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Immunology and Infection

Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad

Published: August 18, 2015 doi: 10.3791/52989

Abstract

La gran mayoría de los estudios in vitro nanotoxicological han utilizado líneas celulares inmortalizadas por su practicidad. Sin embargo, los resultados de las pruebas de toxicidad de nanopartículas en líneas celulares inmortalizadas o células primarias han mostrado discrepancias, destacando la necesidad de extender el uso de células primarias de ensayos in vitro. Este protocolo describe el aislamiento de los macrófagos del hígado del ratón, las células de Kupffer con nombre, y su uso para estudiar la toxicidad de nanopartículas. Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y constituyen parte del sistema retículo-endotelial (RES), responsable de la captura de las nanopartículas de circulación. El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método, basado en la digestión de colagenasa y centrifugación de densidad, es una adaptación del protocolo original desarrollada por Smedsrød et al. diseñado para la rata isolatio células hepáticasn y proporciona un alto rendimiento (hasta 14 x 10 6 células por ratón) y alta pureza (> 95%) de las células de Kupffer. Este método de aislamiento no requiere equipo sofisticado o caro y por lo tanto representa un compromiso ideal entre la complejidad y el rendimiento celular. El uso de ratones más pesados ​​(35-45 g) mejora el rendimiento del método de aislamiento sino que también facilita notablemente el procedimiento de canulación de la vena porta. La toxicidad de los nanotubos de carbono funcionalizados f -CNTs se midió en este modelo por el ensayo de LDH modificado. Este método evalúa la viabilidad celular mediante la medición de la falta de integridad estructural de la membrana de las células de Kupffer después de la incubación con -CNTs f. Inducida por -CNTs f toxicidad puede medirse constantemente utilizando este ensayo, destacando que las células de Kupffer aisladas son útiles para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas. La comprensión global de nanotoxicología podría beneficiarse de este tipo de modelos, por lo que la selección de nanopartículas para la traducción clínica más eficiente.

Introduction

El campo de la investigación nanotoxicología pretende caracterizar el efecto biológico de las nanopartículas. Los estudios toxicológicos sobre la base de las investigaciones in vivo siguen siendo los métodos más precisos. Sin embargo, su uso está limitado por sus requisitos de coste, tiempo y trabajo 1. Como los ensayos de alternativas, in vitro se han utilizado debido a su simplicidad y la posibilidad de desarrollar de alto rendimiento en plataformas de pruebas in vitro 2 - así se amplía el número de condiciones ensayadas. La mayoría de los estudios nanotoxicological se realizan usando ensayos in vitro con líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, hay preocupaciones con respecto a la extrapolación de estos resultados experimentales in vivo a los efectos toxicológicos 3. De hecho, las propiedades de las líneas celulares inmortalizadas pueden ser significativamente diferentes de los tejidos que se derivan de, por ejemplo, la transformación genética 4, el deterioro de las características morfológicas principales5, la pérdida de la polaridad celular 6 y alteraciones funcionales tales como la regulación de los mediadores de la inflamación 7.

Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y están directamente en contacto con la sangre por el forro de la pared de los sinusoides hepáticos. Como parte del sistema retículo-endotelial (RES), estos macrófagos son responsables de la captura de las nanopartículas de circulación y por lo tanto, constituyen un modelo muy adecuado para estudiar la toxicidad de nanopartículas. In vivo 8 e in vitro 9 estudios de respuestas inflamatorias asociadas con las células de Kupffer expuestos a nanopartículas se han publicado en otros lugares. Las células de Kupffer también se han involucrado en la patogénesis de las enfermedades hepáticas como la enfermedad alcohólica del hígado 10, fibrosis hepática o hepatitis viral 11 12. Se informó de que las células de Kupffer aisladas proporcionan información útil para describir los mecanismos celulares involved en la interrupción del hígado 13,14.

