Abstract
Det stora flertalet av nanotoxicological in vitro studier har använt odödliggjorda cellinjer för deras genomförbarhet. Dock har resultaten från tester nanopartiklar toxicitet i odödliggjorda cellinjer eller primära celler visade avvikelser, belyser behovet av att utöka användningen av primära celler för in vitro-analyser. Detta protokoll beskriver isolering av mus lever makrofager, som heter Kupfferceller, och deras användning för att studera nanopartiklar toxicitet. Kupfferceller är den vanligast förekommande makrofag befolkningen i kroppen och utgör en del av retikuloendotelialsystemet (RES), som ansvarar för fångst av cirkulerande nanopartiklar. Kupffer-cellisoleringsförfarande som rapporteras här är baserad på en 2-stegs perfusion metod följt av rening på densitetsgradient. Metoden, baserad på kollagenasspjälkning och densitetscentrifugering, är anpassad från den ursprungliga protokoll som utvecklats av Smedsrød et al., utformad för råttleverceller isolation och tillhandahåller högt utbyte (upp till 14 x 10 6 celler per mus) och med hög renhet (> 95%) av Kupffer-celler. Detta isoleringsförfarande kräver inte sofistikerad eller dyr utrustning och utgör därför en idealisk kompromiss mellan komplexitet och cellutbyte. Användningen av tyngre möss (35-45 g) förbättrar utbytet av isoleringsmetod utan underlättar också anmärkningsvärt förfarandet i portvenen kanyle. Toxicitet funktion kolnanorör f -CNTs mättes i denna modell av den modifierade LDH-analysen. Denna metod bedömer cellviabilitet genom att mäta bristen på strukturell integritet Kupffer cellmembran efter inkubation med f -CNTs. Toxicitet inducerad av f -CNTs kan mätas konsekvent använda denna analys, med tonvikt på att isolerade Kupfferceller är användbar för testning nanopartiklar toxicitet. Den övergripande förståelse för nanotoxikologi kan dra nytta av sådana modeller, vilket gör nanopartiklar val för klinisk översättning mer effekräcklig.
Introduction
Området för nanotoxikologi forskning syftar till att karakterisera den biologiska effekten av nanopartiklar. Toxikologiska studier baserade på in vivo undersökningar fortfarande de mest exakta metoder. Emellertid är deras användning begränsad av deras kostnader, arbets- och tidskrav 1. Som alternativ, in vitro-analyser har använts på grund av sin enkelhet och möjligheten att utveckla hög genomströmning in vitro testplattformar 2 - så utöka antalet testade betingelser. De flesta nanotoxicological studier genomförs med användning av in vitro-analyser med odödliggjorda cellinjer. Det finns dock oro över extrapolering av dessa experimentella resultat till in vivo toxikologiska effekter 3. I själva verket, kan egenskaperna hos immortaliserade cellinjer vara betydligt annorlunda från vävnader de härleddes från, t.ex. genetisk transformation 4, försämring av viktiga morfologiska särdrag5, förlust av cellulär polaritet 6 och funktionella förändringar såsom reglering av inflammatoriska mediatorer 7.
Kupffer-celler är de mest förekommande makrofag befolkningen i kroppen och är direkt i kontakt med blod genom att rikta väggen av leversinuskurvor. Som en del av retikuloendotelialsystemet (RES), dessa makrofager ansvarar för fångst av cirkulerande nanopartiklar och därför utgör en mycket lämplig modell för att studera nanopartiklar toxicitet. In vivo 8 och in vitro 9 studier av inflammatoriska svar i samband med Kupfferceller exponerats för nanopartiklar har publicerats någon annanstans. Kupfferceller har också varit involverad i patogenesen av leversjukdomar såsom alkoholrelaterad leversjukdom 10, leverfibros 11 eller viral hepatit 12. Det rapporterades att isolerade Kupfferceller ge användbar kunskap för att beskriva cellulära mekanismer involved i leverstörningar 13,14.
