Introduction
Solida tumörer sprida på tre huvudsakliga sätt: direkt invasion, lymfatiska spridning och hematogenic spridning. Det finns dock ett fjärde medel för cancer sprids som ofta ignoreras, spridning längs nerver. Cancer neurala invasion (CNI) är en välkänd rutt cancer sprids, särskilt i cancer i huvud och hals, en prostata 2, 3 och bukspottkörtel. 4-8 CNI förekommer hos fler än 80% av personer med pancreatic adenocarcinom, ledande till retroperitoneal tumör sprids via celiaki ganglion nerver. Dessa neurotrop cancerceller har en unik förmåga att migrera i en riktning längs nerver mot det centrala nervsystemet (CNS). 9 Detta fynd tyder på att perineural mikro kan utnyttjas av cancerceller, vilket ger faktorer som stödjer malign tillväxt.
En av de få in vitro-modeller för CNI forskning är dorsalrotsganglier (DRG) / cancer cellmodell. denna model används ofta för att studera parakrina samspelet mellan neurala stroma och cancerceller. 10-18 I denna modell, mus eller humana cancercellinjer odlas i extracellulära matrix (ECM) i anslutning till beredningar av nyligen dissocierade odlade DRG.
Denna video artikeln visar tillämpningen av in vitro CNI i pankreas duktal adenokarcinom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fyra till sex veckor gamla C57BL / CJ möss (Harlan, Jerusalem, Israel) användes i experimentet enligt Föreningen för bedömning och ackreditering av försöksdjurs Care specifikationer. Alla experimentella procedurer gjordes i enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén och Department of Agriculture förordningar.
1. Skörd av ryggmärgs
- Euthanize musen med hjälp av en CO 2 kammare. Undvik halsdislokation eftersom det kan orsaka skador på ganglion rötter på grund av skjuvkrafter. Från och med nu, utföra alla steg under sterila förhållanden.
- Blöt djuret med 70% etanol. Detta steg är viktigt för sterilisering och för att förhindra håret från att dra genom de inre organen.
- Låt musen för att torka ur etanol. Förhindra kontakt av etanol med inre organ på grund av neurotoxicitet.
- Efter torkning musen, placera den med stiften i framstupa läge(ansiktet nedåt). Placera stiften på varje bakbenen och forelimb.
- Använd pincett, gör en mittlinje snitt sträcker craniocaudally från den bakre halsen till ländryggen. Därefter höjer dermala klaffar bilateralt med hjälp av pincett och exponera subkutan vävnad.
- Palpera mus skallen tills de når kraniocervikal korsningen. Med sax vinkelrätt mot djuret, skär genom cervical muskler och ryggrad vid kraniocervikal korsningen (7: e halskotor), med hjälp av tunga pincett. Dissekera ryggraden kaudalt och skära ryggraden med tunga pincett tills de når ländryggen nivå (bakbenen nivå).
- Utför en fullständig svanstransektion i ländryggen nivå (5: e ländkotan) med hjälp av tunga pincett.
- Rulla musen över (uppåt). Det finns ingen anledning att täcka snittet eftersom DRG utvinns ur lägre vertebrala nivåer och inte livmoderhalscancer.
- Skär ner på mittlinjen från halsen till magen, dra tillbakahud i sidled och sedan klippa att öppna bukhinnan.
- Ta bort de inre organ inne i bukhinnan (lever, mjälte, pankreas, mage och tarm) i klump. Ta sedan bort de retroperitoneala organ (dvs. njurar och bukspottkörtel). Cranially öppna bröstkorgen.
- Med hjälp av pincett och en kirurgisk kniv, skär revbenen, lämnar 5 mm revben bilateralt bort från ryggraden. Vid denna punkt, är kotpelaren är skild från resten av kroppen.
- Tvätta kotpelaren från blod med kall (4 ° C) färskt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger.
2. Isolera dorsalrotsganglier (DRG)
- Använd en stereo med 4X förstoring.
- Positionera ryggraden på en icke-vidhäftande icke absorberande plattformen (Telfa / nylon). Placera ryggsidan upp på samma kranio-caudal orientering.
- Ta bort alla spinal muskler och bindväv. Använd revbenen som ett landmärke för nerver som delämnar ryggraden. Revben skyddar också nerverna från kirurgiska verktyg. DRG ligger på hals-, bröst- och ländryggen platser i kotorna.
- Därefter använder sax klippa kotkroppen i mittlinjen och exponera ryggmärgen och DRG rötter genom försiktig lateral indragning av kotkroppen.
