Abstract
A grande maioria dos estudos in vitro nanotoxicological usaram linhas celulares imortalizadas para a sua viabilidade. No entanto, os resultados de testes de toxicidade de nanopartículas em linhas de células imortalizadas ou células primárias têm mostrado discrepâncias, destacando a necessidade de estender o uso de pilhas para ensaios in vitro. Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos de fígado de rato, células de Kupffer nomeados, e a sua utilização para estudar a toxicidade das nanopartículas. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e fazem parte do sistema retículo endotelial (RES), responsável pela captura de nanopartículas de circulação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método, baseado na digestão com colagenase e centrifugação de densidade, é uma adaptação do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et ai. projetado para rato isolatio células do fígadon e proporciona um rendimento elevado (até 14 x 10 6 culas por ratinho) e de alta pureza (> 95%) das células de Kupffer. Este método de isolamento não requer equipamento sofisticado e caro e, por conseguinte, representa um compromisso ideal entre a complexidade e de rendimento celular. A utilização de ratos mais pesados (35-45 g) melhora o rendimento do método de isolamento, mas também facilita notavelmente o procedimento de canulação da veia porta. A toxicidade de nanotubos de carbono funcionalizadas f -CNTs foi medido neste modelo pelo ensaio de LDH modificado. Este método avalia a viabilidade das células medindo a falta de integridade estrutural da membrana da célula de Kupffer, após incubação com -CNTs f. Toxicidade induzida pelo -CNTs f pode ser medido de forma consistente com este ensaio, destacando que as células de Kupffer isoladas são úteis para testes de toxicidade das nanopartículas. A compreensão global do nanotoxicology poderiam se beneficiar de tais modelos, tornando a seleção de nanopartículas para tradução clínica mais eficient.
Introduction
O campo da pesquisa nanotoxicology tem como objetivo caracterizar o efeito biológico das nanopartículas. Estudos toxicológicos in vivo com base em investigações continuam a ser os métodos mais precisos. No entanto, seu uso é limitado pelo seu custo, trabalho e requisitos de tempo um. Como alternativas, em ensaios in vitro têm sido utilizados por causa da sua simplicidade e da possibilidade de desenvolvimento de alto rendimento em plataformas de ensaios in vitro, 2 - estendendo-se assim o número de condições testadas. A maioria dos estudos nanotoxicological são realizados utilizando ensaios in vitro com linhas de células imortalizadas. Contudo, existem preocupações em relação à extrapolação destes resultados experimentais in vivo para efeitos toxicológicos 3. Na verdade, as propriedades das linhas celulares imortalizadas pode ser significativamente diferentes dos tecidos que foram derivados a partir de, por exemplo, transformação genética 4, deterioração das características morfológicas principais5, perda da polaridade celular 6 e alterações funcionais, tais como a regulação de mediadores inflamatórios 7.
Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e estão em contacto directo com o sangue, forrando a parede de sinusóides do fígado. Como parte do sistema reticulo-endotelial (RES), estes macrófagos são responsáveis para a captura de nanopartículas de circulação e, por conseguinte, constituir um modelo altamente adequado para estudar a toxicidade de nanopartículas. In vivo 8 9 e in vitro estudos de respostas inflamatórias associadas com as células de Kupffer expostos a nanopartículas ter sido publicado anteriormente. Células de Kupffer também foram envolvidos na patogênese de doenças do fígado, como a doença hepática alcoólica 10, 11 fibrose hepática ou hepatite viral 12. Foi relatado que células de Kupffer isolado fornecer indicações úteis para descrever os mecanismos celulares involved em perturbações do fígado 13,14.
