための3つの肝臓への1つ、ステージ3に進みます。
遠心分離のための密度勾配（図2）の調製
図2：密度勾配の調製すべての操作は、無菌状態下で行われます。 SIPは、10×PBS 1.7 mlの被覆シリカ粒子溶液15.3 mlと混合することによって調製されます。 SIP 5mlの25％のSIP溶液20mlを作るためにPBS 15mlで混合されます。 SIP 10mlの50％のSIP溶液20mlを作るために10mlのPBSと混合します。 50％SIP溶液（20ml）で傾斜している、25％のSIP溶液（20ml）に含む遠心管をゆっくり25mLの血清学的ピペットを使用して追加されます。
- 無菌状態の下で、次のステップ（部2、3＆5）に進み、氷上で、または4℃で細胞を維持します。 10×PBS 1.7 mlの被覆シリカ粒子溶液の15.3ミリリットルを混合することにより、SIP（等張性被覆シリカ粒子溶液）を準備します。 25％のSIP溶液20mlを作るために、PBS 15mlでSIPの5ミリリットルを混ぜます。 50％のSIP溶液20mlを作るために、PBS 10mlでSIPの10ミリリットルを混ぜます。
- 50％のSIP溶液20mlで1遠心管を埋めます。 90°に近い角度で遠心チューブを傾けて、50％のSIP層の表面に触れることなく、25ミリリットルの血清学的ピペットを用いてチューブの側壁に徐々に25％SIP溶液（20ml）に加えます。 25％のSIPソリューションを追加する場合は、漸進的にチューブの角度を減少させます。使用するまで氷上で密度勾配を維持します。
3.クッパー細胞精製（図3）
図3：密度勾配遠心分離および細胞接着によってクッパー細胞の精製は、すべての手順は、無菌条件下で行われます。 （A）グリソン鞘が破裂した後に、肝細胞は、1で濾過します00ミクロンストレーナ。懸濁液は、肝細胞（ペレット）を破棄し、非実質細胞画分（上清）を収集するために×50 gで遠心分離します。この工程を3回繰り返します。非実質細胞は、不連続等張勾配の最上部に添加し、15分間、800×gで遠心分離します。 25％のSIPクッションから収集クッパー細胞は、細胞接着の選択によりさらに精製されます。 （B）細胞を、24ウェルプレートに播種し、30分間37℃、5％CO 2でインキュベートします。非接着細胞を500μlのHBSSで一回洗浄します。クッパー細胞を f -CNTsを細胞に添加することができる場合には、メッキ後に接着形態4時間を表示します。スケールバーは25μmで表す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
- 1灌流肝臓はクッパー細胞の単離培地15mlでペトリ皿に入れてください。 （グリソン鞘を破裂肝臓の膜）はさみを使用し、クッパー細胞の単離培地にすべての肝細胞を放出します。 100μmのセルストレーナーを遠心管に収集することができるためにかかわらず、ソリューションをフィルタリングします。追加の灌流肝臓に灌流手順を繰り返し、（3匹のマウスから45ミリリットルまで、マウスを一回から15ミリリットル）同じ遠心チューブに細胞をプール。
- 4℃で2分間、50×gで細胞懸濁液を遠心。実質細胞（肝細胞）は、ペレットになり、（クッパー細胞を含む）の非実質細胞を上清になります。
- 2分ごとに、50×gで清潔な遠心チューブと遠心分離機で上清を収集します。このステップをさらに3回繰り返します。
- 非実質細胞をペレット化するために15分間、1,350×gで遠心分離します。上清を捨て、クッパー細胞の単離培地10mlにペレットを再懸濁します。
- 2.3で説明したように不連続等張勾配に関して25/50％を非実質細胞溶液を追加します。セント加速度や休憩なしで15分間、850×gでrifuge。
- 50分の25％のSIPインターフェースに近い25％のSIP画分（ 図3）内に濁っ現れる富むクッパー細胞画分をローカライズ。約12ミリリットル濃縮されたクッパー細胞画分の、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて吸引します。クッパー細胞の単離中35〜40 mlを含む遠心チューブに細胞を移します。細胞をペレット化し、4℃で15分間、1,350×gで静かにして遠心混ぜます。
- 予め温めておいたクッパー細胞培養培地5〜10mlの中で上清と再懸濁細胞を捨てます。細胞（血球計）をカウントし、トリパンブルー染色を用いて生存率を測定します。
- /ウェルで5×10 5細胞の密度で24ウェルプレート中の精製非実質細胞をプレート。 37℃、5％CO 2（ 図3）で細胞をインキュベートします。 30分後、静かに置き換える一旦予め温めたハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し、培地を除去新鮮で予め温めておいたクッパー細胞培養培地500μlでそれ（ウェル）。
