Abstract
Det store flertallet av in vitro nanotoxicological studier har brukt foreviget cellelinjer for deres praktiske. Men resultatene fra nanopartikkel toksisitet testing i foreviget cellelinjer eller primære celler har vist avvik, fremhever behovet for å utvide bruken av primærceller for in vitro. Denne protokollen beskriver isoleringen av muselever makrofager, kalt Kupffer-celler, og deres anvendelse for å studere nanopartikkel toksisitet. Kupffer-celler er de mest tallrike makrofagen befolkningen i legemet og utgjør en del av det retikuloendoteliale system (RES), som er ansvarlig for fangst av sirkulerende nanopartikler. Den Kupffer celleisolasjon metode som er rapportert her, er basert på en 2-trinns metode perfusjon, fulgt av rensing på tetthets-gradient. Fremgangsmåten basert på kollagenase fordøyelse og tetthetssentrifuge, er tilpasset fra den opprinnelige protokoll utviklet av Smedsrød et al. designet for rottelever celle isolation og gir høyt utbytte (opptil 14 x 10 6 celler per mus) og med høy renhet (> 95%) av Kupffer-celler. Denne isolasjonen metoden ikke krever sofistikert utstyr eller kostbart og representerer derfor et ideelt kompromiss mellom kompleksitet og celleutbyttet. Bruken av tyngre mus (35-45 g) forbedrer utbyttet av isolasjonsmetoden, men letter også bemerkelsesverdig at fremgangsmåten i portvenen kanylering. Toksisiteten av funksjon karbon nanorør f -CNTs ble målt i denne modell av den modifiserte LDH analysen. Denne fremgangsmåte vurderer cellelevedyktigheten ved måling av mangelen på strukturell integritet av Kupffer cellemembranen etter inkubasjon med f -CNTs. Toksisitet indusert av f -CNTs kan måles ved hjelp av gjennomgående denne analysen, fremhever det isolerte Kupffer celler er nyttige for nanopartikkeltoksisitetstesting. Den generelle forståelsen av nanotoxicology kunne ha nytte av slike modeller, noe som gjør nanopartikkel utvalg for klinisk oversettings flere effstrekkelig.
Introduction
Feltet av nanotoxicology undersøkelser tar sikte på å karakterisere biologiske effekten av nanopartikler. Toksikologiske studier basert på in vivo undersøkelser forbli de mest nøyaktige metoder. Imidlertid er bruken begrenset av sine kostnader, arbeids- og tidskrav 1. Som alternativer, in vitro-analyser er blitt brukt på grunn av sin enkelhet og muligheten for å utvikle høy gjennomstrømming in vitro testing av plattformene 2 - så som strekker antall testede betingelser. De fleste nanotoxicological studier er utført ved hjelp av in vitro-forsøk med immortaliserte cellelinjer. Men det er bekymringer angående ekstrapolering av disse eksperimentelle funnene til in vivo toksikologiske effekter tre. Faktisk kan egenskapene til udødeliggjorte cellelinjer bli vesentlig forskjellig fra vev de var avledet fra, for eksempel genetisk transformasjon 4, forringelse av nøkkel morfologiske egenskaper5, tap av mobilnettet polaritet 6 og funksjonelle endringer som reguleringen av betennelsesmediatorer 7.
Kupffer-celler er de mest tallrike makrofagen befolkningen i kroppen og er i direkte kontakt med blod ved foring av veggen av leversinuskurver. Som en del av retikuloendoteliale system (RES), disse makrofager er ansvarlig for fangst av sirkulerende nanopartikler, og derfor utgjør en svært egnet modell for å studere nanopartikkel toksisitet. In vivo 8 og in vitro ni studier av betennelsesreaksjoner i forbindelse med Kupffer celler eksponert for nanopartikler er publisert andre steder. Kupffer cellene har også vært involvert i patogenesen av leversykdommer som alkoholisk leversykdom 10, leverfibrose 11 eller viral hepatitt 12. Det ble rapportert at isolerte Kupffer celler gi nyttig innsikt for å beskrive cellular mekanismer involved i leveren avbrudd 13,14.
