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Neuroscience

पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि आदर्श: कैंसर तंत्रिका आक्रमण की इन विट्रो मॉडलिंग में

Published: April 12, 2016 doi: 10.3791/52990

Introduction

प्रत्यक्ष आक्रमण, लसीका प्रसार, और hematogenic प्रसार: ठोस ट्यूमर तीन मुख्य तरीके में प्रसार। हालांकि, वहाँ है कि अक्सर नसों के साथ अवहेलना है, प्रचार-प्रसार के कैंसर के प्रसार के चौथे साधन है। कैंसर तंत्रिका आक्रमण (सीएनआई) विशेष रूप से सिर और गर्दन, 1 प्रोस्टेट 2, 3 और अग्न्याशय के कैंसर में, कैंसर के प्रसार का एक प्रसिद्ध मार्ग है। सीएनआई 4-8 अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता के साथ व्यक्तियों के 80% से अधिक में होता प्रमुख सीलिएक नाड़ीग्रन्थि नसों के माध्यम से फैल retroperitoneal ट्यूमर है। ये neurotropic कैंसर की कोशिकाओं को एक अनूठा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की ओर नसों के साथ unidirectionally विस्थापित करने की क्षमता है। 9 यह निष्कर्ष बताते हैं कि perineural microenvironment, कैंसर कोशिकाओं द्वारा शोषण किया जा सकता है कि कारकों घातक विकास का समर्थन प्रदान करते हैं।

सीएनआई रिसर्च के लिए कुछ इन विट्रो मॉडलों में से एक पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) / कैंसर कोशिका मॉडल है। यह आधुनिकएल अक्सर इस मॉडल, माउस या मानव कैंसर कोशिका लाइनों में। तंत्रिका स्ट्रोमा और कैंसर कोशिकाओं के बीच 10-18 पैराक्राइन बातचीत का अध्ययन बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) हौसले से अलग सुसंस्कृत डीआरजी की तैयारियों के निकट में बड़े हो रहे हैं के लिए प्रयोग किया जाता है।

इस वीडियो लेख अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता में इन विट्रो सीएनआई के आवेदन से पता चलता है।

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Protocol

छह सप्ताह पुराने महिला C57BL / मुख्य न्यायाधीश चूहों को चार (Harlan, यरूशलेम, इजराइल) प्रयोग में आकलन और प्रयोगशाला पशु की देखभाल विनिर्देशों के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन के अनुसार इस्तेमाल किया गया। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति और कृषि नियमों विभाग के अनुसार किया गया था।

