Introduction
Los tumores sólidos difunden en tres formas principales: la invasión directa, diseminación linfática, y la propagación hematógena. Sin embargo, hay un cuarto medio de propagación del cáncer que con frecuencia se tiene en cuenta, la difusión a lo largo de los nervios. Invasión neural cancerosas (CNI) es una ruta bien conocida de la propagación del cáncer, especialmente en los cánceres de cabeza y cuello, próstata 1 2, 3 y el páncreas. 4-8 CNI se produce en más de 80% de individuos con adenocarcinoma de páncreas, lo que lleva a un tumor retroperitoneal propagarse a través de los nervios ganglio celiaca. Estas células cancerosas neurotrópico tienen una capacidad única para migrar unidireccionalmente a lo largo de los nervios hacia el sistema nervioso central (SNC). 9 Este hallazgo sugiere que el microambiente perineural puede ser explotado por las células cancerosas, proporcionando factores que apoyan el crecimiento maligno.
Uno de los pocos modelos in vitro para la investigación CNI es el ganglio de la raíz dorsal (DRG) / modelo de célula de cáncer. este model se utiliza con frecuencia para estudiar la interacción paracrina entre las células del estroma y el cáncer neural. 10-18 En este líneas celulares de cáncer humano modelo, el ratón o se cultivan en matriz extracelular (ECM) adyacente a preparaciones de DRG cultivadas recién disociados.
Este artículo de vídeo muestra la aplicación de vitro CNI en en el adenocarcinoma ductal pancreático.
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Protocol
De cuatro a seis semanas de edad C57BL / CJ ratones (Harlan, Jerusalén, Israel) se utilizaron en el experimento de acuerdo con la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care especificaciones. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión y el Departamento de Agricultura regulaciones.
1. La recolección de la Médula Espinal
- La eutanasia del ratón usando una cámara de CO 2. Evitar dislocación cervical, ya que podría causar daños a las raíces ganglionares debido a fuerzas de cizallamiento. De aquí en adelante, realizar todos los pasos en condiciones estériles.
- Remojar los animales abajo con etanol al 70%. Este paso es importante para la esterilización y para prevenir el pelo de arrastre a través de los órganos internos.
- Deje el ratón para secar a partir de etanol. Evitar cualquier contacto de etanol con los órganos internos debido a la neurotoxicidad.
- Después de secar el ratón, la posición que el uso de clavos en posición prona(boca abajo). Coloque los pernos en cada extremidad posterior y la extremidad anterior.
- El uso de pinzas, hacer una incisión de línea media que se extiende desde el cuello craneocaudal posterior a la columna vertebral lumbar. A continuación, levante colgajos dérmicos bilateralmente con unas pinzas y exponer el tejido subcutáneo.
- Se palpa el cráneo del ratón hasta llegar a la unión craneocervical. Con unas tijeras perpendiculares al animal, cortar a través de los músculos cervicales y la columna vertebral en la unión craneocervical (el 7º vértebra cervical), el uso de fórceps pesados. Diseccionar la columna vertebral caudal e Impuestos Especiales de la columna vertebral con unas pinzas pesados hasta alcanzar el nivel lumbar (posterior nivel de las extremidades).
- Realizar una transección caudal completa a nivel de la columna lumbar (la 5ª vértebra lumbar) con unas pinzas pesadas.
- Mover el ratón sobre (boca arriba). No hay necesidad de cubrir la incisión desde el DRG se extrae de los niveles vertebrales inferiores y no el cuello uterino.
- Cortar hacia abajo en la línea media del cuello para el abdomen, retraer elpiel lateralmente y luego se corta para abrir el peritoneo.
- Retire los órganos internos dentro del peritoneo (hígado, bazo, páncreas, estómago, intestino) y en bloque. A continuación, retire los órganos retroperitoneales (es decir, los riñones y el páncreas). Craneal, abrir la pared torácica.
- El uso de pinzas y una cuchilla quirúrgica, corte de las costillas, dejando 5 mm de costillas bilateralmente lejos de la columna vertebral. En este punto, la columna vertebral está separado del resto del cuerpo.
- Lavar la columna vertebral de la sangre con (4 ° C) fresco salina tamponada con fosfato fría (PBS) dos veces.
2. Aislamiento de la raíz dorsal ganglios (DRG)
- Utilice un estereomicroscopio con un aumento de 4X.
- Coloque la columna vertebral en una plataforma no absorbente no adherente (Telfa / nylon). Coloque la cara columna hacia arriba en la misma orientación cráneo-caudal.
- Retire cualquier músculos espinales y tejido conectivo. Utilice las costillas como un punto de referencia para los nervios, ya quesalir de la columna vertebral. Costillas también protegen los nervios de los instrumentos quirúrgicos. El DRG se encuentran en la torácica, lumbar, cervical y los sitios de las vértebras.
- A continuación, utilizando las tijeras cortan el cuerpo vertebral en la línea media y exponen a la médula espinal y las raíces DRG por la retracción lateral suave del cuerpo vertebral.