Vários métodos têm sido relatados para isolar e purificar as células de Kupffer. Isolamento das células pode resultar de dissociação mecânica ou enzimática 15. Digestão de colagenase mostra a vantagem de conservar a integridade funcional das células de Kupffer, enquanto conduzindo a elevada produção de células de Kupffer 16. Muitas abordagens experimentais, que variam em complexidade e custos, foram usados para separar células de Kupffer de outras populações de células de fígado. Por exemplo, células de Kupffer pureza pode ser conseguida por imunoafinidade 17, electroforese de fluxo 18, 16 a adesão selectiva ou por técnicas de centrífugas 16, que seleccionam as células de acordo com o seu tamanho e densidade. Uma combinação destes métodos podem ser escolhidos para aumentar a pureza da população 16. Não há consenso sobre o método ideal para o isolamento de células Kupffer, uma vez que na maior parte depende das aplicações e equipmen disponíveist. No entanto, no caso dos ensaios de toxicidade de nanopartículas, a simplicidade e elevado rendimento da técnica associada com a preservação funcional das células de Kupffer parecia ser mais adequado para esta aplicação.
O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método foi modificado a partir do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et al. 16 concebido para o isolamento de células de fígado de rato. A maioria dos estudos relatados e descrito o isolamento de células de Kupffer do fígado de ratos. Aqui, nós descrevemos um método para isolar as células de Kupffer do fígado de rato, com um rendimento elevado e pureza. A utilização de ratinhos reduz o custo experimento e permite o processamento de vários fígados para obter grandes quantidades de células de Kupffer para testes de toxicidade de nanopartículas.
No protocolo seguinte, as células de Kupffer foram incubadas com os nanotubos de carbono funcionalizadas (f ou seja, alta proporção de comprimento para diâmetro e grande área superficial, fez CNT candidatos interessantes como vectores para fins de terapia e de diagnóstico. No entanto, têm surgido preocupações quanto à toxicidade dos nanotubos de carbono 19, e o desenvolvimento de novos ensaios in vitro destina-se a aumentar a compreensão das CNT efeito biológico. Toxicidade em células de Kupffer é associada com uma falta de integridade estrutural da membrana celular. Isto é medido pela perda da enzima LDH do citoplasma da célula para o sobrenadante. O princípio deste método é, portanto, para remover qualquer LDH libertada e medir o que é deixado nas células 20. Isto é feito, de preferência a medição do LDH libertado no sobrenadante, pois a presença de nanotubos de carbono no sobrenadante interfere com o ensaio de 21.
Propomos o uso deste eficaz meto Kupffer isolamento de células simples e de custod para isolar elevado número de células de Kupffer funcionais. Isto permite o rastreio de toxicidade de uma grande variedade de nanopartículas, num modelo relevante macrófagos primários.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes e regulamentos relevantes e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do regulamento escritório UK Home
1. Perfusão e Cobrança celular (Figura 1)
Figura 1:. Perfusão do fígado Após anestesia do rato, o tracto digestivo está deslocado lateralmente para a esquerda do abdómen de modo a tornar a veia porta (VP) acessível. O PV é canulada usando uma taxa de fluxo lento (1-3 mL / min) de solução de EGTA / HBSS e a veia veina inferior (IVC) é rompido imediatamente para evitar qualquer excesso de pressão dentro do fígado. Dentro da primeira hora de perfusão, a taxa de fluxo é aumentada gradualmente até 7 ml / min. A solução de colagenase é então perfundido a 10 ml / min, até que a sua digestão completa seja alcançada.
- Prepare recém todos os reagentes descritos na tabela de material.
- Aquece-se a EGTA (etileno-glicol Tetra-ácido acético) / HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) de solução (50 ml por ratinho) e a solução de colagenase (100 ml por rato) durante 30 min a 40 ° C.
- Lavar a bomba de tubo flexível primeiro com etanol 70%. Pour 40 ml de EGTA / solução de HBSS para um tubo de centrífuga imerso no banho de água e lavar a tubagem flexível com bomba de pré-aquecida de EGTA / solução de HBSS.
- Realizar anestesia terminal usando um barbitúrico para produzir de forma confiável inconsciência antes que a depressão respiratória e morte. Injectar fenobarbitona a 1 mg / kg, ip num ratinho CD1 macho ou fêmea (35-45 g). Confirme a anestesia por beliscar dedo do pé.
- Raspar os pêlos abdominais e esterilizar a superfície abdominal utilizando uma solução de etanol a 70%.
- Cortar através da cavidade abdominal e expor a veia porta e veia cava inferior, movendo o intestino lateralmente para a esquerda do abdómen.