Varios métodos han sido reportados para aislar y purificar las células de Kupffer. Aislamiento de la célula puede resultar de la mecánica o enzimática de disociación 15. Digestión con colagenasa muestra la ventaja de conservar la integridad funcional de las células de Kupffer, mientras que lleva a rendimiento celular de alta Kupffer 16. Muchos enfoques experimentales, que varían en complejidad y los costes, se han utilizado para separar las células de Kupffer de otras poblaciones de células de hígado. Por ejemplo, la pureza de células Kupffer se puede lograr por inmunoafinidad 17, electroforesis de flujo 18, 16 adhesión selectiva o mediante técnicas centrífugas 16, que seleccionan las células en función de su tamaño y densidad. Una combinación de estos métodos puede ser elegido para aumentar la pureza de la población 16. No hay consenso sobre el método ideal para el aislamiento de células de Kupffer, ya que depende principalmente de la aplicación y equipamiento disponiblest. Sin embargo, en el caso de los ensayos de toxicidad de nanopartículas, la simplicidad y de alto rendimiento de la técnica asociada con la conservación funcional de las células de Kupffer parecían ser más adecuado para esta aplicación.

El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método se modificó a partir del protocolo original desarrollado por Smedsrød et al. 16 diseñado para el aislamiento de células de hígado de rata. La mayoría de los estudios informaron y describen el aislamiento de las células de Kupffer de hígado de rata. En este documento, se describe un método para aislar células de Kupffer de hígado de ratón, con un alto rendimiento y pureza. El uso de ratones reduce el coste experimento y permite el procesamiento de varios hígados para obtener grandes cantidades de células de Kupffer para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas.

En el siguiente protocolo, las células de Kupffer se incubaron con nanotubos de carbono funcionalizados (f es decir, de alta relación de longitud a diámetro y gran área de superficie, han hecho CNTs candidatos interesantes como vectores para fines de terapia y el diagnóstico. Sin embargo, han surgido preocupaciones con respecto a la toxicidad de los nanotubos de carbono 19, y el desarrollo de nuevos ensayos in vitro tiene por objeto aumentar la comprensión del efecto biológico CNT. Toxicidad en células de Kupffer se asocia con una falta de integridad estructural de la membrana celular. Esto se mide por la pérdida de la enzima LDH citoplásmica de la célula en el sobrenadante. El principio de este método, por lo tanto, es eliminar cualquier LDH liberada y medir lo que queda en las células 20. Esto se realiza con preferencia a la medición de la LDH liberada en el sobrenadante debido a la presencia de nanotubos de carbono en el sobrenadante interfiere con el ensayo 21.

Proponemos el uso de este simple y rentable metho aislamiento de células Kupfferd aislar alto número de células de Kupffer funcionales. Esto permite el cribado de toxicidad de una gama de nanopartículas, en un modelo de macrófagos primaria pertinente.

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Protocol

Todos los experimentos con animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, los reglamentos y las agencias reguladoras. El protocolo que se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación del reglamento oficina del Reino Unido Inicio

1. Perfusión y Cell Collection (Figura 1)

Figura 1
Figura 1:. Liver perfusión Después de la anestesia del ratón, el tracto digestivo se mueve lateralmente hacia la izquierda del abdomen con el fin de hacer que la vena portal (PV) accesible. El PV se canula utilizando una tasa de flujo lento (1-3 ml / min) de solución de EGTA / HBSS y el Veina cava inferior (IVC) es inmediatamente roto para evitar cualquier exceso de presión dentro del hígado. Dentro de la primera minutos de perfusión, el caudal se incrementa gradualmente a 7 ml / min. La solución de colagenasa se perfunde después a 10 ml / min hasta que se logra su digestión completa.