- I interkostalrummet, följ perifera nerver medialt längs ribbsido till DRG.
- Identifiera DRG. Det ser ut som äggulan av "stekt ägg" ligger på nerven.
- Skär interkostala nerven distalt till DRG lämnar 2-3 mm av nerven distalt till ganglia, som skall användas för återdragning. Denna "svans" kommer att tas bort efter skörden.
- Ta tag i nerven med pincett. Klämma DRG kroppen själv kommer att orsaka nervcellskador och bör undvikas.
- Närma sig DRG proximalt längs dess fastsättning på ryggmärgen, via dess främre och bakre rötter.
- Applicera mild indragning till DRG genom att dra eflunda nerv (interkostal nervstumpen) i sidled, och skär den främre och bakre rötter nära DRG.
- Hålla DRG i en 35 mm petriskål fylld med färsk, iskall DMEM kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% Natrium pyruvat.
3. Implantation i petriskålen
- Utför nästa steg på is med hjälp av nedkylda pipettspetsar för att förhindra ECM stelning.
- Under en stereomikroskop på 2-4X förstoring, placera en 35 mm glas botten petriskål på ett papper rutnät.
VIKTIGT: Arbetet med is för att hålla ECM i flytande tillstånd. Skapa en 1 mm diameter spot (approximativt 20 | j, l) av tillväxtfaktor utarmade ECM vid centrum av gallret. - Under direkt visualisering, placera DRG i mitten av ECM plats nära till botten av skålen.
Obs! Cancerceller som används i detta protokoll är murina pankreascancerceller (KPC) established från nyisolerade tumörprover från KPC-möss såsom beskrivits på annat ställe 19. - Harvest 40.000 cancerceller från konfluenta kulturer, tvätta dem en gång med PBS och resuspendera dem i 40 pl ECM på is.
- Under direkt visualisering av gallret med hjälp av ett stereomikroskop åtgärd 500 | j, m vid varje riktning från DRG. Vid denna tidpunkt långsamt frö 10.000 celler / 10 pl ECM. Använda en 2-10 | il förkyld spets att injicera cellerna nära till skålen botten, undvika att de sprids i matrisen eller lösgör av matrisen. (Figur 1).
- Lämna skålen i en huv med laminärt flöde under 10-15 min för att stelna. Undvika ECM torkning.
- Tillsätt långsamt DMEM, framställd såsom tidigare nämnts, mot sidoväggen av plattan. Tillsätt tillräckligt medium för att täcka ECM (cirka 2 ml).
- Sätta skålen tillbaka till inkubator vid 37 ° C.
- Byt medium med färskt medium på följande dag.
- Byt medium var 2 dagar. </ Li>
4. Data Acquisition, Time-lapse Videomicroscopy
- På dag 7 efter implantationen, ta skålen för tidsförlopp mikroskopi. Observera att vissa celler kan kräva förvärv tidigare på grund av snabbare migrering.
- Under levande avbildning, placera skålen i en sluten miljö vid en medeltemperatur av 37 ± 0,1 ° C och 5% CO2.
- Spela in cellerna genom användning av en laddningskopplad anordning kamera placerad på mikroskopet.
- Ta digitaliserade bilder varje 10 min i upp till 72 timmar för att följa cell förflyttning från tre till sex olika celler.
- Byt medium efter 24 timmar.
- Utför datainsamling och enkel analys med hjälp av mikroskop programvara.
5. Dataanalys
- För mer avancerade applikationer (dvs spårning cell i 2D eller 3D) använder specialiserad programvara (såsom Imaris 4D). Obs: Denna programvara bestämmer xy koordinaterna för en cell vidvarje given tidpunkt, tillsammans med avståndet från ursprunget, och rörelsehastighet.
- Beräkna medelhastighet genom att mäta reseavståndet mellan på varandra följande positioner i 10 minuters intervall. Beräkna Forward Migration index (FMI) som är avståndet mellan cell front från neurite och beskriver den enkelriktade rörelsen av cellerna mot DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av video mikroskopi avbildning kan DRG ses groning neuriter 5-7 dagar efter implantering medan cancerceller migrerar bort från sina kolonier mot DRG. Av 7: e dagen efter implantationen, cancercellerna kommer i kontakt med de neurites (Figur 2).