- 彼らの付着形態を獲得できるようにするために、ナノ粒子を用いた治療の前に37℃で少なくとも4時間、5％CO 2のためのクッパー細胞のままにしておきます。
4.特性
- クッパー細胞の純度
- クッパー細胞生存率を維持するために使用される新鮮なPBS / BSA溶液を調製します。 PBS / BSA溶液500μlで細胞を1回洗浄します。 PBS / BSA溶液を除去し、穏やかなスクレイピングを使用して、新鮮なPBS / BSA溶液500μlのクッパー細胞を切り離します。細胞を24ウェルプレートにプレーティングされている場合、続行するには着脱を容易にするためにハサミでスクレーパーブレードの先端を短縮。チューブ、フローサイトメトリーに細胞を移します。
- 血球計および遠心1,350×gで1×10 5個の細胞を用いて、クッパー細胞をカウントします。 F4 / 80抗体（ニート）の30μlに再懸濁クッパー細胞。よく混ぜ、3室温でインキュベート0分。氷上で染色されていない細胞（抗体とインキュベートしていない）を保持します。
- 5分間1350グラムで、染色された細胞内で遠心分離機をPBS / BSA溶液2mlを添加し、得られた上清を捨てます。 PBS / BSA200μlの染色細胞を再懸濁します。
- フローサイトメトリー分析のために、ゲート万未染色のクッパー細胞、そのサイズ（前方散乱）および粒度（側方散乱）に従って。 FL-1チャンネルでゲートされた細胞の蛍光を分析します。
- 未染色のクッパー細胞のフローサイトメトリー分析に使用したのと同じ設定を維持染色クッパー細胞のための手順を繰り返します。選択し、クッパー細胞の純度を評価するために染色された細胞の蛍光を定量化します。
- クッパー細胞貪食能
- クッパー細胞培養培地（v / v）の蛍光ビーズを0.5％と、メディアを交換し、37℃で4時間、5％CO 2インキュベートします。
- 1,350×gで、二に、非内在化ビーズを、遠心クッパー細胞を除去するために500μlのPBS / BSA溶液中の上清および再懸濁細胞をSCARD。このステップをさらに2回繰り返します。
- フローサイトメトリーチューブにPBS / BSAソリューションおよび転送細胞の500μlの中でかき取りクッパー細胞。
- 1,350×gで遠心分離しクッパー細胞は、PBS / BSA溶液の200μlの上清と再懸濁した細胞を捨てます。
- フローサイトメトリー分析のために、ゲート万未染色のクッパー細胞、そのサイズ（前方散乱）および粒度（側方散乱）に従って。 FL-2チャンネルでゲートされた細胞の蛍光を分析します。
（-CNTs f）は 、化学的に機能カーボンナノチューブの5インキュベーション
- 使用前に15分間の超音波処理により水中のF -CNTs（1mg / ml）の分散液を調製します。F -CNTsは、社内で22用意されています。
- 2倍濃縮したF-CNTを準備 クッパー細胞培養培地中での分散。 超音波処理をするための媒体中に分散されたCNTをF-ステップ5.3に進む前に2分）。
- 各ウェルについて、2×F -CNTs分散液250μlの古いメディアの250μlのを交換してください。未処理のウェル（新鮮なクッパー細胞培養培地の馴化培地+ 250μlと250μl）を、10％のDMSOで処理したウェルを、それぞれ陰性および陽性対照として使用されています。
- 24または72時間、CO 2、37℃で、5％クッパー細胞をインキュベートします。
変更された乳酸脱水素酵素（LDH）アッセイによるクッパー細胞中のF -CNTsの6毒性評価
- 上清を捨てます。
- 溶解バッファーの（24ウェルプレートのウェルあたり）200μlを添加して、30分〜1時間、37℃でインキュベートします。
- 激しいピペッティングを行った後、細胞と細胞の破片によって取り込まれた-CNTs fをペレット化し、10分間40,000×gでマイクロ遠心チューブと遠心分離機に溶解したクッパー細胞を収集します。
- に上清（ƒ-CNT無料）を収集マイクロ遠心チューブ、-20℃で保存または）は、6.5に進みます。
- 96ウェルプレートに50μLを移し、各ウェルに基質混合溶液（LDHキット）の同体積を追加します。プレートをカバーし、停止溶液（LDHキット）を50μlを添加する前に室温で15分間インキュベートします。溶解緩衝液50μlを、基質混合液50μlの停止溶液50μlを含むブランクウェルの三重を加えます。
- マイクロプレートリーダーで490 nmの吸光度を読んで、（％）細胞生存率を計算するために、次の式を使用しています。