  1. Prepare recién todos los reactivos descritos en la tabla de material.
  2. Calentar el EGTA (etilenglicol Tetra-ácido acético) / HBSS (solución salina equilibrada de Hank) solución (50 ml por ratón) y la solución de colagenasa (100 ml por ratón) durante 30 min a 40 ° C.
  3. Enjuague el tubo flexible de la bomba primero con etanol al 70%. Verter 40 ml de solución de EGTA / HBSS en un tubo de centrífuga sumergida en el baño de agua y enjuagar el tubo flexible de la bomba con la solución de EGTA / HBSS precalentado.
  4. Realizar la anestesia terminal usando un barbitúrico para producir de forma fiable la inconsciencia antes de la depresión respiratoria y la muerte. Inyectar fenobarbital a 1 mg / kg, ip en un ratón CD1 hembra o macho (35-45 g). Confirme la anestesia mediante pellizcos dedo del pie.
  5. Afeitado pelos abdominales y esterilizar la superficie abdominal con solución de etanol al 70%.
  6. Corte a través de la cavidad abdominal y exponer la vena porta y la vena cava inferior moviendo el intestino lateralmente a la izquierda del abdomen.
  7. Estrellat la bomba a una velocidad de 1-3 ml / min con solución de EGTA / HBSS y canular la vena portal usando una aguja de 23 g mariposa (alas cortadas). Abrazadera de la sección de la vena portal canulado con la aguja 23 G y, a continuación voltear el fórceps serrefine en la superficie del abdomen del ratón abierto. El hígado debe pálido rápidamente dentro de los primeros 30 segundos de la perfusión EGTA Solución / HBSS.
  8. Rápidamente incisión en la parte inferior de la vena cava inferior para evitar edificio exceso de presión en el hígado, y luego aumentar la velocidad de flujo gradualmente a 7 ​​ml / min, sobre la primera minutos de perfusión. El animal muere debido a la hemorragia secundaria a la vena cava punción venosa.
  9. Cuando menos de 5 ml de solución EGTA / HBSS es permanecer en el tubo de centrífuga, llenarlo con colagenasa solución (40-50 ml). Aumentar la tasa de flujo gradualmente a 10 ml / min, durante 30 s.
  10. Hacer que el hígado se inflame mediante la aplicación de presión a la vena cava inferior, usando pinzas, para los intervalos de 5-10 seg. This se puede hacer periódicamente (5-10 veces durante la digestión). Este paso va a mejorar la disociación de células del hígado y reducir el tiempo de perfusión con colagenasa.
  11. Cuando menos de 10 ml de solución de colagenasa se mantiene dentro del tubo de centrífuga, se vierte 40-50 ml de la solución de pre-calentado colagenasa en el tubo de centrífuga.
  12. Después de 10-15 min de perfusión y unos 70-80 ml de solución de colagenasa perfundidos, aplicar una pequeña presión sobre la superficie del hígado con un fórceps. Una impresión de la presión indica que las células hepáticas se disocian.
  13. Retire el hígado de la cavidad abdominal como una sola pieza y colocarla en un tubo de centrífuga que contiene 20 a 30 ml de células Kupffer Aislamiento medio. Mantenga las células del hígado en hielo oa 4 ° C durante un período máximo de 3 horas para no afectar la viabilidad celular hepática.
  14. Repita el procedimiento de perfusión en varios animales si es necesario, manteniendo el hígado perfundido en hielo. Piscina dos y cincuenta y nueve hígados para la purificación y proceder con la etapa 3.

2. Preparación del gradiente de densidad para la centrifugación (Figura 2)

Figura 2
Figura 2:. Preparación del gradiente de densidad Todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones estériles. El SIP se prepara mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice revestido con 1,7 ml de 10 x PBS. A 5 ml de SIP se mezclan con 15 ml de PBS para hacer una solución SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP se mezclan con 10 ml de PBS para hacer una solución SIP 20 ml de 50%. Un tubo de centrífuga que contiene la solución de 50% SIP (20 ml) se inclina y la solución SIP 25% (20 ml) se añade lentamente usando una pipeta serológica de 25 ml.

  1. Continúe con los pasos siguientes (artículo 2., 3. y 5.) bajo condiciones estériles y mantener las células en hielo oa 4 ° C. Prepare el SIP (Solución de partículas de sílice recubiertas isotónica) mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice revestido con 1,7 ml de 10 x PBS. Para hacer 20 ml de solución de SIP 25%, mezclar 5 ml de SIP con 15 ml de PBS. Para hacer 20 ml de solución de SIP 50%, mezclar 10 ml de SIP con 10 ml de PBS.
  2. Llene un tubo de centrífuga con 20 ml de la solución de SIP 50%. Incline el tubo de centrífuga en un ángulo próximo a 90 ° y se añade lentamente la solución SIP 25% (20 ml) en la pared lateral del tubo utilizando una pipeta serológica de 25 ml, sin tocar la superficie de la capa de SIP 50%. Cuando la adición de la solución SIP 25%, reducir progresivamente el ángulo del tubo. Mantenga el gradiente de densidad en hielo hasta su uso.