- Estrelat a bomba a uma velocidade de 1-3 ml / min com solução de EGTA / HBSS e canular a veia portal usando uma agulha de borboleta de 23 g (asas corte). Prender a secção da veia porta canulada com a agulha 23 G e em seguida virar a pinça serrefine na superfície do abdómen aberto rato. O fígado deve rapidamente pálido nos primeiros 30 segundos de EGTA / Solução HBSS perfusão.
- Rapidamente incisar a parte inferior da veia cava inferior para evitar a formação de excesso de pressão no fígado, e em seguida aumentar progressivamente o caudal de 7 ml / min, ao longo do primeiro minuto de perfusão. O animal morre devido a hemorragia secundária à da veia cava punção venosa.
- Quando menos de 5 ml de EGTA / Solução HBSS é remanescente no tubo de centrífuga, encha-o com solução de colagenase (40-50 ml). Aumentar a taxa de fluxo gradualmente para 10 ml / min, ao longo de 30 seg.
- Faça o swell fígado, aplicando pressão para a veia cava inferior, usando uma pinça, por 5-10 intervalos seg. This pode ser feito periodicamente (5-10 vezes durante a digestão). Este passo vai melhorar a dissociação das células do fígado e reduzir o tempo de perfusão com colagenase.
- Quando menos do que 10 ml de solução de colagenase permanece dentro do tubo de centrifugação, derrame 40-50 mL de solução pré-aquecida de colagenase no tubo de centrífuga.
- Após 10-15 min de perfusão e cerca de 70-80 ml de solução de colagenase perfundidos, aplicar uma pequena pressão sobre a superfície do fígado com uma pinça. Uma cópia da pressão indica que as células do fígado são dissociados.
- Remover o fígado a partir da cavidade abdominal como uma só peça e colocá-lo em um tubo de centrífuga contendo 20-30 ml de células de Kupffer de isolamento médio. Mantenha as células do fígado em gelo ou a 4 ° C por um período máximo de 3 horas para evitar que afetam a viabilidade das células do fígado.
- Repetir o procedimento de perfusão em vários animais, se necessário, ao mesmo tempo manter o fígado perfundido em gelo. Piscina 1-3 fígados para purificação e prosseguir com a fase 3.
2. Preparação do por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 2)
Figura 2:. Preparação do gradiente de densidade Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. O SIP é preparado por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. A 5 ml de SIP são misturados com 15 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP são misturados com 10 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 50%. Um tubo de centrífuga contendo a solução de 50% de SIP (20 ml) é inclinada e a solução SIP 25% (20 ml) é adicionado lentamente, utilizando uma pipeta serológica 25 ml.
- Continue com as seguintes etapas (seção 2., 3. e 5.) sob condições estéreis e manter as células em gelo ou a 4 ° C. Prepara-se o SIP (Solução isotónica de partículas de sílica revestidas) por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. Para fazer 20 ml de solução SIP 25%, mistura 5 ml de SIP com 15 ml de PBS. Para fazer 20 ml de solução SIP 50%, mistura de 10 ml de SIP com 10 ml de PBS.
- Encher um tubo de centrífuga com 20 ml de solução a 50% de SIP. Inclinar o tubo de centrifugação com um ângulo próximo de 90 ° e adiciona-se lentamente a solução SIP 25% (20 ml) na parede lateral do tubo utilizando uma pipeta de 25 ml serológico, sem tocar na superfície da camada de SIP 50%. Quando a adição da solução SIP 25%, reduzir progressivamente o ângulo do tubo. Manter o gradiente de densidade em gelo até à utilização.