Flera metoder har rapporterats för att isolera och rena Kupfferceller. Cell isolering kan bero på mekanisk eller enzymatisk dissociation 15. Kollagenasdigestion visar fördelen med att bevara den funktionella integriteten av Kupffer-celler, samtidigt som de leder till högt Kupffer cellutbyte 16. Många experimentella metoder, som varierar i komplexitet och kostnader, har använts för att separera Kupffer-celler från andra levercellpopulationer. Till exempel kan Kupffer cell renhet uppnås genom immunoaffinitetskromatografi 17, flöde elektrofores 18, selektiv vidhäftning 16 eller genom centrifugal tekniker 16, som väljer celler beroende på deras storlek och täthet. En kombination av dessa metoder kan väljas för att öka renheten av befolkningen 16. Det råder ingen konsensus om den idealiska metoden för Kupffer cellisolering, eftersom det främst beror på tillämpningen och tillgängliga anläggningt. Emellertid, i fallet med provning nanopartiklar toxicitet, föreföll enkelheten och högt utbyte av den teknik som associeras med den funktionella bevarandet av Kupffer-celler att vara mest lämplig för denna tillämpning.
Kupffer-cellisoleringsförfarande som rapporteras här är baserad på en 2-stegs perfusion metod följt av rening på densitetsgradient. Metoden ändrades från den ursprungliga protokoll som utvecklats av Smedsrød et al. 16 utformad för råttlever cellisolering. De flesta studier rapporteras och beskrivs isoleringen av Kupffer-celler från råttlevrar. Häri beskriver vi en metod att isolera Kupfferceller från muslever, vid ett högt utbyte och renhet. Användningen av möss minskar experimentet kostnaden och möjliggör behandling av flera lever för att få stora mängder Kupfferceller för att testa nanopartiklar toxicitet.
I följande protokoll, var Kupffer-celler inkuberades med funktionaliserade kolnanorör (f dvs hög förhållande mellan längd och diameter och stor yta, har gjort cnts intressanta kandidater som vektorer för terapi och diagnos ändamål. Emellertid har farhågor väckts angående toxicitet cnts 19, och utvecklingen av nya in vitro-test syftar till att öka förståelsen för CNT biologisk effekt. Toxicitet i Kupffer-cellen är associerad med en brist på strukturell integritet hos cellmembranen. Detta mäts genom förlusten av den cytoplasmatiska enzymet LDH från cellen till supernatanten. Principen för denna metod är därför att avlägsna eventuellt utsläppt LDH och mäta vad som är kvar i cellerna 20. Detta görs i stället för att mäta den frigjorda LDH i supernatanten eftersom närvaron av cnts i supematanten stör analysen 21.
Vi föreslår användning av denna enkla och kostnadseffektiva Kupffer cellisolering metod för att isolera högt antal funktionella Kupfferceller. Detta möjliggör screening av toxiciteten för en rad nanopartiklar, i en relevant primär makrofag modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med alla relevanta riktlinjer, regler och tillsynsmyndigheter. Protokollet som demonstreras utfördes under ledning och godkännande av brittiska inrikesdepartementet förordning
1. Perfusion och Cell Collection (Figur 1)
Figur 1:. Leverperfusion Efter anestesi av musen, mag-tarmkanalen är lateralt flyttas till vänster av buken, för att göra portvenen (PV) som är åtkomlig. PV kanyleras med användning av en långsam flödeshastighet (1-3 ml / min) av EGTA / HBSS-lösning och den underlägsna veina cava (IVC) är omedelbart brista för att undvika eventuellt övertryck inuti levern. Inom den första minuten av perfusionen, är flödeshastigheten gradvis till 7 ml / min. Kollagenaslösning därefter perfuseras vid 10 ml / min tills dess fulla matsmältning uppnås.
- Prepare nyligen alla reagenser som beskrivs i materialet tabellen.
- Värm EGTA (etylenglykol tetraättiksyra) / HBSS (Hanks balanserade saltlösning) Lösning (50 ml per mus) och kollagenaslösning (100 ml per mus) under 30 min vid 40 ° C.
- Skölj pumpen flexibla slangen först med 70% etanol. Häll 40 ml av EGTA / HBSS lösning i ett centrifugrör nedsänkt i vattenbadet och skölj pumpen böjlig slang med förvärmda EGTA / HBSS lösning.
- Utför terminal anestesi med hjälp av en barbiturat att tillförlitligt producera medvetslöshet innan andningsdepression och död. Spruta fenobarbiton på 1 mg / kg, ip i en kvinnlig eller manlig CD1 mus (35-45 g). Bekräfta anestesi genom tå nypa.