3. Kupffer Purificación celular (Figura 3)

Figura 3
Figura 3:. La purificación de las células de Kupffer por centrifugación en gradiente de densidad y la adhesión celular Todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones estériles. (A) Después de la rotura de la cápsula de Glisson, las células del hígado se filtran a través de un 100 micras colador. La suspensión se centrifugó a 50 x g para descartar hepatocitos (pellets) y recoger la fracción de células no parenquimatosas (sobrenadante). Este paso se repite 3 veces. Las células no parenquimatosas se añaden en la parte superior de un gradiente discontinuo isotónica y se centrifugaron a 800 xg durante 15 min. Las células de Kupffer recogidos de la almohadilla SIP 25% se purifican adicionalmente por la selección de la adhesión celular. (B) Las células se sembraron en placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO2 durante 30 min. Las células no adherentes se lavaron una vez con 500 l de HBSS. Las células de Kupffer muestran su morfología adherente 4 hr después de la siembra, cuando -CNTs f se pueden añadir a las células. La barra de escala representa 25 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Poner un hígado perfundido en un plato de Petri con 15 ml de aislamiento de células Kupffer Medium. Romper la cápsula de Glisson (membrana del hígado) usando tijeras y liberar todas las células hepáticas en el medio de aislamiento de células Kupffer. Filtrar la solución a través de un filtro de células de 100 micras que se recoge en un tubo de centrífuga. Repita el procedimiento de perfusión de hígados perfundidos adicionales y poner en común las células en el mismo tubo de centrífuga (15 ml de un ratón, hasta 45 ml de tres ratones).
  2. Centrifugar la suspensión celular a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Las células del parénquima (hepatocitos) estarán en el sedimento y las células no parenquimatosas (incluyendo células de Kupffer) estarán en el sobrenadante.
  3. Recoger el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio y centrifugar a 50 xg durante 2 min cada una. Repita este paso tres veces más.
  4. Centrifugar a 1350 xg durante 15 min para sedimentar las células no parenquimatosas. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de Kupffer aislamiento de células Medio.
  5. Añadir la solución de células no parenquimatosas en el gradiente isotónico discontinua 25/50% como se describe en 2.3. Centavorifuge a 850 xg durante 15 min sin aceleración o descanso.
  6. Localizar la fracción de células Kupffer enriquecido que aparece turbia dentro de la fracción SIP 25% cerca de la interfaz de SIP 25/50% (Figura 3). Usando una pipeta serológica de 10 ml, aspirado sobre 12 ml de la fracción de células Kupffer enriquecido. La transferencia de células en un tubo de centrífuga que contiene 35 a 40 ml de Kupffer aislamiento de células Medio. Mezclar suavemente y centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar las células.
  7. Deseche las células sobrenadante y resuspender en 5-10 ml de pre-calentado célula Kupffer medio de cultivo. Recuento de células (hemocitómetro) y medir la viabilidad mediante la tinción de azul de tripano.
  8. Placa de las células no parenquimatosas purificadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 10 5 células / pocillo. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 (Figura 3). Después de 30 minutos, retire con cuidado el medio, lavar con pre-calentado solución salina equilibrada de Hank (HBSS) una vez que vuelva a colocarcon 500 l de fresco y pre-calentado Kupffer Cell Culture Medium (por pocillo).
  9. Deja células de Kupffer durante al menos 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2 antes del tratamiento con nanopartículas, para permitir que adquieran su morfología adherente.