1. कटाई स्पाइनल कॉर्ड

  1. माउस सीओ 2 कक्ष का उपयोग euthanize। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से बचने के रूप में यह कतरनी बलों के कारण नाड़ीग्रन्थि जड़ों को नुकसान हो सकता है। यहाँ से, बाँझ शर्तों के तहत सभी चरणों को पूरा।
  2. 70% इथेनॉल के साथ नीचे सोख जानवर। यह कदम नसबंदी के लिए और आंतरिक अंगों के माध्यम से खींचकर से बालों को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. माउस इथेनॉल से सूखने के लिए छोड़ दें। न्यूरोटॉक्सिटी के कारण आंतरिक अंगों के साथ इथेनॉल के किसी भी संपर्क को रोकने के।
  4. माउस सूखने के बाद, प्रवण स्थिति में पिन का उपयोग कर यह स्थिति(चेहरा झुकना)। प्रत्येक hindlimb और forelimb पर पिन रखें।
  5. संदंश का प्रयोग, एक midline चीरा काठ का रीढ़ की हड्डी के पीछे गर्दन से craniocaudally का विस्तार कर सकते हैं। अगले, त्वचीय फ्लैप द्विपक्षीय संदंश का उपयोग बढ़ाने के लिए और चमड़े के नीचे ऊतक बेनकाब।
  6. craniocervical जंक्शन तक पहुँचने तक माउस खोपड़ी टटोलना। पशु, craniocervical जंक्शन (7 वें ग्रीवा कशेरुक) में गर्भाशय ग्रीवा की मांसपेशियों और रीढ़ की हड्डी के माध्यम से कटौती करने के लिए सीधा कैंची का प्रयोग, भारी संदंश का उपयोग। रीढ़ की हड्डी दुमदारी काटना और काठ का स्तर (हिंद अंग स्तर) तक पहुँचने तक भारी संदंश के साथ रीढ़ आबकारी।
  7. काठ का रीढ़ स्तर (5 वें काठ कशेरुकाओं) भारी संदंश का उपयोग करने पर एक पूरा दुम transection प्रदर्शन करना।
  8. माउस पर रोल (सामना)। के बाद से डीआरजी और न कम कशेरुकी स्तरों से निकाला जाता है गर्भाशय ग्रीवा चीरा कवर करने के लिए कोई जरूरत नहीं है।
  9. पेट के लिए गर्दन से midline पर नीचे कट, वापस लेनात्वचा laterally और फिर पेरिटोनियम खोलने के लिए काट दिया।
  10. गुट एन पेरिटोनियम अंदर आंतरिक अंगों (जिगर, तिल्ली, अग्न्याशय, पेट, आंत और) निकालें। अगले, retroperitoneal अंगों (यानी, गुर्दे और अग्न्याशय) को हटा दें। Cranially, छाती दीवार खुला।
  11. संदंश और एक सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग, पसलियों में कटौती, पसलियों 5 मिमी छोड़ने द्विपक्षीय कशेरुका स्तंभ से दूर। इस बिंदु पर, कशेरुका स्तंभ शरीर के बाकी हिस्सों से अलग है।
  12. ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) ताजा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में दो बार के साथ खून से कशेरुका स्तंभ धो लें।

2. अलग पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी)

  1. 4X बढ़ाई साथ एक stereomicroscope का प्रयोग करें।
  2. एक गैर पक्षपाती गैर अवशोषित मंच (Telfa / नायलॉन) पर रीढ़ की स्थिति। एक ही cranio दुम अभिविन्यास में रीढ़ की हड्डी के चेहरे ऊपर की स्थिति।
  3. किसी भी रीढ़ की मांसपेशियों और संयोजी ऊतक निकालें। वे के रूप में नसों के लिए एक मील का पत्थर के रूप में पसलियों का प्रयोग करेंरीढ़ की हड्डी को छोड़ दें। पसलियां भी सर्जिकल उपकरण से नसों की रक्षा करना। डीआरजी ग्रीवा, वक्ष और काठ कशेरुकाओं के स्थलों पर स्थित हैं।
  4. अगले, कैंची का उपयोग midline में कशेरुकी शरीर में कटौती और कशेरुका शरीर के कोमल पार्श्व त्याग से रीढ़ की हड्डी और डीआरजी जड़ों को बेनकाब।
  5. पसलियों के बीच अंतरिक्ष में, डीआरजी को पसली पार्श्व साथ मध्यवर्ती परिधीय तंत्रिका का पालन करें।
  6. डीआरजी को पहचानें। यह तला हुआ अंडा 'तंत्रिका पर झूठ बोलने की जर्दी की तरह लग रहा है।
  7. डीआरजी गैन्ग्लिया के लिए तंत्रिका बाहर के 2-3 मिमी छोड़ने के लिए पसलियों के बीच तंत्रिका बाहर कट, त्याग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यह "पूंछ" कटाई के बाद हटा दिया जाएगा।
  8. संदंश का उपयोग तंत्रिका समझ। डीआरजी शरीर में ही बन्द रखो तंत्रिका कोशिका क्षति होगी और बचा जाना चाहिए।
  9. डीआरजी दृष्टिकोण proximally रीढ़ की हड्डी को अपने लगाव के साथ, अपने पूर्वकाल और कूल्हों जड़ों के माध्यम से।
  10. एफई खींच कर डीआरजी कोमल त्याग लागू करेंअलग तंत्रिका (पसलियों के बीच तंत्रिका स्टंप) laterally, और पूर्वकाल और कूल्हों जड़ों डीआरजी के करीब काटा।
  11. 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक ताजा, बर्फ के ठंडे DMEM, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, और 1% सोडियम पाइरूवेट से भरा एक 35 मिमी पेट्री डिश में डीआरजी रखें।