Flere metoder har blitt rapportert å isolere og rense Kupffer celler. Celle isolasjon kan skyldes mekaniske eller enzymatisk dissosiasjon 15. Collagenase fordøyelsen viser fordelen av å bevare den funksjonelle integritet Kupffer celler, mens fører til høyt Kupffer celle yield 16. Mange eksperimentelle tilnærminger, som varierer i kompleksitet og kostnader, er blitt anvendt for å separere Kupffer-celler fra andre levercellepopulasjoner. For eksempel kan Kupffer celle renhet oppnås ved immunoaffinitets 17, 18 strømnings elektroforese, selektiv adhesjon 16 eller ved sentrifugal teknikker 16, som velger celler i henhold til deres størrelse og tetthet. Kan velges en kombinasjon av disse metoder for å øke renheten av befolkningen 16. Det er ingen enighet om den ideelle metoden for Kupffer celle isolasjon, som det meste avhenger av programmet og tilgjengelige utstyrt. Imidlertid, i tilfelle av nanopartikler toksisitetstesting, enkelhet og høyt utbytte av teknikken i forbindelse med det funksjonelle bevaring av Kupffer-celler viste seg å være mest egnet for denne anvendelse.
Den Kupffer celleisolasjon metode som er rapportert her, er basert på en 2-trinns metode perfusjon, fulgt av rensing på tetthets-gradient. Metoden ble modifisert fra den opprinnelige protokoll utviklet av Smedsrød et al. 16 beregnet for rottelever celleisolasjon. De fleste studier har vist og beskrevet isoleringen av Kupffer-celler fra rotte-lever. Heri beskrives en metode for å isolere Kupffer-celler fra muselever, i et høyt utbytte og renhet. Bruken av mus reduserer kostnadene eksperimentet og tillater behandling av flere lever for å oppnå store mengder av Kupffer-celler for nanopartikkeltoksisitetstesting.
I det følgende protokoll ble Kupffer-celler inkubert med funksjonaliserte karbon nanorør (f dvs. høy lengde og diameter ratio og stor overflate, har gjort CNTs interessante kandidater som vektorer for terapi og diagnose formål. Imidlertid har blitt reist spørsmål angående toksisiteten av CNTs 19, og utvikling av nye in vitro tester som formål å øke forståelsen av CNT biologiske effekt. Toksisitet i Kupffer celle er forbundet med en mangel på strukturell integritet av cellemembranen. Dette er målt ved tapet av cytoplasmatiske enzymet LDH fra cellen inn i supernatanten. Prinsippet for denne metode er derfor å fjerne frigitt LDH og måle hva som er igjen i cellene 20. Dette gjøres i preferanse til måling av frigjort LDH i supernatanten på grunn av tilstedeværelsen av CNTs i supernatanten forstyrrer analysen 21.
Vi foreslår bruken av denne enkle og kostnadseffektive Kupffer celleisolasjon methoD for å isolere høyt antall funksjonelle Kupffer celler. Dette tillater screening av giftigheten av et utvalg av nanopartikler, i en relevant primær makrofag-modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble henrettet i samsvar med alle relevante retningslinjer, forskrifter og tilsynsorganer. Protokollen blir demonstrert ble utført under veiledning og godkjenning av Storbritannias Hjemmekontor regulering
1. Perfusjons og Cell Collection (figur 1)
Figur 1:. Liver Perfusjon Etter bedøvelse av musen, fordøyelseskanalen er sideveis beveget mot venstre av magen for å gjøre portvenen (PV) tilgjengelig. PV ble kanylert ved hjelp av en langsom strømningshastighet (1-3 ml / min) av EGTA / HBSS-løsningen og mindreverdig veina cava (IVC) er umiddelbart brytes for å unngå et eventuelt overtrykk i leveren. I løpet av det første minutt av perfusjon, blir strømningshastigheten gradvis øket til 7 ml / min. Den kollagenaseoppløsning blir deretter perfusert ved 10 ml / min inntil dens fulle fordøyelse er oppnådd.