4. Caracterización

  1. Las células de Kupffer Pureza
    1. Preparar fresca solución de PBS / BSA utilizado para mantener la viabilidad de células de Kupffer. Lavar las células una vez con 500 l de solución de PBS / BSA. Retire la solución de PBS / BSA y separar las células de Kupffer en 500 l de solución de PBS / BSA fresca utilizando raspado suave. Cuando las células se sembraron en placas de 24 pocillos, acortar los extremos de las cuchillas raspadoras con tijeras para hacer más fácil el desprendimiento de proceder. Transferencia de células en tubos de citometría de flujo.
    2. Contar las células de Kupffer utilizando un hemocitómetro y centrifugar 1 x 10 5 células a 1350 x g. Resuspender las células de Kupffer en 30 l de F4 / 80 anticuerpo (puro). Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Mantener las células no teñidas (no incubadas con el anticuerpo) en hielo.
    3. Añadir 2 ml de solución de PBS / BSA en células teñidas, se centrifuga a 1350 g durante 5 min y descartar el sobrenadante resultante. Resuspender las células teñidas en 200 l de PBS / BSA.
    4. Para el análisis de citometría de flujo, puerta 10000 sin teñir las células de Kupffer de acuerdo a su tamaño (dispersión hacia adelante) y granularidad (dispersión lateral). Analizar la fluorescencia de las células cerradas en FL-1 canal.
    5. Repita el procedimiento para las células de Kupffer manchadas manteniendo los mismos ajustes utilizados para la citometría de flujo análisis de las células de Kupffer sin teñir. Seleccionar y cuantificar la fluorescencia de las células teñidas para evaluar la pureza de las células de Kupffer.
  2. Kupffer célula fagocítica Actividad
    1. Reemplace los medios con un 0,5% (v / v) perlas fluorescentes en Kupffer Cultivo Celular Medio e incubar durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
    2. Con el fin de eliminar las perlas no internalizadas, células de Kupffer de centrífuga a 1350 xg, discard las células sobrenadante y resuspender en 500 l de PBS Solución / BSA. Repita este paso 2 veces más.
    3. Raspe células de Kupffer en 500 l de células de la solución y de transferencia de PBS / BSA en un tubo de citometría de flujo.
    4. Centrifugar las células de Kupffer en 1350 xg, descartan las células sobrenadante y resuspender en 200 l de PBS Solución / BSA.
    5. Para el análisis de citometría de flujo, puerta 10000 sin teñir las células de Kupffer de acuerdo a su tamaño (dispersión hacia adelante) y granularidad (dispersión lateral). Analizar la fluorescencia de las células cerradas en FL-2 canal.

5. La incubación de carbono funcionalizados químicamente nanotubos (f -CNTs)

  1. Preparar una dispersión de -CNTs f (1 mg / ml) en agua por tratamiento con ultrasonidos durante 15 minutos antes de su uso. -CNTs F se preparan en la casa 22.
  2. Preparar 2x CNT f- concentrados dispersión en Kupffer Cell Culture Medium. CNT f- sonicado dispersas en un medio para2 min antes de proceder con el paso 5.3).
  3. Para cada bien, sustituya 250 l de edad media con 250 l de 2x dispersión -CNTs f. Pozos sin tratar (250 l de medio acondicionado + 250 l de fresco Kupffer Cell Culture Medium) y los pocillos tratados con 10% de DMSO se utilizan como control negativo y positivo, respectivamente.
  4. Se incuban las células de Kupffer a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 o 72 horas.

6. Evaluación de la toxicidad de -CNTs f en células de Kupffer por la lactato deshidrogenasa (LDH) Ensayo Modificado

  1. Eliminar el sobrenadante.
  2. Añadir 200 l (por pocillo de placa de 24 pocillos) de tampón de lisis y se incuba a 37 ° C durante 30 min-1 hr.
  3. Después de llevar a cabo el pipeteo vigoroso, recoja lisaron las células de Kupffer en tubos de microcentrífuga y se centrifuga a 40.000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que fueron tomados por las células y los restos celulares.
  4. Reunir los sobrenadantes (ƒ-CNT gratuita) entubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C o vaya al paso 6.5).
  5. Transferencia de 50 l en una placa de 96 pocillos y añadir un volumen igual de la solución de mezcla de sustrato (kit LDH) a cada pocillo. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes de añadir 50 l de la solución de parada (kit LDH). Añadir triplicados de pocillos de blanco que contienen 50 l de tampón de lisis, 50 l de solución de mezcla de sustrato y 50 l de solución de parada.
  6. Leer la absorbancia a 490 nm en un lector de microplacas y utilizar la siguiente fórmula para calcular el (%) la viabilidad celular.