- En el espacio intercostal, siga el nervio periférico medial a lo largo del lateral de la costilla a la DRG.
- Identificar los GRD. Parece que la yema de 'huevo frito' tumbado sobre el nervio.
- Cortar el distal del nervio intercostal a la DRG dejando 2-3 mm de nervio distal a los ganglios, para ser utilizado para la retracción. Esta "cola" se eliminará después de la cosecha.
- Agarre el nervio uso de fórceps. Pellizcar el cuerpo DRG sí causará daño celular neuronal y debe ser evitado.
- El enfoque de la DRG proximal a lo largo de su apego a la médula espinal, a través de su anterior y raíces posteriores.
- Aplicar la retracción suave para la DRG tirando de la EFrentes nervio (muñón nervio intercostal) lateralmente, y se corta la parte anterior y posterior raíces cerca de la DRG.
- Mantenga el DRG en una placa de 35 mm de Petri llena de fresco, hielo DMEM frío suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina, aminoácidos no esenciales al 1%, y 1% de piruvato de sodio.
3. Implantación en la placa de Petri
- Realice los siguientes pasos en el hielo utilizando puntas de pipeta pre-enfriado para evitar la solidificación del ECM.
- Bajo un microscopio estereoscópico con una ampliación 2-4X, colocar una placa de Petri de vidrio inferior 35 mm en una cuadrícula de papel.
IMPORTANTE: El trabajo sobre hielo con el fin de mantener el ECM en estado líquido. Crear un punto de diámetro de 1 mm (aproximadamente 20 l) de crecimiento factor de ECM-agotado en el centro de la rejilla. - Bajo visualización directa, coloque el DRG en el centro de la mancha ECM cerca de la parte inferior del plato.
NOTA: Las células cancerosas se utilizan en este protocolo son murinos células del cáncer pancreático (KPC) established a partir de muestras tumorales recién aisladas de ratones KPC como se describe en otro lugar 19. - células de cáncer de cosecha 40.000 a partir de cultivos confluentes, se lavan una vez con PBS, y volver a suspender en 40 l ECM en hielo.
- Bajo visualización directa de la rejilla utilizando un microscopio estereoscópico micras medida 500 en cada dirección desde el DRG. En este punto sembrar lentamente 10.000 células / l 10 ECM. Utilice una punta de preenfriado 2-10 l para inyectar las células cercanas al fondo del plato, evitando su propagación en la matriz o desprendimiento de la matriz. (Figura 1).
- Deja el plato dentro de una campana de flujo laminar durante 10-15 minutos para solidificar. Evitar el secado de ECM.
- Añadir lentamente DMEM, preparado como se ha mencionado previamente, contra la pared lateral de la placa. Añadir suficiente medio para cubrir la ECM (alrededor de 2 ml).
- Poner el plato de nuevo a la incubadora a 37 ° C.
- Sustituir el medio con medio fresco al día siguiente.
- Reemplazar el medio cada 2 días. </ Li>
4. Adquisición de Datos, por lapsos de tiempo videomicroscopia
- En el día 7 después de la implantación, tomar el plato para microscopía lapso de tiempo. Tenga en cuenta que ciertas células pueden requerir la adquisición antes debido a una migración más rápida.
- Durante la formación de imágenes en vivo, poner la caja en un entorno cerrado a una temperatura media de 37 ± 0,1 ° C y 5% de CO2.
- Registrar las células mediante el uso de una carga acoplada cámara del dispositivo colocado en el microscopio.
- Tomar imágenes digitalizadas cada 10 minutos durante un máximo de 72 horas para seguir la locomoción celular de tres a seis células diferentes.
- Reemplazar medio después de 24 horas.
- Realizar la adquisición de datos y análisis sencilla utilizando el software microscopio.
Análisis 5. Datos
- Para aplicaciones más avanzadas (es decir, el seguimiento de celda en 2D o 3D) utilizar un software especializado (como Imaris 4D). Nota: Este software determina las coordenadas xy de una célula acualquier momento dado, junto con la distancia desde el origen, y la velocidad de movimiento.
- Calcula la velocidad media mediante la medición de la distancia de desplazamiento entre las posiciones posteriores en intervalos de 10 min. Calcular el índice de migración de Forward (FMI) que es la distancia de la parte frontal de la célula de neuritas y describe el movimiento unidireccional de las células hacia el DRG.
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Representative Results
Utilizando imágenes de microscopía de vídeo, el DRG se puede ver brotar neuritas 5-7 días después de la implantación, mientras que las células de cáncer de migración lejos de sus colonias hacia el DRG. Por el 7º día después de la implantación, las células cancerosas entran en contacto con las neuritas (Figura 2).