3. पेट्री डिश में आरोपण

  1. ईसीएम solidification को रोकने के लिए पूर्व ठंडा पिपेट सुझावों का उपयोग कर बर्फ पर अगले चरणों का प्रदर्शन।
  2. 2-4x बढ़ाई पर एक stereomicroscope के तहत, एक कागज ग्रिड पर एक 35 मिमी गिलास नीचे पेट्री डिश जगह है।
    महत्वपूर्ण: तरल अवस्था में ईसीएम रखने के लिए बर्फ पर काम करते हैं। ग्रिड के केंद्र में एक 1 मिमी व्यास स्थान (लगभग 20 μl) वृद्धि कारक समाप्त ईसीएम की बनाएँ।
  3. प्रत्यक्ष दृश्य के तहत, पकवान की तह तक करीब ईसीएम स्थान के केंद्र में डीआरजी जगह है।
    नोट: कैंसर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कोशिकाओं रहे हैं murine अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं (केपीसी) स्थापितके रूप में कहीं 19 में वर्णित केपीसी चूहों से हौसले से पृथक ट्यूमर नमूनों से hed।
  4. मिला हुआ संस्कृतियों से फसल 40,000 कैंसर की कोशिकाओं, उन्हें पीबीएस के साथ एक बार धोने, और उन्हें बर्फ पर 40 μl ईसीएम में resuspend।
  5. ग्रिड डीआरजी से प्रत्येक दिशा में एक stereomicroscope उपाय के 500 माइक्रोन का उपयोग कर के प्रत्यक्ष दृश्य के तहत। इस बिंदु पर धीरे-धीरे 10,000 कोशिकाओं / 10 μl ईसीएम बीज। , पकवान नीचे के करीब कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए मैट्रिक्स या मैट्रिक्स की टुकड़ी में उनके प्रसार से बचने के लिए एक 2-10 μl precooled टिप का उपयोग करें। (चित्रा 1)।
  6. 10-15 मिनट जमना के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड के भीतर पकवान छोड़ दें। ईसीएम सूखने से बचें।
  7. धीरे-धीरे थाली की ओर दीवार के खिलाफ, DMEM जोड़ने तैयार जैसा कि पहले उल्लेख। ईसीएम (लगभग 2 मिलीलीटर) को कवर करने के लिए पर्याप्त मध्यम जोड़ें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस इनक्यूबेटर पकवान रखो।
  9. अगले दिन पर ताजा माध्यम के साथ मध्यम बदलें।
  10. मध्यम हर 2 दिन बदलें। </ Li>

4. डाटा अधिग्रहण, समय चूक videomicroscopy

  1. आरोपण के बाद 7 दिन, समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए पकवान ले। ध्यान दें कि कुछ कोशिकाओं में तेजी प्रवास के कारण पहले अधिग्रहण की आवश्यकता हो सकती है।
  2. लाइव इमेजिंग के दौरान 37 ± 0.1 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 का एक मतलब के तापमान पर एक बंद वातावरण में पकवान जगह है।
  3. एक आरोप युग्मित डिवाइस कैमरा माइक्रोस्कोप पर रखा उपयोग करके कोशिकाओं रिकॉर्ड।
  4. ऊपर 72 घंटा के लिए तीन से छह विभिन्न कोशिकाओं से सेल हरकत का पालन करने के लिए डिजीटल छवियों हर 10 मिनट ले लो।
  5. 24 घंटे के बाद मध्यम बदलें।
  6. डाटा अधिग्रहण और सरल विश्लेषण माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन करना।