- Raka buken hårstrån och sterilisera den abdominala ytan med användning av 70% etanollösning.
- Skär genom bukhålan och exponera portvenen och nedre hålvenen genom att flytta tarmarna i sidled till vänster om buken.
- Start pumpen med en hastighet av 1-3 ml / min med EGTA / HBSS lösning och kanylera portvenen med hjälp av en 23 g fjärilsnål (vingar skär). Kläm fast sektionen av portalen ven kanyl med 23 G-nål och sedan vända serrefine pincett vid ytan av den öppnade musen buken. Levern bör snabbt blek i den första 30 sekunder av EGTA / HBSS lösning perfusion.
- Snabbt incisionsfilm den nedre delen av den nedre hålvenen för att undvika övertryck byggnad i levern, och öka sedan flödeshastigheten gradvis till 7 ml / minut, över den första minuten av perfusion. Djuret dör på grund av blödning sekundärt till vena cava venpunktion.
- När mindre än 5 ml EGTA / HBSS lösning återstår i centrifugröret, fylla den med kollagenas lösning (40-50 ml). Öka flödeshastigheten gradvis till 10 ml / min, under 30 sek.
- Gör levern svälla genom att applicera tryck på den nedre hålvenen, med användning av pincett, för 5-10 sek intervall. This kan göras med jämna mellanrum (5-10 gånger under matsmältningen). Detta steg kommer att förbättra levercell dissociation och minska perfusionen tid med kollagenas.
- När mindre än 10 ml kollagenaslösning förblir inom centrifugröret, häll 40-50 ml förvärmda kollagenas lösning i centrifugröret.
- Efter 10-15 minuter av perfusion och ca 70-80 ml kollagenas lösning perfusion, fäst ett litet tryck på ytan av levern med en tång. Ett tryck av trycket indikerar att leverceller skiljas.
- Ta levern från bukhålan som ett stycke och placera den i ett centrifugrör innehållande 20-30 ml Kupfferceller Isolering Medium. Håll leverceller på is eller vid 4 ° C under en period av 3 h maximalt för att undvika att påverka lever cellviabilitet.
- Upprepa perfusion proceduren på flera djur om det behövs, samtidigt som perfusion levern på is. Pool 02:59 lever för rening och fortsätta med steg 3.
2. Framställning av densitetsgradienten för centrifugering (figur 2)
Figur 2:. Framställning av densitetsgradienten Alla förfaranden utförs under sterila tillstånd. SIP framställs genom att blanda 15,3 ml av överdragen silika partikellösningen med 1,7 ml 10 X PBS. A 5 ml SIP blandas med 15 ml PBS för att göra 20 ml av 25% SIP lösning. 10 ml av SIP-blandas med 10 ml PBS för att göra 20 ml av 50% SIP lösning. En centrifugrör innehållande SIP lösning 50% (20 ml) lutas och SIP lösning 25% (20 ml) tillsättes långsamt med hjälp av en serologisk 25 ml pipett.
- Fortsätt med följande steg (avsnitt 2., 3. och 5.) under sterilt skick och hålla cellerna på is eller vid 4 ° C. Förbered SIP (lösning av Isoton belagda kiseldioxidpartiklar) genom att blanda 15,3 ml överdragen silika partikellösningen med 1,7 ml 10 X PBS. För att göra 20 ml av 25% SIP lösning, blanda 5 ml SIP med 15 ml PBS. För att göra 20 ml av 50% SIP lösning, blanda 10 ml SIP med 10 ml PBS.
- Fyll en centrifugrör med 20 ml av SIP lösning 50%. Luta centrifugröret med en vinkel nära 90 ° och tillsätt långsamt SIP lösning (20 ml) 25% på sidoväggen av röret med användning av en 25 ml serologisk pipett, utan att röra vid ytan av 50% SIP skikt. När man lägger SIP lösning 25%, progressivt minska vinkeln av röret. Håll densitetsgradienten på is fram till användning.