3. Purificação de Kupffer celular (Figura 3)
Figura 3:. Purificação de Kupfer células por centrifugação em gradiente de densidade e adesão celular Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. (A) após a ruptura da cápsula de Glisson, células do fígado são filtrados através de um 100 mm filtro. A suspensão é centrifugada a 50 x g para descartar hepatócitos (granulados) e recolher a fracção de células não-parenquimatosas (sobrenadante). Este passo é repetido três vezes. As células não-parenquimatosas são adicionadas no topo de um gradiente descontínuo isotónica e centrifugado a 800 xg durante 15 min. Células de Kupffer recolhidos a partir da almofada SIP 25% são purificados adicionalmente por selecção de adesão celular. (B) As células foram semeadas em placa de 24 poços e incubou-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 30 min. As células não aderentes são lavadas uma vez com 500 ul de HBSS. Células de Kupffer exibir a sua morfologia aderente 4 h após o plaqueamento, quando -CNTs f pode ser adicionado às células. A barra de escala representa 25 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque um fígado perfundido em uma placa de Petri com 15 ml de Kupffer isolamento celular Médio. A ruptura da cápsula de Glisson (membrana do fígado), utilizando tesouras e libertar todas as células do fígado para o meio de isolamento de células de Kupffer. Filtrar a solução através de uma filtro de células 100 um a ser coletado em um tubo de centrífuga. Repita o procedimento de perfusão em fígados perfundidos adicionais e reunir as células no mesmo tubo de centrífuga (15 ml de um rato, até 45 ml de três ratos).
- Centrifugar a suspensão de células a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Células parenquimatosas (hepatócitos) será no sedimento e células não-parenquimatosas (incluindo células de Kupffer) será no sobrenadante.
- Recolhe-se o sobrenadante num tubo de centrífuga limpo e centrifuga-se a 50 x g durante 2 minutos cada. Repita este passo três vezes mais.
- Centrifugar a 1.350 xg durante 15 min para sedimentar as células não-parenquimatosas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de isolamento de células de Kupffer Médio.
- Adicionar a solução de células não-parenquimatosas sobre o gradiente descontínuo isotónica 25/50%, tal como descrito em 2.3. Centavorifuge a 850 g durante 15 min sem aceleração ou pausa.
- Localizar a fracção de célula de Kupffer enriquecido turvas na fracção SIP 25% nas proximidades da interface de SIP 25/50% (Figura 3). Utilizando uma pipeta de 10 mL serológico, aspirado de cerca de 12 ml da fracção de células enriquecida de Kupffer. Transferência de células para um tubo de centrífuga contendo 35-40 ml de isolamento de células de Kupffer meio. Misturar suavemente e centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as células.
- Descarte as células sobrenadante e ressuspender em 5-10 ml de pré-aquecido celular Kupffer Meio de Cultura. Contagem de células (hemocit�etro) e medir a viabilidade utilizando a coloração azul de tripano.
- Placa as células não-parenquimatosas purificados em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10 5 células / poço. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 (Figura 3). Após 30 min, remover suavemente o meio, lava-se com pré-aquecido Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS), em seguida, uma vez substituircom 500 ul de fresco e pré-aqueceu-se Meio de Cultura celular de Kupffer (por poço).
- Deixar as células de Kupffer durante pelo menos 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2 antes do tratamento com nanopartículas, para permitir que eles adquirem a sua morfologia aderente.
4. Caracterização
- As células Kupffer Pureza
- Preparar a solução de PBS / BSA fresca utilizada para manter a viabilidade das células de Kupffer. Lave as células uma vez com 500 ul de solução de PBS / BSA. Remover a solução de PBS / BSA e separar as células de Kupffer em 500 uL de solução de PBS / BSA fresco utilizando raspagem suave. Quando as células são plaqueadas em placas de 24 poços, encurtam as extremidades de lâminas de raspagem com uma tesoura para fazer a separação mais fácil de prosseguir. Transferência de células em tubos de citometria de fluxo.
- Contagem de células de Kupffer, utilizando um hemocitómetro e centrifuga-se 1 x 10 5 células a 1350 x g. Ressuspender as células de Kupffer em 30 ul de F4 / 80 anticorpo (puro). Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Manter as células não coradas (não incubadas com o anticorpo) em gelo.
- Adicionar 2 ml de solução de PBS / BSA em células coradas, centrifugar a 1350 g durante 5 min e desprezar o sobrenadante resultante. Ressuspender as células coradas em 200 ul de PBS / BSA.
- Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-1 canal.
- Repita o procedimento para as células de Kupffer manchadas mantendo as mesmas configurações utilizadas para a análise de citometria de fluxo de células de Kupffer não coradas. Escolher e quantificar a fluorescência de células coradas para avaliar a pureza de célula de Kupffer.