- Behandling anleggre ferskt alle reagenser som er beskrevet i materialet tabellen.
- Varm EGTA (etylenglykol Tetra-eddiksyre) / HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) oppløsning (50 ml per mus) og kollagenaseoppløsning (100 ml per mus) i 30 minutter ved 40 ° C.
- Skyll pumpen fleksible rør først med 70% etanol. Hell 40 ml EGTA / HBSS løsning i et sentrifugerør neddykket i vannbadet og skyll pumpen fleksible rør med forvarmet EGTA / HBSS løsning.
- Utfør terminal anestesi ved hjelp av en barbiturat å pålitelig produsere bevisstløshet før respirasjonsdepresjon og død. Injisere fenobarbital på 1 mg / kg, ip til en kvinnelig eller mannlig CD1 mus (35-45 g). Bekreft anestesi ved tå knipe.
- Barbere mage hår og sterilisere mage overflaten med 70% etanol løsning.
- Skjære gjennom bukhulen og utsette portvenen og inferior vena cava ved å flytte seg sideveis tarmen til venstre av buken.
- Stjernet pumpen i en hastighet på 1-3 ml / min med EGTA / HBSS løsning og cannulate portalvenen ved anvendelse av en 23 g nål sommerfugl (vinger kuttet). Klem delen av portvenen kanylert med 23 G nål og deretter vende serrefine tang på overflaten av den åpnede musen magen. Leveren bør raskt blek innen de første 30 sek av EGTA / HBSS Solution perfusjon.
- Raskt innsnittet den nedre delen av vena cava inferior for å unngå overtrykk bygning i leveren, og deretter øke strømningshastigheten gradvis til 7 ml / min, i løpet av det første minutt av perfusjon. Dyret dør på grunn av blødning sekundært til vena cava venepunksjon.
- Når det er mindre enn 5 ml EGTA / HBSS Solution er igjen inn i sentrifugerør, fyll den opp med Kollagenase Solution (40-50 ml). Øke strømningshastigheten gradvis til 10 ml / min, i løpet av 30 sek.
- Gjør leveren svelle ved å legge press på nedre vena cava, ved hjelp av pinsett, for 5-10 sek intervaller. This kan gjøres med jevne mellomrom (5-10 ganger under fordøyelse). Dette trinnet vil forbedre leveren celledissosiasjon og redusere perfusjon tid med collagenase.
- Når mindre enn 10 ml Collagenase oppløsning forblir inne i sentrifugerøret, hell 40-50 ml forvarmet kollagenaseoppløsning i sentrifugerøret.
- Etter 10-15 min perfusjon og ca 70-80 ml kollagenaseoppløsning perfuserte, påføre et lite trykk på overflaten av leveren med en tang. En utskrift av trykket indikerer at leverceller er dissosiert.
- Fjern leveren fra bukhulen som ett stykke og legg den i et sentrifugerør inneholder 20-30 ml Kupffer Cells Isolation Medium. Hold leverceller på is eller ved 4 ° C i en periode på maksimum 3 timer for å unngå å påvirke leveren celle levedyktighet.
- Gjenta fremgangsmåten perfusjon på flere dyr hvis nødvendig, samtidig som perfusert leveren på is. Pool 02:59 lever for rensing og fortsett med trinn 3.