3. Kupffer Cell Rening (Figur 3)
Figur 3:. Rening av Kupfferceller genom densitetsgradientcentrifugering och celladhesion Alla förfaranden utförs under sterila tillstånd. (A) Efter bristning av Glisson kapsel, är leverceller filtrerades genom en en00 um sil. Suspensionen centrifugeras vid x 50 g för att göra sig av hepatocyter (pellets) och samla den icke-parenkymala cellfraktionen (supematant). Detta steg upprepas tre gånger. Icke-parenkymala cellerna tillsätts på toppen av en diskontinuerlig isotonisk gradient och centrifugerades vid 800 xg under 15 minuter. Kupfferceller samlats in från SIP dynan 25% renas ytterligare genom att välja celladhesion. (B) Celler pläterades i 24-brunnsplatta och inkuberades vid 37 ° C och 5% CO2 under 30 minuter. Icke-vidhäftande celler tvättas en gång med 500 | il HBSS. Kupfferceller visa sin vidhäftande morfologi 4 timmar efter plätering, då f -CNTs kan läggas till cellerna. Skalstrecket representerar 25 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Sätt en perfusion lever i en petriskål med 15 ml Kupffer Cell Isolation Medium. Spräcka Glisson kapsel (membran av levern) med sax och frige alla leverceller i Kupffer-cellisoleringsmedium. Filtrera lösningen fastän en 100 | im cellfilter som skall samlas i ett centrifugrör. Upprepa perfusion förfarandet om ytterligare perfuserade levrar och slå samman celler i samma centrifugrör (15 ml från en mus, upp till 45 ml från tre möss).
- Centrifugera cellsuspensionen vid 50 x g under 2 minuter vid 4 ° C. Parenkymala celler (hepatocyter) kommer att vara i pelleten och icke-parenkymala celler (inklusive Kupffer-celler) kommer att vara i supernatanten.
- Samla upp supernatanten i ett rent centrifugrör och centrifugera vid 50 xg under 2 min vardera. Upprepa detta steg tre gånger.
- Centrifugera vid 1350 xg under 15 minuter för att pelletera icke-parenkymceller. Kasta supernatanten och suspendera pelleten i 10 ml Kupffer Cell Isolation Medium.
- Lägg till det icke-parenkymalcellen lösningen på diskontinuerliga isoton gradient 25/50% som beskrivs i 2.3. Centrifuge vid 850 xg under 15 min utan acceleration eller paus.
- Lokalisera anrikade Kupffer cellfraktionen som uppträder grumlig inom 25% SIP fraktion nära SIP gränssnittet 25/50% (figur 3). Med hjälp av en 10 ml serologisk pipett aspirera ca 12 ml av den anrikade Kupffer cellfraktionen. Överför celler i ett centrifugrör innehållande 35-40 ml Kupffer Cell Isolation Medium. Blanda försiktigt och centrifugera vid 1350 xg under 15 minuter vid 4 ° C för att pelletera cellerna.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 5-10 ml förvärmd Kupffer cellodlingsmediet. Räkna celler (hemocytometer) och mäta lönsamheten med hjälp av trypan blå färgning.
- Plate de renade icke-parenkymala celler i 24-brunnsplattor vid en densitet av 5 x 10 5 celler / brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 (figur 3). Efter 30 minuter, försiktigt bort mediet, tvätta med förvärmda Hanks balanserade saltlösning (HBSS) en gång sedan ersättaden med 500 | il färskt och förvärmda Kupffer cellodlingsmedium (per brunn).
- Lämna Kupfferceller minst 4 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2 före behandling med nanopartiklar, så att de kan få sina anhängare morfologi.
4. Karakterisering
- Kupfferceller Renhet
- Bered färsk PBS / BSA-lösning som används för att upprätthålla Kupffer cellviabilitet. Tvätta cellerna en gång med 500 | il PBS / BSA-lösning. Ta bort PBS / BSA-lösning och lossa Kupfferceller i 500 pl färsk PBS / BSA-lösning med hjälp av försiktig skrapning. När celler ströks ut i 24-brunnsplattor, förkorta de yttre delarna av skrapbladen med sax för att göra lösgör lättare att fortsätta. Överför celler till flödescytometri rör.
- Räkna Kupffer-celler med användning av en hemocytometer och centrifugera en x 10 5 celler vid 1350 x g. Resuspendera Kupffer-celler i 30 | il av F4 / 80-antikroppen (ren). Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur under 30 min. Håll ofärgade celler (som inte inkuberats med antikropp) på is.
- Lägg 2 ml PBS / BSA-lösning i färgade celler, centrifugera vid 1350 g under 5 min och kassera den resulterande supernatanten. Resuspendera färgade celler i 200 | il PBS / BSA.