Framåt migration index av pankreascancerceller som används i protokollet är 3-4 gånger högre än för andra cellinjer (QLL2, B16F) (figur 3a). Figur 3b visar en representativ X- och Y-graf som visar migreringsväg av en KPC cancercell i kontakt med nerven; Time-lapse videomicroscopy analys visade skillnader i den framåtgående rörelsen men inte hastigheten mellan KPC-celler och icke-invaderande celler (Figur 3c-d).
gur 1 "src =" / filer / ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
Figur 1:. Schematisk illustration av protokollsteg Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Cancer Cell Invasion Längs nervceller DRG (a) DRG (överst) och cancerceller (nederst) på dag 0 efter ympning (5 gångers förstoring). (B) DRG och cancer celler på dag 7 efter sådd (5 gångers förstoring). (C) Cancerceller migrerar längs DRG neuron (pilar). Alla staplar representerar 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Dorsal rotganglion (DRG) Neuroner Inducera CNI (a) Nerve invasion index av MiaPaCa2 cancerceller, KPC-celler, QLL2 och NIH3T3-celler. (B) En koordinat graf som avbildar migreringsbanan för en KPC cancercell i kontakt med nerven (röd) och QLL2 cell (lila). Y och X-koordinaterna visas. (N = 12-20 i varje grupp). (C) Analys av avstånd från ursprungs att migrera QLL2 cancerceller med axonal kontakt och (d) KPC cancerceller (n = 20). Riktningen för migration var ständigt mot nervganglion. P-värden i (a) beräknades genom tvåsidiga Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel presenteras en in vitro-modell som rekapitulerar cancermikro i neurala nisch, DRG modellen. Videon visar alla steg med början från att erkänna anatomiska landmärken såsom DRG i mus, dess utvinning, och slutligen, dess odling i ECM. Samodling DRG tillsammans med cancerceller presenteras också. Det finns inga andra modeller för in vitro perineural invasion forskning som beskrivs i litteraturen gör denna modell nödvändig för att studera perineural nisch mikro in vitro.
Protokollet presenteras i videon har två viktiga steg. Först bör man vara försiktig när gripa nerven intill DRG kropp (steg 2,7 i protokollet). Gripa eller nypa DRG kan orsaka irreversibel mekanisk eller ischemisk skada på DRG hindra det från att växa och gro när ympades i petriskålen. Den andra kritiska steget är implantationav cancercellerna i petriskålen inuti ECM. Det är viktigt att ympa cellerna långsamt och med försiktighet, för att undvika flytande av celler och att de sprids över hela petriskål. Syftet med implantation är att lokalisera cellerna på ett ställe, för att underlätta spårning deras rörelse (avstånd och riktning).
När etablerade modellen mikro kan modifieras i enlighet med den testade hypotesen. Till exempel lägga till en tredje cellodling till petriskålen (exempelvis icke-cancerösa celler) gör det möjligt för forskare att jämföra de neurotrop migration hos olika celler. Dessutom kan forskaren tillämpa olika villkor (dvs. temperatur, luftfuktighet, lösliga faktorer, etc.) och undersöka deras effekt på celler invasion förmåga.
DRG modellen gör det möjligt för forskare att studera interaktionen mellan cancerceller och nerver. Det används också för tidsförlopp experiment, i vilka morfologiskaförändringar i perineural nisch demonstreras i en temporal mode. Dessutom kan neuroinvasive cellerna utsättas för olika behandlingar och deras effekt på interaktionen med neurites av ganglierna kan bedömas.
Inte varje cellinje är lämplig för DRG-modellen. De bör vara cancerceller med den inneboende förmågan att invadera genom nerv och försämra ECM. Vidare noterar att varje cancercell har olika invasionsegenskaper och så tiden cellerna förväntas komma i kontakt med de DRG neurites varierar. Till exempel, KPC celler använde vi behöver ca 7 dagar att invadera genom ECM mot DRG medan MIAPaCa celler (humana pankreas adenokarcinomceller) behöver bara 72-96 timmar för att göra den kontakten.
En begränsning av denna modell inkluderar en eventuell oförenlighet med mänskliga celler. På grund av dess användning av musen DRG, mus-humant protein-proteininteraktioner kan inte alltid påvisas när human cancerceller används. När planerar att använda denna modell med två olika arter, bör homologin av den undersökta proteinet testas och om det är hög homologi analysen är tänkt att vara lämplig för att utvärdera protein-proteininteraktioner. Som väl, bör det hållas i minnet att DRG-analysen som föreslås i detta protokoll representerar neurala mikro inklusive andra celler, inte bara neuroner (dvs Schwann celler, fibroblaster, makrofager, etc.). Därför kan specifika cellpopulationer inte testas specifikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