5. डेटा विश्लेषण

  1. और अधिक उन्नत अनुप्रयोगों (यानी, 2 डी या 3 डी में सेल ट्रैकिंग) (जैसे Imaris 4D के रूप में) विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। नोट: यह सॉफ्टवेयर पर एक सेल का XY निर्देशांक निर्धारित करता हैकिसी भी समय दिया, मूल से दूरी, और गति की गति के साथ।
  2. 10 मिनट के अंतराल में बाद में स्थितियों के बीच यात्रा की दूरी को मापने के द्वारा मतलब वेग की गणना। फॉरवर्ड प्रवासन सूचकांक (एफएमआई) जो neurite से सेल सामने की दूरी पर है और डीआरजी की ओर कोशिकाओं की दिशाहीन आंदोलन का वर्णन गणना।

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Representative Results

वीडियो माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग करना, डीआरजी आरोपण के बाद neurites अंकुरण 5-7 दिनों जबकि कैंसर की कोशिकाओं को डीआरजी की ओर अपने उपनिवेशों से दूर पलायन देखा जा सकता है। आरोपण के बाद 7 वें दिन तक, कैंसर की कोशिकाओं को neurites (चित्रा 2) के साथ संपर्क में आते हैं।

प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अग्नाशय कैंसर की कोशिकाओं के आगे पलायन सूचकांक 3-4 अन्य सेल लाइनों (QLL2, B16F) (चित्रा 3 ए) की तुलना में गुना अधिक है। चित्रा 3B एक प्रतिनिधि एक्स और वाई प्रस्तुत ग्राफ समन्वय, प्रवास पथ का चित्रण तंत्रिका के साथ संपर्क में एक केपीसी कैंसर सेल के; समय चूक videomicroscopy विश्लेषण नहीं बल्कि केपीसी कोशिकाओं और गैर हमलावर कोशिकाओं (चित्रा -3 सी-डी) के बीच आगे आंदोलन में मतभेद वेग दिखाया।

आंकड़ा 1 "src =" / files / ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
चित्रा 1:। प्रोटोकॉल कदम के योजनाबद्ध चित्रण यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। कैंसर सेल आक्रमण डीआरजी के न्यूरॉन्स के साथ (क) डीआरजी (ऊपर) और 0 दिन पर कैंसर की कोशिकाओं (नीचे) बोने (5X बढ़ाई) के बाद। (ख) डीआरजी और कैंसर 7 दिन कोशिकाओं सीडिंग (5X बढ़ाई) के बाद। (ग) कैंसर कोशिकाओं डीआरजी न्यूरॉन (तीर) के साथ पलायन। सभी सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3:। पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) न्यूरॉन्स प्रेरित सीएनआई (क) MiaPaCa2 कैंसर की कोशिकाओं, केपीसी कोशिकाओं, QLL2, और NIH3T3 कोशिकाओं की नसों का आक्रमण सूचकांक। (ख) एक तंत्रिका (लाल) और QLL2 सेल (बैंगनी) के साथ संपर्क में एक केपीसी कैंसर सेल के प्रवास पथ का चित्रण ग्राफ समन्वय। वाई और एक्स निर्देशांक दिखाए जाते हैं। (एन = प्रत्येक समूह में 12-20)। (ग) axonal संपर्क और (घ) केपीसी कैंसर की कोशिकाओं (एन = 20) के साथ QLL2 कैंसर की कोशिकाओं को पलायन के मूल से दूरी का विश्लेषण। पलायन की दिशा तंत्रिका नाड़ीग्रन्थि की ओर लगातार थी। (क) में दो तरफा छात्र टी परीक्षण द्वारा गणना की गई पी मूल्यों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह लेख इन विट्रो मॉडल है कि तंत्रिका आला में कैंसर microenvironment, डीआरजी मॉडल का स्मरण दिलाता है प्रस्तुत करता है। वीडियो सभी तरह के माउस में डीआरजी, इसकी निकासी, और अंत में, अपने ईसीएम में संवर्धन के रूप में संरचनात्मक स्थलों को पहचानने से शुरू कदम को दर्शाता है। सह संवर्धन कैंसर कोशिकाओं के साथ साथ डीआरजी भी प्रस्तुत किया है। वहाँ इन विट्रो में perineural आला microenvironment के अध्ययन के लिए इस मॉडल आवश्यक बनाने के लिए इन विट्रो perineural आक्रमण अनुसंधान के लिए कोई अन्य मॉडलों साहित्य में वर्णित हैं।