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Representative Results
非精製実質細胞の数が一致したと（17単離を行った）は、マウスあたり10 6 8〜14×細胞の範囲でした。各マウスの単離は、16から28をプレートウェルに十分でした。トリパンブルー染色によって細胞生存率は、細胞生存率〜95％を示しました。クッパー細胞は、その不完全な接着形態（ 図4A）に関連し、37℃でのインキュベーションの30分以内に丸い形状を示しました。 4時間インキュベーションし、その後に、細胞を広げ、細胞クラスターを形成するために開始しました。
クッパー細胞は、その後、それらの純度および食作用活性を確認するために特徴付けました。細胞は、クッパー細胞の純度を証明するために、F4 / 80抗体で染色しました。フローサイトメトリー分析は、95％（ 図4B）の上にクッパー細胞の純度を示しました。細胞は、大きな粒子を取り込む能力を確認するために、1ミクロン蛍光ビーズ、メッキ後12時間、インキュベートしました。股関節を示したフローサイトメトリー分析Tクッパー細胞の85％以上が1ミクロンビーズ（ 図4C）を取ることができ、すなわち 、食作用です。培養72時間後、クッパー細胞の40％は、クッパー細胞が部分的に彼らの食作用活性を失ったことを示す、貪食しました。
24および72時間F -CNTsと共にインキュベートクッパー細胞の顕微鏡画像は、ナイーブ細胞（ 図5A）と比較して同様の細胞形態を明らかにしました。 10％DMSO（ポジティブコントロール）と共にインキュベートし、クッパー細胞が壊死形態（ 図5A）を示しました。修正されたLDHアッセイの分析に続いて、24および72時間、10％DMSO（ポジティブコントロール）で処理したクッパー細胞は、高毒性（ 図5B）を示しました。比較において、f -CNTsは、細胞が72時間（ 図5B）、50μgの/ mlで暴露しただけで、細胞生存率のわずかであるが有意な減少を誘導しました。
図4：クッパー細胞の純度及び取り込み能力（A）30分または5％のCO 2の雰囲気で37℃で24時間後にメッキクッパー細胞の顕微鏡画像。スケールバーは50μmでを提示します。 （B）クッパー細胞のフローサイトメトリー分析は、FSC / SSCゲーティングセルに従って行いました。クッパー細胞の純度は、F4 / 80抗体染色を用いて決定し、95％以上であることが示されました。 （C）クッパー細胞は、それらの食作用活性を評価するために、1μmの蛍光ビーズの存在下で4時間インキュベートしました。クッパーの機能特性は、3日後に試験した細胞と比較して、新たに単離された細胞で（プレーティング後12時間）をよりよく維持しました。
図5：取り込みおよび毒性 <クッパー細胞における em>のF-CNTを。（A）クッパー細胞の顕微鏡画像。画像は、24および72時間、37℃でF -CNTsの10％DMSO及び50μg/ mlを処理したクッパー細胞を示します。スケールバーは50μmでを提示します。 （B）変性LDHアッセイ。低い細胞生存率を f -CNTsが著しくのみ72時間の50μg/ mlに解説した後、細胞生存率に影響を与えながら、10％のDMSO処理細胞（陽性対照）に認められました。 * P（10％DMSOの条件を除く）ナイーブ条件<0.05相対Tukey検定による事後解析で分散分析（一方向ANOVA）を使用して。スケールバーは50μmでに対応しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
次の手順では、高収率とクッパー細胞の高い生存率を達成することが重要です。無菌状態は、細菌および真菌の汚染の危険性を制限するために使用されるべきです。すべての器具は、使用前に滅菌する必要があります。試薬は、新たに単離手順を実行する前に準備する必要があります。
コラゲナーゼIVの選択は、低いトリプシン活性を有する、非常に重要です。同一の供給者からの異なるロットは、異なる酵素活性を有し、それらは、クッパー細胞の単離のために最も適切なバッチを選択するために、最初に比較する必要があるかもしれません。これは、細胞収量および細胞生存率を評価することによって判断することができます。また、同様の用途のために使用されているバッチを提供するために、サプライヤーに連絡することをお勧めします。一度使用するバッチを決定し、将来の使用のために予約。
カニューレ挿入手順は、トレーニングを必要とします。門脈と自信を持ってになるために、いくつかの動物の使用を計画カニューレ挿入手順。実践では、成功した挿管を容易に達成され、手続きは、一人で扱うことができます。重い動物の使用は、門脈の直径が増加し、そのための手順を容易にすることに注意してください。門脈の背面壁が穿孔されている場合、それは、この手順を使用して新しい場合は特に、再び静脈にアクセスすることは技術的に困難であり、従って、それは、新しい動物で開始することが好ましいです。