2. Fremstilling av densitetsgradienten for sentrifugering (Figur 2)
Figur 2:. Utarbeidelse av densitetsgradienten er alle prosedyrer utføres under sterile tilstand. SIP er fremstilt ved å blande 15,3 ml belagt silicapartikkel løsning med 1,7 ml 10 x PBS. En 5 ml SIP blir blandet med 15 ml PBS for å lage 20 ml 25% SIP-løsning. 10 ml av SIP blir blandet med 10 ml PBS for å lage 20 ml 50% SIP-løsning. Et sentrifugerør inneholdende 50% SIP-løsning (20 ml) er skråstilt, og 25% SIP-løsning (20 ml) blir langsomt tilsatt ved hjelp av en serologisk 25 ml pipette.
- Fortsett med følgende trinn (seksjon 2., 3. og 5.) under sterile og holde cellene på is eller ved 4 ° C. Klargjør SIP (Løsning av Isotonic belagt silika partikler) ved å blande 15,3 ml av belagt silicapartikkel løsning med 1,7 ml 10 x PBS. For å lage 20 ml 25% SIP-oppløsning, blande 5 ml av SIP med 15 ml PBS. For å lage 20 ml 50% SIP-oppløsning, bland 10 ml SIP med 10 ml PBS.
- Fyll ett sentrifugerør sammen med 20 ml av den 50% SIP-løsning. Vippe sentrifugerøret i en vinkel i nærheten av 90 ° og tilsett langsomt 25% SIP-løsning (20 ml) på sideveggen av røret ved hjelp av en 25 ml serologisk pipette, uten å berøre overflaten av 50% SIP lag. Ved tilsetting av 25% SIP-løsning, gradvis redusere vinkelen av røret. Hold densitetsgradient på is inntil bruk.
3. Kupffer Cell Rensing (figur 3)
Fig. 3: Rensing av Kupffer-celler ved densitetsgradient-sentrifugering, og celle-adhesjon er alle prosedyrer utført under sterile tilstand. (A) Når bruddet i Glisson s kapsel, blir leverceller filtrert gjennom et 100 mikrometer sil. Suspensjonen ble sentrifugert ved 50 x g for å forkaste hepatocytes (pellets) og samle den ikke-parenchymal cellefraksjon (supernatant). Dette trinnet ble gjentatt tre ganger. Ikke-parenchymale celler tilsettes på toppen av en diskontinuerlig isotonisk gradient og sentrifugert ved 800 xg i 15 min. Kupffer celler samlet opp fra 25% SIP pute renses ytterligere ved celleadhesjon valg. (B) Cellene ble sådd ut i 24-brønns plate og inkubert ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 minutter. Ikke-adherente celler blir vasket en gang med 500 ul HBSS. Kupffer cellene vise sin heft morfologi fire timer etter plating, når f -CNTs kan legges til cellene. Målestokk utgjør 25 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Sett en perfundert lever i en petriskål med 15 ml Kupffer Cell Isolation Medium. Sprekke den Glisson sin kapsel (membranen i leveren) ved hjelp av en saks, og slipper alle leverceller inn i Kupffer celleisolasjon medium. Filtrer løsningen selv om en 100 um celle sil for å bli samlet opp i et sentrifugerør. Gjenta fremgangsmåten perfusjon på flere perfuserte lever og bassenget på celler i det samme sentrifugerøret (15 ml fra en mus, opp til 45 ml fra tre mus).
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 50 x g i 2 minutter ved 4 ° C. Parenchymale celler (hepatocytes) vil være i pelleten og ikke-parenchymale celler (inkludert Kupffer-celler) blir i supernatanten.
- Utlevering av væsken i et rent sentrifugerør og sentrifuger ved 50 xg i 2 minutter hver. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Sentrifuger ved 1350 xg i 15 min til pellet non-parenkymceller. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml Kupffer Cell isoleringsmediet.
- Tilsett ikke-parenchymal celleløsning på den diskontinuerlige isotonisk gradient 25/50%, som beskrevet i 2.3. Centrifuge på 850 xg i 15 minutter uten akselerasjon eller pause.