- Kupffer células fagocíticas Atividade
- Substituir meios com 0,5% (v / v) de partículas fluorescentes de Kupffer em meio de cultura celular e incubar durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- A fim de remover os grânulos não-internalizados, centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, diScard o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de PBS / BSA. Repita este passo mais 2 vezes.
- Raspe células de Kupffer em 500 ul de células e de transferência de solução de PBS / BSA para um tubo de citometria de fluxo.
- Centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, descartar as células sobrenadante e ressuspender em 200 ul de PBS / BSA.
- Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-2 canais.
5. Incubação de Quimicamente nanotubos de carbono funcionalizados (f -CNTs)
- Prepara-se uma dispersão de -CNTs f (1 mg / ml) em água por sonicação durante 15 min antes da utilização. -CNTs F são preparados em casa 22.
- Prepare 2x CNTs concentrados f- dispersão em Kupffer meio de cultura celular. CNT f- sonicate dispersos em meio para2 min antes de prosseguir com o passo 5.3).
- Para cada bem, substituir 250 � de meio de idade com 250 ul de 2x dispersão -CNTs f. Poços não tratados (250 ul de meio condicionado + 250 ul de células de Kupffer fresco meio de cultura) e os poços tratados com 10% de DMSO são utilizados como controlo negativo e positivo, respectivamente.
- Incubar as células de Kupffer a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 ou 72 h.
6. Avaliação da Toxicidade -CNTs f em células de Kupffer pela lactato desidrogenase (LDH) Ensaio de modificação
- Desprezar o sobrenadante.
- Adicionar 200 uL (por poço da placa de 24 poços) de tampão de lise e incubar a 37 ° C durante 30 min-1 h.
- Após a realização de pipetagem vigorosa, recolher lisadas células de Kupffer em tubos de microcentrifugação e centrifugar a 40000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que foram absorvidos pelas células e os restos celulares.
- Recolher os sobrenadantes (ƒ-CNT livre) emmicrotubos e armazenar a -20 ° C ou vá para o passo 6.5).
- Transferir 50 ul numa placa de 96 cavidades e adicionar um volume igual da solução de mistura de substrato (kit de LDH) a cada poço. Cobrir a placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes da adição de 50 ul da solução de paragem (kit de LDH). Adicionar triplicados de poços em branco, contendo 50 ul de tampão de lise, 50 ul de solução de mistura de substrato e 50 ul de solução de paragem.
- Ler a absorvância a 490 nm num leitor de microplacas e utilizar a seguinte fórmula para calcular a (%) de viabilidade celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O número de células não-parenquimatosas purificadas foi consistente e variou entre 8 e 14 x 10 6 culas por rato (17 isolamentos foram realizadas). Cada isolamento do mouse foi suficiente para a chapa 16-28 poços. A viabilidade das células por coloração com azul de tripano demonstrou a viabilidade das células ~ 95%. Células de Kupffer mostrou uma forma redonda dentro de 30 min de incubação a 37 ° C, relacionada com a sua morfologia aderente incompleta (Figura 4A). Às 4 horas de incubação e, posteriormente, as células foram espalhadas e aglomerados de células começaram a se formar.
Células de Kupffer foram então caracterizados para confirmar sua pureza e atividade fagocítica. As células foram coradas com F4 / 80 anticorpo para demonstrar a pureza célula de Kupffer. A citometria de fluxo mostrou a análise de Kupffer pureza acima de 95% de células (Figura 4B). As células foram incubadas com 1 mm partículas fluorescentes, 12 horas após o plaqueamento, para confirmar a sua capacidade para assumir as partículas grandes. A citometria de fluxo análise mostrou that mais de 85% das células de Kupffer são fagocitária, ou seja, pode tomar-se os grânulos de 1 uM (Figura 4C). Após 72 horas de cultura, 40% das células de Kupffer foram phagocytic, indicando que células de Kupffer perdido parcialmente sua atividade fagocitária.