Ecuación 1

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Representative Results

El número de células parenquimatosas no purificadas era consistente y varió entre 8 y 14 x 10 6 células por ratón (se realizaron 17 aislamientos). Cada aislamiento ratón era suficiente a la placa 16 a 28 pozos. La viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano demostró la viabilidad celular ~ 95%. Las células de Kupffer mostraron una forma redonda dentro de 30 min de incubación a 37 ° C, en relación con su morfología adherente incompletos (Figura 4A). A las 4 horas de incubación y después, las células se propagan y grupos de células comenzaron a formarse.

Las células de Kupffer se caracterizan entonces para confirmar su pureza y actividad fagocítica. Las células se tiñeron con F4 / 80 anticuerpo para demostrar la pureza de células Kupffer. Citometría de flujo análisis mostró pureza células de Kupffer por encima de 95% (Figura 4B). Las células se incubaron con 1 m perlas fluorescentes, 12 horas después de la siembra, para confirmar su capacidad de absorber las partículas grandes. Análisis de citometría de flujo mostró that más del 85% de las células de Kupffer son fagocitosis, es decir, puede llevar hasta los 1 m granos (Figura 4C). Después de 72 horas de cultivo, el 40% de las células de Kupffer eran fagocitosis, lo que indica que las células de Kupffer perdieron parcialmente su actividad fagocítica.

Microscopía de imágenes de células de Kupffer incubadas con -CNTs f para 24 y 72 hr reveló la morfología celular similar en comparación con las células naïve (figura 5A). Las células de Kupffer incubadas con 10% de DMSO (control positivo) muestran la morfología necrótica (Figura 5A). Tras el análisis del ensayo de LDH modificado, las células de Kupffer tratados con 10% de DMSO (control positivo) para 24 y 72 hr mostraron alta toxicidad (Figura 5B). En comparación, -CNTs f inducidos reducción ligera pero significativa en la viabilidad celular sólo cuando las células se expusieron a 50 g / ml durante 72 h (Figura 5B).

Figura 4
Figura 4: Pureza y captación Habilidades de las células de Kupffer (A) imágenes microscópicas de las células de Kupffer chapados después de 30 minutos o 24 horas a 37 ° C con una atmósfera de 5% de CO 2.. La barra de escala presenta 50 micras. (B) el análisis de citometría de flujo de las células de Kupffer se llevó a cabo después de FSC / SSC gating celular. Pureza células de Kupffer se determinó utilizando / tinción de anticuerpos F4 80 y mostró estar por encima de 95%. Las células (C) de Kupffer se incubaron durante 4 h en presencia de 1 m perlas fluorescentes para evaluar su actividad fagocítica. Las propiedades funcionales de Kupffer se mantuvieron mejor en células recién aisladas (12 hr después de la siembra) en comparación con células de la prueba después de 3 días.

Figura 5
Figura 5: La captación y la toxicidad de <em> CNT f- en células de Kupffer. (A) Imágenes de microscopía de las células de Kupffer. Las imágenes muestran células de Kupffer tratados con 10% de DMSO y 50 g / ml de -CNTs F a 37 ° C durante 24 y 72 h. La barra de escala presenta 50 micras. (B) Ensayo de LDH Modificado. La viabilidad celular de baja se observó en 10% de DMSO células tratadas (controles positivos), mientras -CNTs f afectaron significativamente la viabilidad celular sólo después de la exposición a 50 mg / ml durante 72 horas. * P <0,05 con respecto a la condición naïve (excluyendo 10% condición DMSO) utilizando el análisis de varianza (ANOVA de una vía) con análisis post hoc mediante la prueba de Tukey. La barra de escala corresponde a 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los siguientes pasos son fundamentales para lograr un alto rendimiento y una alta viabilidad de las células de Kupffer. Las condiciones asépticas deben utilizarse para limitar el riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. Todos los instrumentos deben ser esterilizados antes de su uso. Los reactivos deben prepararse justo antes de llevar a cabo el procedimiento de aislamiento.

La elección de la colagenasa IV, con baja actividad tríptico, es crucial. Los diferentes lotes del mismo proveedor tienen diferente actividad enzimática y pueden necesitar ser comparado inicialmente para seleccionar el lote más adecuado para el aislamiento de células de Kupffer. Esto se puede juzgar mediante la evaluación de rendimiento de células y la viabilidad celular. También se recomienda ponerse en contacto con el proveedor para proporcionar lotes que se han utilizado para aplicaciones similares. Una vez decidido el lote a utilizar, reservar para su uso futuro.