- Lokalisere anrikede Kupffer cellefraksjon vises turbid innenfor 25% SIP fraksjon nær 25/50% SIP-grensesnitt (figur 3). Ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette aspirere omtrent 12 ml av den anrikede Kupffer cellefraksjon. Overfør cellene til et sentrifugerør inneholdende 35-40 ml Kupffer celleisolasjon medium. Bland forsiktig og sentrifuger ved 1350 xg i 15 min ved 4 ° C for å pelletere cellene.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 5-10 ml forvarmet Kupffer cellekulturmedium. Antall celler (hemocytometer) og måle levedyktigheten ved hjelp av trypan-blått-farging.
- Plate de rensede ikke-parenchymale celler i 24-brønners plater i en tetthet på 5 x 10 5 celler / brønn. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO 2 (figur 3). Etter 30 minutter ble mediet forsiktig fjernes, vaskes med forvarmet Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) en gang og deretter erstattedet med 500 mL av frisk og forvarmet Kupffer cellekulturmedium (per brønn).
- La Kupffer-celler i minst 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2 før behandling med nanopartikler for å tillate dem å skaffe sin adherent morfologi.
4. Karakterisering
- Kupffer Cells Purity
- Forbered fersk PBS / BSA løsning som brukes til å opprettholde Kupffer cellenes levedyktighet. Vask cellene en gang med 500 ul av PBS / BSA-oppløsning. Fjern PBS / BSA løsning og ta Kupffer celler i 500 mL av frisk PBS / BSA løsning ved hjelp av milde skraping. Når celler blir sådd ut i 24-brønners plater, forkorte endene av skrapebladene med saks for å gjøre det lettere løsgjøring å fortsette. Overfør cellene inn flowcytometri rør.
- Telle Kupffer celler ved hjelp av en hemocytometer og sentrifuger 1 x 10 5 celler ved 1350 x g. Resuspender Kupffer-celler i 30 pl av F4 / 80-antistoff (ren). Bland godt og inkuber ved værelsestemperatur i tre0 min. Hold ufargede celler (ikke inkuberes med antistoffet) på isen.
- Tilsett 2 ml PBS / BSA-oppløsning i fargede celler, sentrifuge ved 1350 g i 5 minutter og den resulterende supernatanten kastes. Resuspender fargede celler i 200 ul PBS / BSA.
- For flowcytometri analyse, gate 10.000 unstained Kupffer celler i henhold til deres størrelse (forward scatter) og detaljnivå (side scatter). Analyser fluorescens av gated celler i FL-1 kanal.
- Gjenta prosedyren for farget Kupffer celler holde de samme innstillingene som brukes for flowcytometri analyse av ufargede Kupffer celler. Velg og kvantifisere fluorescensen av fargede celler for å bedømme renheten av Kupffer celle.
- Kupffer Cell fagocytiske aktivitet
- Erstatte mediet med 0,5% (v / v) fluoriserende perler i Kupffer cellekulturmedium og inkuberes i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- For å fjerne ikke-internalis perler, sentrifuger Kupffer cellene ved 1350 xg, discard supernatanten og resuspender cellene i 500 mL PBS / BSA Solution. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Skrap Kupffer celler i 500 mL PBS / BSA-oppløsning og overføre celler i en flowcytometri tube.
- Sentrifuger Kupffer cellene ved 1350 xg, kast supernatanten og resuspender cellene i 200 mL PBS / BSA Solution.
- For flowcytometri analyse, gate 10.000 unstained Kupffer celler i henhold til deres størrelse (forward scatter) og detaljnivå (side scatter). Analyser fluorescens av gated celler i FL-2-kanal.
5. Inkubasjon av kjemisk Funksjonkarbonnanorør (f -CNTs)
- Tilbered en dispersjon av f -CNTs (1 mg / ml) i vann ved ultralydbehandling i 15 min før bruk. F -CNTs fremstilles på huset 22.