- För flödescytometrianalys, grind 10.000 ofärgade Kupfferceller beroende på deras storlek (framåtspridning) och kornighet (sidospridning). Analysera fluorescens av gated celler i FL-1-kanal.
- Upprepa proceduren för färgade Kupfferceller hålla samma inställningar som används för flödescytometri analys av ofärgade Kupfferceller. Välj och kvantifiera fluorescens färgade celler för att bedöma renhet Kupffer cell.
- Kupffer Cell fagocyterande förmåga
- Ersätt media med 0,5% (volym / volym) fluorescerande pärlor i Kupffer cellodlingsmedium och inkubera i 4 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- För att avlägsna icke-internaliserade pärlor, centrifugera Kupfferceller vid 1.350 xg, discard supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 | il PBS / BSA-lösning. Upprepa detta steg 2 gånger.
- Skrapa Kupfferceller i 500 pl PBS / BSA-lösning och överföra celler till en flödescytometri rör.
- Centrifugera Kupfferceller vid 1.350 xg, kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 pl PBS / BSA lösning.
- För flödescytometrianalys, grind 10.000 ofärgade Kupfferceller beroende på deras storlek (framåtspridning) och kornighet (sidospridning). Analysera fluorescens av gated celler i FL-2-kanaligt.
5. Inkubering av kemiskt Functionalized kolnanorör (f -CNTs)
- Förbered en dispersion av f -CNTs (1 mg / ml) i vatten genom ultraljudsbehandling under 15 minuter före användning. F -CNTs framställs i egen regi 22.
- Förbered 2x koncentrerad F- cnts dispersion i Kupffer cellodlingsmediet. Sonikera F- cnts dispergerade i mediet för2 minuter innan du fortsätter med steg 5.3).
- För varje brunn, byt 250 pl gamla medier med 250 pl 2x f -CNTs dispersion. Obehandlade brunnar (250 ul konditionerat medium + 250 | il av färsk Kupffer cellodlingsmedium) och brunnar som behandlats med 10% DMSO användes som negativ och positiv kontroll, respektive.
- Inkubera Kupffer-celler vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 eller 72 timmar.
6. toxicitet Bedömning av f -CNTs i Kupfferceller med Modified laktatdehydrogenas (LDH) analys
- Kasta bort supernatanten.
- Lägg 200 | il (per brunn av 24-brunnars platta) lyseringsbuffert och inkubera vid 37 ° C under 30 min-1 h.
- Efter att ha genomfört kraftig pipettering, samla lyserade Kupfferceller i mikrocentrifugrör och centrifugera vid 40.000 xg under 10 min till pellets f -CNTs som togs upp av celler och cellrester.
- Samla supernatanterna (ƒ-CNT gratis) tillmikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C eller gå vidare till steg 6,5).
- Överföring 50 pl i en 96-brunnsplatta och tillsätt en lika stor volym substratblandningen lösning (LDH-kit) till varje brunn. Täck plattan och inkubera vid rumstemperatur under 15 min före tillsats av 50 | il av stopplösning (LDH-kit). Lägg triplikat av tomma brunnar innehållande 50 pl lysbuffert, 50 pl substratblandning lösning och 50 pl stopplösning.
- Läs av absorbansen vid 490 nm i en mikroplattläsare och använd följande formel för att beräkna (%) cellviabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antalet icke-renade parenkymceller var konsekvent och varierade mellan 8 och 14 x 10 6 celler per mus (17 isoleringar utfördes). Varje mus isolering var tillräcklig för att plätera 16-28 brunnar. Cellviabiliteten av trypanblått färgning visade cellviabiliteten ~ 95%. Kupffer-celler visade en rund form inom 30 min av inkubation vid 37 ° C, relaterade till deras ofullständiga vidhäftande morfologi (Figur 4A). Vid 4 h inkubation och därefter, cellerna sprids och cellkluster började bildas.
Kupfferceller sedan kännetecknas för att bekräfta deras renhet och fagocytisk aktivitet. Celler färgades med F4 / 80-antikroppen för att påvisa Kupffer-cell renhet. Flödescytometri analys visade Kupffer-renhet över 95% (Figur 4B). Celler inkuberades med 1 pm fluorescerande pärlor, 12 timmar efter plätering, för att bekräfta deras förmåga att ta upp stora partiklar. Flödescytometrianalys visade that mer än 85% av Kupfferceller är fagocytiska, det vill säga kan ta upp 1 pm pärlor (Figur 4C). Efter 72 timmar av kultur, var 40% av Kupfferceller fagocytiska, vilket tyder på att Kupfferceller delvis förlorat sin fagocytisk aktivitet.