Microscopia de imagem das células incubadas com Kupffer -CNTs F durante 24 e 72 horas revelaram a morfologia celular de forma semelhante às células naive (Figura 5A). Células de Kupffer incubadas com 10% de DMSO (controlo positivo) exibido morfologia necrótica (Figura 5A). Após a análise do ensaio de LDH modificado, células de Kupffer tratada com 10% de DMSO (controlo positivo) durante 24 e 72 horas apresentaram elevada toxicidade (Figura 5B). Em comparação, -CNTs f induzida ligeira mas significativa redução na viabilidade das células apenas quando as células foram expostas a 50 ng / ml, durante 72 h (Figura 5B).
Figura 4: Pureza e absorção Capacidades de células de Kupffer (A) As imagens microscópicas de células de Kupffer plaqueadas após 30 min ou 24 h a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO 2.. A barra de escala apresenta 50 um. (B) a análise de citometria de fluxo de células de Kupffer foi realizada seguindo FSC / SSC gating células. Kupffer pureza de células foi determinada utilizando F4 / 80 e coloração com anticorpo mostrou ser superior a 95%. Células (C) de Kupffer foram incubadas durante 4 horas na presença de 1 uM esferas fluorescentes para avaliar a sua actividade fagocitária. As propriedades funcionais de Kupffer foram mantidas melhor em células isoladas de fresco (12 h após o plaqueamento) em comparação com células testadas após 3 dias.
Figura 5: A absorção e toxicidade de <em> CNT f- em células de Kupffer. (A) As imagens microscópicas de células de Kupffer. Imagens mostram as células de Kupffer tratadas com DMSO a 10% e 50 ug / ml de f -CNTs a 37 ° C durante 24 e 72 h. A barra de escala apresenta 50 um. (B) ensaio LDH Modificada. Viabilidade celular de baixo foi visto em 10% de DMSO células tratadas (controles positivos), enquanto -CNTs f afetadas significativamente a viabilidade celular apenas após exposição a 50 ug / ml durante 72 horas. * P <0,05 em relação à condição ingénuos (excluindo 10% condição DMSO) usando análise de variância (ANOVA unidireccional) com análise post hoc pelo teste de Tukey. A barra de escala corresponde a 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os passos seguintes são fundamentais para alcançar alta produtividade e alta viabilidade das células de Kupffer. Condições assépticas devem ser usadas para limitar o risco de contaminação bacteriana e fúngica. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes da utilização. Os reagentes devem ser preparadas antes de realizar o procedimento de isolamento.
A escolha de colagenase IV, com baixa atividade tríptico, é crucial. Lotes diferentes do mesmo fornecedor tem actividade enzimática diferente e podem ter de ser comparado inicialmente para seleccionar o lote mais adequada para o isolamento de células de Kupffer. Isto pode ser julgado por avaliar rendimento das células e viabilidade celular. Também é recomendável entrar em contato com o fornecedor para fornecer lotes que foram utilizados para aplicações similares. Uma vez decidido sobre o lote a ser utilizado, reservá-lo para uso futuro.
O procedimento de punção requer treinamento. Plano do uso de vários animais para se tornar confiante com a veia portaprocedimento de punção. Com a prática, a canulação sucesso será conseguido facilmente eo procedimento pode ser manuseada por uma pessoa. Note-se que o uso de animais pesados aumenta o diâmetro da veia porta e, por conseguinte, facilita o processo. Quando a parede de trás da veia porta é perfurado, é tecnicamente difícil de acessar a veia novamente, especialmente se você é novo com este procedimento e, por conseguinte, é preferível começar com um novo animal.
As soluções HBSS e colagenase deve ter o seu pH ajustado para 7,4 e ser pré-aquecido a 40 ° C para atingir uma temperatura de saída a partir da bomba peristáltica de 37 ° C. A perfusão com EGTA / solução de HBSS (Ca 2+ e Mg 2+ livre) é necessária contendo EGTA para o rompimento de Ca2 + dependentes de moléculas de adesão, desmossoma nomeado, o enfraquecimento da interacção célula-célula. Colagenase de tipo IV é usado para separar as células do fígado a partir da matriz extracelular e assim levar a fígadodissociação de células. O tempo de perfusão para as duas soluções não deve exceder 15 min para ratinhos CD1, mas outras estirpes, tais como C57BL / 6, exigem ligeiramente mais longo do tempo de digestão de fígado.