- Forbered 2x konsentrerte F- CNTs dispersjon i Kupffer cellekulturmedium. Sonicate F- CNTs dispergert i medium for2 min før du fortsetter med trinn 5.3).
- For hver brønn, erstatte 250 mL av gamle medier med 250 mL av 2x f -CNTs spredning. Ubehandlede brønner (250 pl kondisjonert medium + 250 ul av frisk Kupffer cellekulturmedium) og brønnene ble behandlet med 10% DMSO blir benyttet som negativ og positiv kontroll, respektivt.
- Inkuber Kupffer-cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 eller 72 timer.
6. Toksisitet Vurdering av f -CNTs i Kupffer celler ved Modified laktatdehydrogenase (LDH) analyse
- Kast supernatanten.
- Tilsett 200 ul (per brønn av 24-brønns plate) av lysebuffer og inkuber ved 37 ° C i 30 min-1 time.
- Etter å ha gjennomført sprek pipettering, samle lysert Kupffer celler inn mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 40.000 xg i 10 min til pellet f -CNTs som ble tatt opp av celler og celleavfall.
- Samle Supernatantene (ƒ-CNT gratis) iMikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 ° C eller gå videre til trinn 6.5).
- Overfør 50 ul i en 96-brønns plate og tilsett et likt volum av substratet blandingen oppløsning (LDH kit) til hver brønn. Dekk platen og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter før tilsetning av 50 pl av stoppløsningen (LDH kit). Legg triplikater av blanke brønner inneholdende 50 ul lyseringsbuffer, 50 ul substrat blanding oppløsning og 50 pl av stoppløsningen.
- Les absorbans ved 490 nm i en mikroplateleser og bruker følgende formel for å beregne (%) celle levedyktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antallet ikke-rensede parenkymceller var konsistent og varierte mellom 8 og 14 x 10 6 celler per mus (17 isoleringer ble utført). Hver mus isolasjon var tilstrekkelig til plate 16 til 28 brønner. Celleviabilitet ved trypan blå farging viste celleviabilitet ~ 95%. Kupffer-celler viste en rund form innen 30 min inkubering ved 37 ° C, relatert til deres ufullstendig heft morfologi (figur 4A). Ved 4 timers inkubasjon, og etterpå ble cellene spre seg og cellegrupper begynte å dannes.
Kupffer-celler ble så karakterisert for å bekrefte deres renhet og fagocytisk aktivitet. Celler ble farget med F4 / 80-antistoff for å demonstrere Kupffer cellen renhet. Strømningscytometri-analyse viste Kupffer celle renhet over 95% (figur 4B). Celler ble inkubert med 1 mikrometer fluoriserende perler, 12 timer etter plating, for å bekrefte deres evne til å ta opp store partikler. Flowcytometri analyse viste that mer enn 85% av Kupffer-celler er fagocytisk, dvs. kan oppta en mikrometer kulene (figur 4C). Etter 72 timer av kulturen, 40% av Kupffer-celler var fagocytisk, noe som indikerer at Kupffer celler delvis mistet sin fagocytisk aktivitet.
Mikros avbildning av Kupffer-celler inkubert med f -CNTs for 24 og 72 timer avslørte lignende cellemorfologi i forhold til naive celler (figur 5a). Kupffer celler inkubert med 10% DMSO (positiv kontroll) vises nekrotiske morfologi (Figur 5A). Etter analyse av den modifiserte LDH assay, Kupffer-celler behandlet med 10% DMSO (positiv kontroll) i 24 og 72 timer viste høy toksisitet (figur 5B). Til sammenligning, f -CNTs induserte svak, men signifikant reduksjon i cellelevedyktighet når celler ble eksponert ved 50 ug / ml i 72 timer (figur 5B).