Mikroskopi avbildning av Kupffer-celler inkuberade med f -CNTs för 24 och 72 timmar visade likartad cellmorfologi i jämförelse med naiva celler (Figur 5A). Kupffer-celler inkuberade med 10% DMSO (positiv kontroll) visas nekrotisk morfologi (Figur 5A). Efter analysen av den modifierade LDH-analysen, Kupffer-celler som behandlats med 10% DMSO (positiv kontroll) under 24 och 72 h visade hög toxicitet (figur 5B). I jämförelse, f -CNTs inducerade liten men signifikant minskning av cellviabilitet endast när cellerna exponerades vid 50 | ig / ml för 72 h (figur 5B).
Figur 4: Renhet och upptags förmågor av Kupffer-celler (A) Mikroskopiska bilder av Kupffer-celler utstrukna efter 30 min eller 24 h vid 37 ° C med en atmosfär av 5% CO2.. Skalan bar presenteras 50 pm. (B) Flödescytometrianalys av Kupffer-celler utfördes genom att följa FSC / SSC-cell gating. Kupffer-cell Renheten bestämdes med användning av F4 / 80-antikropp-färgning och visade sig vara över 95%. (C) Kupffer-celler inkuberades under 4 h i närvaro av 1 | j, m fluorescerande pärlor för att bedöma deras fagocytiska aktivitet. De funktionella egenskaperna hos Kupffer bibehölls bättre i celler färskt isolerade (12 h efter plätering) jämfört med celler som testades efter 3 dagar.
Figur 5: Upptag och toxicitet <em> F- cnts i Kupfferceller. (A) Microscopy bilder av Kupfferceller. Bilderna visar Kupffer-celler behandlade med 10% DMSO och 50 ^ g / ml f -CNTs vid 37 ° C under 24 och 72 timmar. Skalan bar presenteras 50 pm. (B) Modifierad LDH-analysen. Låg cellviabilitet sågs i 10% DMSO-behandlade celler (positiva kontroller) medan f -CNTs påverkas signifikant cellviabiliteten endast efter exponering för 50 | ig / ml för 72 timmar. * P <0,05 i förhållande till naiva tillstånd (exklusive 10% DMSO tillstånd) med användning av variansanalys (envägs ANOVA) med post hoc-analys av Tukey-testet. Skalan stapel motsvarar 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Följande steg är avgörande för att nå hög avkastning och hög lönsamhet för Kupfferceller. Aseptiska betingelser bör användas för att begränsa risken för bakterie- och svampkontaminering. Alla instrument måste steriliseras före användning. Reagens bör beredas innan man utför isoleringsförfarandet.
Valet av kollagenas IV, med låg tryptisk aktivitet, är avgörande. Olika partier från samma leverantör har olika enzymatisk aktivitet och de kan behöva jämföras initialt att välja den mest lämpliga satsen för Kupffer cellisolering. Detta kan bedömas genom att bedöma cellutbyte och cellviabilitet. Det rekommenderas också att kontakta leverantören tillhandahåller satser som har använts för liknande applikationer. När beslut om det parti som skall användas, reservera det för framtida bruk.
Den kanyle proceduren kräver utbildning. Planera användning av flera djur för att bli trygg med portalen venkanyleförfarande. Med övning, kommer framgångsrik kanyle lätt uppnås och förfarandet kan hanteras av en person. Notera att användningen av tunga djur ökar diametern på portvenen och därför underlättar förfarandet. När den bakre väggen i portådern är perforerat, är det tekniskt svårt att komma åt venen igen, särskilt om du är ny med detta förfarande och därför är det föredraget att börja med ett nytt djur.