El índice de migración hacia delante de las células de cáncer pancreático utilizados en el protocolo es 3-4 veces mayor que la de otras líneas celulares (QLL2, B16F) (Figura 3a). Figura 3B presenta un representante X y la coordenada Y gráfica, que representa la trayectoria de migración de una célula de cáncer KPC en contacto con el nervio; videomicroscopy análisis de lapso de tiempo mostró diferencias en el movimiento hacia adelante, pero no la velocidad entre las células y las células KPC no invasora (Figura 3c-d).
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Figura 1:. Ilustración esquemática de los pasos del protocolo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Cancer Cell Invasion A lo largo de las neuronas del DRG (a) DRG (arriba) y las células de cáncer (abajo) en el día 0 después de la siembra (ampliación 5X). (B) DRG y el cáncer de células en el día 7 después de la siembra (5 aumentos). Células (c) cancerosas migran a lo largo de la neurona DRG (flechas). Todas las barras representan 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Ganglio de raíz dorsal (GRD) neuronas inducen CNI (a) índice de nervio invasión de las células cancerosas, las células MiaPaca2 KPC, QLL2 y células NIH3T3. (B) Una coordenada gráfico que representa la ruta de migración de una célula de cáncer KPC en contacto con el nervio (rojo) y de células QLL2 (púrpura). Se muestran las coordenadas X e Y. (N = 12 a 20 en cada grupo). (C) Análisis de la distancia desde el origen de la migración de células de cáncer de QLL2 con el contacto axonal y células (d) de cáncer KPC (n = 20). La dirección de la migración era constantemente hacia el ganglio del nervio. Los valores de p en (a) se calcularon mediante la prueba de la t de Student de dos caras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo se presenta un modelo in vitro que recapitula el microambiente canceroso en el nicho de los nervios, el modelo DRG. El vídeo muestra todos los pasos a partir de reconocer puntos de referencia anatómicos tales como el DRG en el ratón, su extracción y, finalmente, su cultivo en ECM. También se presenta Co-cultivo de la DRG junto con células cancerosas. No existen otros modelos para la investigación invasión perineural in vitro descritos en la literatura que hacen de este modelo esencial para estudiar el nicho perineural microentorno in vitro.
El protocolo presentado en el vídeo tiene dos pasos críticos. En primer lugar, se debe tener cuidado al sujetar el nervio adyacente al cuerpo DRG (paso 2.7 en el protocolo). Agarrar o pellizcar el DRG podría causar daños mecánicos o isquémica irreversible en el DRG prevenir que vuelva a crecer y brotar cuando se siembran en la placa de Petri. El segundo paso crítico es la implantaciónde las células cancerosas en la placa de Petri en el interior del ECM. Es importante sembrar las células lentamente y con precaución, para evitar la flotación de las células y su propagación a través de la placa de Petri. El objetivo de la implantación es localizar las células en un solo lugar, para facilitar el seguimiento de su movimiento (distancia y dirección).
Una vez establecido el modelo microambiente puede ser modificado de acuerdo con la hipótesis de la prueba. Por ejemplo, la adición de un tercer cultivo de células de la placa de Petri (por ejemplo, células no cancerosas) permite al investigador para comparar las capacidades de migración neurotrópico de diferentes células. Además, el investigador puede aplicar diferentes condiciones (es decir, temperatura, humedad, factores solubles, etc.) y examinar su efecto en la capacidad de las células invasión.
El modelo de DRG permite al investigador para estudiar la interacción entre las células cancerosas y los nervios. También se utiliza para los experimentos de lapso de tiempo en el que morfológicalos cambios en el nicho perineural se demuestran de manera temporal. Además, las células neuroinvasiva pueden ser sometidos a diversos tratamientos y su efecto en la interacción con las neuritas de los ganglios se pueden evaluar.
No todas las línea celular es adecuada para el modelo de DRG. Deben ser células cancerosas con la capacidad intrínseca para invadir a través de los nervios y de degradar ECM. Además, tenga en cuenta que cada tipo de célula cancerosa tiene diferentes características de invasión por lo que el tiempo estimado de las células para hacer contacto con las neuritas DRG varía. Por ejemplo, las células KPC que utilizan necesidad cerca de 7 días para invadir a través de la ECM hacia el DRG mientras que las células MiaPaca (células de adenocarcinoma de páncreas humano) sólo necesita 72-96 horas para hacer que el contacto.
Una limitación de este modelo incluye la posible incompatibilidad con las células humanas. Debido a su uso de DRG ratón, la interacción proteína-proteína de ratón-humano no siempre puede ser demostrada cuando huse utilizan células de cáncer de hombre. Siempre que piense utilizar este modelo con las dos especies diferentes, la homología de la proteína examinada debe ser probado y si hay una alta homología del ensayo se supone que es adecuado para la evaluación de las interacciones proteína-proteína. Además, debe tenerse en cuenta que el ensayo DRG como se propone en este protocolo representa el microambiente neuronal incluyendo otras células, no sólo las neuronas (es decir, células de Schwann, fibroblastos, macrófagos, etc.). Por lo tanto, las poblaciones de células específicas no pueden ser probados específicamente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
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