El procedimiento de canulación requiere entrenamiento. Planificar el uso de varios animales para convertirse en confidente con la vena portaprocedimiento de canulación. Con la práctica, la canulación exitosa se logra fácilmente y el procedimiento puede ser manejado por una persona. Tenga en cuenta que el uso de animales pesados ​​aumenta el diámetro de la vena porta y por lo tanto facilita el procedimiento. Cuando se perfora la pared posterior de la vena porta, es técnicamente difícil acceder a la veta de nuevo, especialmente si usted es nuevo con este procedimiento y por lo tanto, es preferible comenzar con un nuevo animal.

Las soluciones HBSS y colagenasa deben tener su pH se ajustó a 7,4 y se pre-calienta a 40 ° C para alcanzar una temperatura de salida de la bomba peristáltica de 37 ° C. La perfusión con EGTA Solución / HBSS (Ca 2+ y Mg 2+ libre) se necesita que contiene EGTA para la interrupción de Ca 2+ moléculas de adhesión dependientes, llamado desmosome, lo que debilita la interacción célula-célula. Colagenasa tipo IV se utiliza para separar las células del hígado a partir de la matriz extracelular y así dar lugar a hígadodisociación celular. El tiempo de perfusión para las dos soluciones no debe exceder de 15 min para ratones CD1 pero otras cepas, tales como C57BL / 6, requieren un poco más largo tiempo de digestión hígado.

Para lograr un aislamiento exitoso, es necesario para obtener un alto rendimiento y la viabilidad celular. Si el experimentador no tiene experiencia en el aislamiento de células del hígado, se aconseja combinar pastillas de hepatocitos a partir de los primeros 3 centrifugaciones a 50 xg y contar las células mediante el ensayo de exclusión de azul tripán. El rendimiento de hepatocitos debe ser> 20 x 10 6 células y la viabilidad de los hepatocitos> 50%. Los bajos rendimientos resultan esencialmente de pobres disociación celular que conduce indirectamente a bajar el rendimiento de células de Kupffer. Debe confirmarse que el hígado se digiere correctamente al final de la etapa de la perfusión. Cuando se alcanza el rendimiento de hepatocitos adecuada en combinación con la viabilidad de los hepatocitos baja, esto puede ser el resultado de una digestión colagenasa excesivo, pero es más probable que se explica por un hígado inapropiadoprocedimiento de perfusión o el uso de un reactivo / material contaminado.

Después de placas, las células de Kupffer son sensibles y se deben lavar con delicadeza. Por lo menos 4 horas son necesarias para las células de Kupffer para adquirir su morfología adherente. El tratamiento se lleva a cabo generalmente 4-24 horas después de la siembra, como células de Kupffer muestran su máxima actividad fagocítica plazo de 1 día después de la siembra.

En nuestro protocolo, se describe la disociación de las células de hígado de ratón CD1 seguido por la purificación de las células de Kupffer por centrifugación en gradiente de densidad y selección por adherencia. La caracterización de las células de Kupffer, por citometría de flujo, demuestra que el alto rendimiento y la pureza de las células de Kupffer se pueden alcanzar usando este método.

Este método de aislamiento de células Kupffer representa un compromiso valioso entre complejidad y rendimiento celular. Sin embargo, se informó que ciertos métodos de células de Kupffer puede ser más fácil de llevar a cabo, tales como el protocolo descrito porWu et al., En el que el hígado se digiere ex vivo 23. Sin embargo, el método descrito por Wu et al. conduce a una cantidad limitada de células y la pureza celda inferior. Mayor rendimiento y la pureza se pueden obtener, pero requieren un equipo costoso y / o sofisticada y puede llevar mucho tiempo.