HBSS och Kollagenas lösningar bör ha sitt pH justerat till 7,4 och i förväg värmd till 40 ° C för att uppnå en utgångstemperatur från den peristaltiska pumpen av 37 ° C. Den perfusion med EGTA / HBSS lösning (Ca2 + och Mg2 + gratis) innehållande EGTA behövs för störningar av Ca2 + -beroende adhesionsmolekyler, som heter desmosome, försvagar interaktionen cell-cell. Kollagenas typ IV används för att lösgöra leverceller från den extracellulära matrisen och så leda till levercell dissociation. Perfusionen tid för de två lösningarna bör inte överstiga 15 min för CD 1-möss, men andra stammar, såsom C57BL / 6, kräva något längre leverkoktiden.
För att uppnå en framgångsrik isolering, är det nödvändigt att erhålla högt cellutbyte och viabilitet. Om laboratoriet har ingen erfarenhet av levercellisolering, är det tillrådligt att kombinera hepatocyter pellets från de 3 första centrifuge vid 50 xg och räkna celler genom exklusion med trypanblått. Den hepatocyt Utbytet ska vara> 20 x 10 6 celler och hepatocyte livskraft> 50%. Låga räntor leder i huvudsak från fattiga cell dissociation leder indirekt till lägre Kupffer cellutbyte. Det bör bekräftas att levern är ordentligt smält vid slutet av perfusionen steget. När lämplig hepatocyte avkastning uppnås i kombination med låg hepatocyte livskraft, kan detta bero på en överdriven kollagenasdigestion men mer sannolikt förklaras av en olämplig leverperfusion förfarande eller användning av ett förorenat reagens / material.
Efter plätering, Kupfferceller är känsliga och bör tvättas försiktigt. Minst 4 timmar behövs för Kupfferceller att förvärva deras anhängare morfologi. Behandlingen utförs i allmänhet 4-24 h efter plätering, såsom Kupffer-celler visar sin maximala fagocytisk aktivitet inom 1 dag efter utstrykning.
I våra protokoll beskriver vi dissociationen av CD1 musleverceller följt av rening av Kupffer-celler genom densitetsgradientcentrifugering och urval genom adhesion. Karakteriseringen av Kupffer-celler, genom flödescytometri, visar att man kan uppnå högt utbyte och renhet av Kupffer-celler med användning av denna metod.
Detta Kupffer cellisolering metod utgör en värdefull kompromiss mellan komplexitet och cellutbyte. Emellertid har det rapporterats att vissa Kupffer-cellmetoder kan vara lättare att utföra, såsom det protokoll som beskrivits avWu et al., Där levern uppslutes ex vivo 23. Emellertid metoden beskriven av Wu et al., leder till en begränsad mängd celler och lägre cell renhet. Högre utbyte och renhet kan erhållas men kräver dyra och / eller avancerad utrustning och kan vara tidskrävande.
Den ursprungliga protokoll som utvecklats av et al. Smedsrød 16 använde en jämförbar protokoll baserat på 2-steg perfusion metoden (HBSS + kollagenasspjälkning) följt av centrifugering på Percoll-gradient och val av det lägre Percoll kudde för ytterligare rening genom ytvidhäftning. Genom att modifiera centrifugeringsförfarande och att inhämta de övre Percoll kudde, ökade vi den anrikade Kupffer cellfraktionen från 5,25 x 10 6-8,2 x 10 6 celler per gram lever. Denna förbättring kan hänföras till användningen av EGTA under den tidiga perfusionen steget för att underlätta upplösningen av leverceller. Moreover, användning av flödescytometrianalys tillät tillförlitlig kvantitativ karakterisering av Kupffer-cell renhet och fagocytisk aktivitet. Med en maximal avkastning på 14 x 10 6 renade icke-parenkymceller per muslever. Föreliggande isoleringsförfarande uppnå högre mängd Kupffer celler per muslever vad som rapporterats i litteraturen 24. Denna förbättring kan förklaras av användningen av tyngre mus (35-45 g) jämfört med andra metoder 24. Bredvid denna ökning av cellutbyte, användningen av större djur underlättar anmärkningsvärt förfarandet i portvenen kanyle.
Hög kapacitet in vitro-testning kan utföras med användning av denna primära fagocytisk modell, därför imitera toxikologiska effekter av nanopartiklar in vivo. Den övergripande förståelse för nanotoxikologi kan dra nytta av sådana modeller, vilket gör nanopartiklar val för klinisk översättning mer effektiv. Dessutom är det i linje medgenomföra konceptet 3 R (reduktion, förfining och ersättare) i djur biomedicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