Figur 4: renhet og opptak evnene til Kupffer-celler (A) mikroskopiske bilder av Kupffer-cellene sådd etter 30 minutter eller 24 timer ved 37 ° C med en atmosfære av 5% CO2.. Målestokk presenterer 50 mikrometer. (B) Flowcytometri analyse av Kupffer celler ble utført etter FSC / SSC celle gating. Kupffer celle renhet ble bestemt ved bruk av F4 / 80 antistoffarging og viste å være over 95%. (C) Kupffer-celler ble inkubert i 4 timer i nærvær av en mikrometer fluorescerende kuler for å vurdere deres fagocytisk aktivitet. De funksjonelle egenskaper av Kupffer ble opprettholdt bedre i celler nyisolerte (12 timer etter utplating) sammenlignet med celler som ble testet etter 3 dager.
Figur 5: Opptak og toksisitet av <em> F- CNTs i Kupffer celler. (A) Mikros bilder av Kupffer celler. Bildene viser Kupffer-celler behandlet med 10% DMSO og 50 ug / ml f -CNTs ved 37 ° C i 24 og 72 timer. Målestokk presenterer 50 mikrometer. (B) Modifisert LDH assay. Lav cellelevedyktigheten ble observert i 10% DMSO behandlede celler (positive kontroller) mens f -CNTs klart påvirkes cellenes levedyktighet etter at utstilling til 50 ug / ml i 72 timer. * P <0,05 i forhold til naive tilstand (med unntak av 10% DMSO tilstand) ved hjelp av variansanalyse (enveis ANOVA) med post hoc-analyse av Tukey-testen. Skalaen bar tilsvarer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følgende trinn er avgjørende for å oppnå høy avkastning og høy levedyktigheten til Kupffer celler. Aseptiske betingelser bør brukes for å begrense risikoen for bakterie- og soppforurensning. Alle instrumenter må steriliseres før bruk. Reagenser skal tilberedes før du utfører isoleringsprosedyren.
Valget av kollagenase IV, med lav tryptisk aktivitet, er viktig. Forskjellige partier fra samme leverandør har forskjellige enzymatisk aktivitet og de kan trenge å bli sammenlignet i første omgang å velge den mest hensiktsmessige batch for Kupffer celle isolasjon. Dette kan bli dømt ved å vurdere celleutbytte og celle levedyktighet. Det er også anbefalt å ta kontakt med leverandøren for å gi grupper som har blitt brukt for lignende programmer. Når besluttet på batch som skal brukes, reservere den for fremtidig bruk.
Kanylering prosedyren krever trening. Planlegge bruken av flere dyr til å bli trygg med portvenencannulation prosedyre. I praksis vil vellykket kanylering lett oppnås, og fremgangsmåten kan håndteres av en person. Legg merke til at bruk av tunge dyr øker diameteren av portvenen, og derfor letter inngrepet. Når den bakre vegg av portvenen er perforert, er det teknisk vanskelig å få tilgang til venen igjen, særlig hvis man er nye med denne fremgangsmåten, og derfor er det foretrukket å starte med et nytt dyr.
De HBSS og kollagenase løsninger bør ha sin pH justert til 7,4 og forvarmes ved 40 ° C for å oppnå et utgangstemperaturen fra den peristaltiske pumpen på 37 ° C. Perfusjon med EGTA / HBSS Solution (Ca 2+ og Mg2 + fri) som inneholder EGTA er nødvendig for avbrudd av Ca2 + -avhengige adhesjonsmolekyler heter desmosom, svekke celle-celle-interaksjon. Kollagenase type IV blir brukt til å løsne leverceller fra den ekstracellulære matriks, og så føre til levercelledissosiasjon. Perfusjon tid for de to oppløsninger bør ikke overstige 15 min for CD1 mus, men andre stammer, slik som C57BL / 6, kreve noe lenger lever koketiden.