El protocolo original desarrollado por Smedsrød et al. 16 utiliza un protocolo comparable basado en el método de perfusión de 2 pasos (HBSS + digestión con colagenasa), seguido por centrifugación en gradiente de Percoll y la selección del cojín inferior Percoll para la purificación adicional por adhesión superficial. Al modificar el procedimiento de centrifugación y recogiendo el cojín superior Percoll, aumentamos la fracción enriquecida de células Kupffer de 5,25 x 10 6 a 8,2 x 10 6 células por gramo de hígado. Esta mejora puede atribuirse a la utilización de EGTA durante la etapa de perfusión temprano con el fin de facilitar la disociación de las células del hígado. Moreover, el uso de citometría de flujo análisis permitió la caracterización cuantitativa fiable de pureza células de Kupffer y la actividad fagocítica. Con un rendimiento máximo de 14 x 10 6 células no parenquimatosas purificados por el hígado del ratón. El presente método de aislamiento lograr una mayor cantidad de células de Kupffer por el hígado del ratón a lo que se ha reportado en la literatura 24. Esta mejora puede ser explicado por el uso de ratón más pesado (35-45 g) en comparación con otros métodos 24. Además de este aumento en el rendimiento de células, el uso de animales más grandes facilita notablemente el procedimiento de canulación de la vena porta.

De alto rendimiento en las pruebas in vitro puede llevarse a cabo usando este modelo fagocítica primaria, por lo tanto, imitando el impacto toxicológico in vivo de nanopartículas. La comprensión global de nanotoxicología podría beneficiarse de este tipo de modelos, por lo que la selección de nanopartículas para la traducción clínica más eficiente. Además, está en línea conla aplicación del concepto de 3 R (reducción, refinamiento y reemplazo) en la investigación biomédica animal.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthatal (pentobarbital sodium) Merial
CD1 mice Charles River   - Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. 
HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)   Life Technologies   14175-053 HBSS must be  Ca2+ free. 
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt  Sigma-Aldrich   E8145   EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. 
HEPES (1 M)  Life Technologies   15630-056  100 ml 
Collagenase type IV  Worthington  CSL-4  It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation 
 Low glucose DMEM  Sigma-Aldrich   D5523  500 ml 
RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax)  Life Technologies   12633-012  500 ml
Penicillin/Steptomycin  Life Technologies   15140-122 100 ml
Fetal Bovine Serum  First-Link   60-00-850  500 ml 
Trypan blue solution  Sigma-Aldrich  T8154  100 ml 
Coated silica particle solution (Percoll) GE Healtcare   17-0891-02  Percoll® is very stable and can be kept for several years 
1x Phosphate Buffered Saline   Life Technologies   10010-023 500 ml 
10x Phosphate Buffered Saline   Life Technologies   70011-036 500 ml
Dimethyl sulfoxide  Fisher  D/4120/PB08  500 ml 
LDH kit (CytoTox 96)  Promega  G1781  Keep protected from light 
DMEM phenol red free Life Technologies   31053-028  500 ml 
F4/80 antibody (Alexa 488) AbD Serotec MCA497A488 Do not dilute, used neat for flow cytometry
Fluorescent beads Sigma L2778 Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml
Name of the Material Company  Catalog number  Comments/Description 
Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing)   BD  367288
Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim)  Minisart  16534-K 
Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)  BD Biosciences, Falcon  35 2070 
Petri dish (90 x 15 mm)  Thermo Fisher Scientific   BSN 101VR20 
100 μm cell strainer   BD   352360
Peristaltic pump  Watson Marlow  SciQ 300   Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.
24-well plates Corning   3526
96-well plates  Corning   3595
Centrifuge  Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Serrefine forceps Hammacher GmbH  Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon  352052
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Elkay   000-MICR-150
Cell scraper BD Biosciences, Falcon 353086 Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.
Name of the Reagent Company  Catalog number  Comments/Description 
 EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution  HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.  
Collagenase Solution  DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. 
Kupffer Cell Isolation Medium  RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.  
Kupffer Cell Culture Medium  RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.  
SIP (solution of isotonic coated silica particles) Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline  with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP.
25% SIP solution  Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline  
50% SIP solution  Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline 
Lysis Buffer DMEM media with 0.9% Triton X-100
PBS/BSA Solution Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. 

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References

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Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad
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Bourgognon, M., Klippstein, R.,More

Bourgognon, M., Klippstein, R., Al-Jamal, K. T. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (102), e52989, doi:10.3791/52989 (2015).

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