Para conseguir um isolamento bem sucedido, é necessário para se obter um rendimento elevado e viabilidade celular. Se o pesquisador não tem nenhuma experiência em isolamento das células do fígado, é aconselhável combinar pelotas hepatócitos desde os primeiros três centrifugações a 50 xg e contagem de células por ensaio de exclusão de azul de tripano. O rendimento de hepatócitos deve ser> 20 x 10 6 células e a viabilidade dos hepatócitos> 50%. Rendimentos baixos resultam fundamentalmente de pobres dissociação celular levando indiretamente a baixar rendimento das células Kupffer. Deve ser confirmado que o fígado é adequadamente digerido no final do passo de perfusão. Quando o rendimento dos hepatócitos adequado é alcançado em combinação com baixa viabilidade dos hepatócitos, isso pode resultar de uma digestão com colagenase excessivo, mas é mais provável explicada por um fígado inadequadoprocedimento de perfusão ou o uso de um reagente / materiais contaminados.
Após o plaqueamento, as células de Kupffer são sensíveis e deve ser lavado suavemente. Pelo menos 4 h são necessários para células de Kupffer para adquirir sua morfologia aderente. O tratamento é geralmente realizada a 4-24 horas após o plaqueamento, as células de Kupffer mostram a sua actividade fagocítica máximo dentro de 1 dia após o plaqueamento.
No nosso protocolo, descreve-se a dissociação de células de fígado de ratinho CD1, seguida por purificação de células de Kupffer por centrifugação de gradiente de densidade e selecção por adesão. A caracterização de células de Kupffer, por citometria de fluxo, que demonstra rendimento e pureza elevados de células de Kupffer pode ser conseguida utilizando este método.
Este método de isolamento de células de Kupffer representa um compromisso útil entre a complexidade e o rendimento da célula. No entanto, foi relatado que certos métodos de célula de Kupffer pode ser mais fácil de realizar, tais como o protocolo descrito porWu et ai., Onde o fígado é digerido ex vivo 23. No entanto, o método descrito por Wu et ai. leva a uma quantidade limitada de células e grau de pureza inferior célula. Maior rendimento e a pureza pode ser obtido, mas requer equipamento caro e / ou sofisticado e pode ser demorado.
O protocolo original desenvolvido por Smedsrød et al., 16 utilizado um protocolo comparável com base no método de perfusão de 2 passos (HBSS + digestão com colagenase) seguido por centrifugação em gradiente de Percoll e selecção da almofada inferior de Percoll para a purificação adicional por adesão superficial. Ao modificar o procedimento de centrifugação e recolher a almofada Percoll superior, que aumentou a fracção de célula de Kupffer enriquecido a partir de 5,25 x 10 6-8,2 x 10 6 culas por grama de fígado. Esta melhoria pode ser atribuída ao uso de EGTA durante a etapa de início da perfusão, a fim de facilitar a dissociação de células de fígado. Mlém disso, o uso de análise de citometria de fluxo permitiu a caracterização quantitativa fiável de Kupffer pureza de células e a actividade fagocitária. Com um rendimento máximo de 14 x 10 6 purificadas células não parenquimatosas do fígado por ratinho. O presente método de isolamento de alcançar maior quantidade de células de Kupffer do fígado por ratinho para o que tem sido relatado na literatura 24. Esta melhoria pode ser explicado pela utilização de rato mais pesado (35-45 g), em comparação com outros métodos 24. Ao lado deste aumento no rendimento celular, a utilização de animais maiores facilita notavelmente o procedimento de canulação da veia porta.
De alta capacidade de ensaio in vitro pode ser realizada utilizando este modelo fagocítica primário, portanto, que imita o impacto toxicológico in vivo de nanopartículas. A compreensão global do nanotoxicology poderiam se beneficiar de tais modelos, tornando a seleção de nanopartículas para a tradução clínica mais eficiente. Além disso, está em consonância comimplementação do conceito de 3R (redução, refinamento e substituição) na pesquisa biomédica animal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