For å oppnå en vellykket isolasjon, er det nødvendig for å oppnå høy celleutbytte og levedyktighet. Hvis eksperimentator har ingen erfaring i leveren celle isolasjon, er det anbefalt å kombinere hepatocytes pellets fra de første tre sentrifugeringer på 50 xg og telle celler ved trypanblått eksklusjon analysen. Den hepatocytter Avkastningen bør være> 20 x 10 6 celler og hepatocytter levedyktighet> 50%. Lave avlinger resultere i hovedsak fra dårlig celledissosiasjon fører indirekte til lavere Kupffer celle yield. Det skal fastslås at leveren er korrekt behandlet ved slutten av perfusjonen trinn. Når egnet hepatocytter utbytte oppnås i kombinasjon med lav hepatocytter levedyktighet, kan dette skyldes en overdreven collagenase fordøyelsen, men er mer sannsynlig forklares med en upassende leverenperfusjon prosedyre eller bruk av en forurenset reagent / materiale.
Etter plating, Kupffer celler er følsomme og må vaskes forsiktig. Minst fire timer er nødvendig for Kupffer celler til å skaffe sin tilhenger morfologi. Behandlingen utføres vanligvis 4-24 timer etter utplating, slik Kupffer celler viser sin maksimale fagocytisk aktivitet i løpet av en dag etter utplating.
I vår protokollen beskriver vi dissosiasjonen av CD1 mus leverceller, etterfulgt av rensing av Kupffer-celler ved tetthetsgradient sentrifugering og valg av adhesjon. Karakteriseringen av Kupffer-celler, ved flowcytometri, viser at høyt utbytte og renhet av Kupffer-celler kan oppnås ved bruk av denne metoden.
Dette Kupffer celle isolasjonsmetoden representerer en verdifull kompromiss mellom kompleksitet og celle yield. Det er imidlertid rapportert at visse Kupffer celler metoder kan være lettere å gjennomføre, slik som den protokoll som er beskrevet avWu et al., Hvor leveren blir spaltet ex vivo 23. Men fremgangsmåten beskrevet av Wu et al. fører til en begrenset mengde av celler og nedre celle renhet. Høyere yield og renhet kan oppnås, men krever dyrt og / eller avansert utstyr, og kan være tidkrevende.
Den opprinnelige protokoll utviklet av Smedsrød et al. 16 benyttes en tilsvarende protokoll basert på to-trinns metode perfusjon (HBSS + kollagenase spaltning) etterfulgt av sentrifugering på Percoll-gradient og valg av den nedre Percoll pute for ytterligere rensing av overflaten adhesjon. Ved å endre sentrifugering prosedyre og samle den øvre Percoll pute, økte vi beriket Kupffer cellefraksjon fra 5,25 x 10 6 til 8,2 x 10 6 celler per gram leveren. Denne forbedring kan tilskrives bruken av EGTA under tidlig perfusjon trinnet for å lette dissosiasjon av leverceller. Moreover, bruk av flowcytometri analyse tillot pålitelig kvantitativ karakterisering av Kupffer cellerenhet og fagocytisk aktivitet. Med en maksimal avkastning på 14 x 10 6 renset ikke-parenkymceller per muselever. Den foreliggende isolasjonsmetoden oppnå større mengde Kupffer celler pr muselever til det som er blitt rapportert i litteraturen 24. Denne forbedring kan forklares ved bruk av tyngre mus (35-45 g) sammenlignet med andre metoder 24. Ved siden av denne økning i celle utbytte, muliggjør bruk av større dyr bemerkelsesverdig at fremgangsmåten i portvenen kanylering.
High-throughput in vitro testing kan gjennomføres ved bruk av denne primære fagocytisk modell, og derfor etterligne in vivo toksikologisk innvirkning av nanopartikler. Den generelle forståelsen av nanotoxicology kunne ha nytte av slike modeller, noe som gjør nanopartikkel utvalg for klinisk oversettelses mer effektiv. I tillegg er det på linje medimplementere begrepet 3 R (reduksjon, raffinering og erstatning) i dyre biomedisinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