HBSSとコラゲナーゼ溶液は、そのpHを7.4に調整し、37℃の蠕動ポンプからの出力温度を達成するために、40℃に予熱したことがある必要があります。 EGTAを含むEGTA / HBSS溶液で灌流（のCa 2+およびMg 2+無料）は細胞間相互作用を弱める、デスモソームという名前のCa 2+依存性の接着分子の破壊のために必要とされます。コラゲナーゼIV型は、細胞外マトリックスからの肝細胞を剥離し、その肝臓に導くために使用されます細胞解離。二つの溶液は、CD1マウスのために15分を超えてはならないが、そのようなC57BL / 6などの他の株は、わずかに長い肝臓消化時間を必要とするための灌流時間。
成功した分離を達成するためには、高い細胞収率および生存率を得ることが必要です。実験者は、肝細胞の単離には経験を持っていない場合は、50×gで第3の遠心分離からの肝細胞ペレットを組み合わせて、トリパンブルー排除アッセイによって細胞をカウントすることをお勧めします。肝細胞の収率は> 20×10 6細胞と肝細胞の生存率> 50％であるべきです。低収量はクッパー細胞収率を低下させるために、間接的にリードする貧しい細胞解離から、本質的に生じます。これは、肝臓が正常に灌流段階の終わりに消化されていることを確認する必要があります。適当な肝細胞の収率が低い肝細胞の生存率との組み合わせで実現されている場合、これは、過度のコラゲナーゼ消化から生じ得るが、より可能性が不適切な肝臓によって説明されます灌流プロシージャまたは汚染された試薬/材料の使用。
めっき後、クッパー細胞は敏感で、穏やかに洗浄する必要があります。少なくとも4時間は、それらの付着形態を獲得するクッパー細胞のために必要とされます。クッパー細胞のプレーティング後1日以内に最大食作用活性を示すように処理は、一般的に、めっき後4~24時間行われます。
我々のプロトコルでは、接着による密度勾配遠心分離および選択によりクッパー細胞を精製したCD1マウス肝細胞の解離を説明します。クッパー細胞の特徴付けは、フローサイトメトリーによって、クッパー細胞の高い収率および純度は、この方法を用いて達成することができることを示しています。
このクッパー細胞単離方法は、複雑さおよび細胞収率の間の貴重な妥協を表します。しかし、このような説明によってプロトコルとして、特定のクッパー細胞法は実施するのが容易であることができることが報告されていますWu ら 、肝臓を消化するエクスビボ23。しかし、ウーらによって記載された方法。細胞の制限された量と低い細胞の純度をもたらします。より高い収率と純度が得られたが、高価および/または高度な機器を必要とし、時間を消費することができますすることができます。
Smedsrød ら 16によって開発されたオリジナルのプロトコルは、パーコール勾配と表面付着によるさらなる精製の ためのより低いパーコールクッションの選択に続いて遠心分離2段階灌流法（HBSS +コラゲナーゼ消化）に基づいて、同等のプロトコルを使用していました。遠心分離手順を変更し、上部パーコールクッションを収集することにより、我々は肝臓のグラム当たり8.2×10 6細胞に5.25×10 6から濃縮クッパー細胞画分を増加させました。この改善は、肝細胞の分離を容易にするために初期の灌流工程中EGTAの使用に起因し得ます。 Moreover、フローサイトメトリー分析の使用は、クッパー細胞の純度および食作用活性の信頼性の定量的な特徴付けを可能にしました。マウス肝臓当たり14×10 6精製された非実質細胞の最大収量と。本発明の分離方法は、文献24に報告されているものにマウス肝臓あたりのクッパー細胞のより高い量を達成します。この改善は、他の方法24に比べ重いマウス（35〜45グラム）を用いて説明することができます。細胞収率の増加の横に、大きな動物の使用を大幅に門脈カニュレーションの手順を容易にします。
インビトロ試験でハイスループットは、したがって、ナノ粒子の in vivo毒性の影響を模倣する、このプライマリ食作用モデルを用いて行うことができます。 nanotoxicologyの全体的な理解は、臨床翻訳のためのナノ粒子の選択をより効率的に、このようなモデルから利益を得ることができます。また、に沿ったものです動物、生物医学研究における3 R（還元、改良と交換）の概念を実装します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
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