वीडियो में प्रस्तुत प्रोटोकॉल दो महत्वपूर्ण कदम है। सबसे पहले, ध्यान जब तंत्रिका डीआरजी शरीर (प्रोटोकॉल में कदम 2.7) से सटे लोभी लिया जाना चाहिए। लोभी या डीआरजी बन्द रखो डीआरजी के लिए अपरिवर्तनीय यांत्रिक या इस्कीमिक क्षति बढ़ रही है और जब पेट्री डिश में वरीयता प्राप्त अंकुरण से रोकने का कारण बन सकता है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम है आरोपणईसीएम अंदर पेट्री डिश में कैंसर की कोशिकाओं की। यह धीरे धीरे और सावधानी के साथ कोशिकाओं के बीज के लिए, कोशिकाओं के अस्थायी और पेट्री डिश पर उनके प्रसार से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। आरोपण का उद्देश्य एक ही स्थान में कोशिकाओं को स्थानीय बनाना, उनके आंदोलन (दूरी और दिशा) पर नज़र रखने की सुविधा है।

एक बार स्थापित मॉडल microenvironment का परीक्षण परिकल्पना के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पेट्री डिश (उदाहरण के लिए, गैर कैंसर कोशिकाओं) के लिए एक तिहाई सेल संस्कृति को जोड़ने के विभिन्न कोशिकाओं की neurotropic प्रवास क्षमताओं की तुलना करने के शोधकर्ता सक्षम बनाता है। इसके अलावा, शोधकर्ता विभिन्न स्थितियों (यानी, तापमान, आर्द्रता, घुलनशील कारकों, आदि) को लागू करने और कोशिकाओं आक्रमण की क्षमता पर उनके प्रभाव की जांच कर सकते हैं।

डीआरजी मॉडल कैंसर की कोशिकाओं और तंत्रिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के शोधकर्ता सक्षम बनाता है। यह भी समय व्यतीत हो जाने के प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है जो रूपात्मक मेंperineural आला में परिवर्तन एक अस्थायी फैशन में प्रदर्शन कर रहे हैं। इसके अलावा, neuroinvasive कोशिकाओं विभिन्न उपचार के अधीन किया जा सकता है और गैन्ग्लिया के neurites के साथ बातचीत पर उनके प्रभाव का आकलन किया जा सकता है।

नहीं हर कोशिका लाइन डीआरजी मॉडल के लिए उपयुक्त है। वे तंत्रिका के माध्यम से आक्रमण करने के लिए और ईसीएम नीचा करने के लिए आंतरिक क्षमता के साथ कैंसर की कोशिकाओं को होना चाहिए। इसके अलावा, ध्यान दें प्रत्येक कैंसर कोशिका प्रकार के अलग अलग आक्रमण लक्षण है और इतने समय कोशिकाओं से संपर्क बनाने के साथ बदलता रहता है डीआरजी neurites उम्मीद कर रहे हैं कि। उदाहरण के लिए, केपीसी कोशिकाओं हम जरूरत के 7 दिनों के बारे में MiaPaca कोशिकाओं (मानव अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं) जबकि डीआरजी की ओर ईसीएम के माध्यम से आक्रमण करने के लिए है कि संपर्क बनाने के लिए केवल 72-96 मानव संसाधन की जरूरत है इस्तेमाल किया।

इस मॉडल की एक सीमा है मानव कोशिकाओं के साथ संभव असंगति भी शामिल है। माउस डीआरजी के अपने प्रयोग के कारण, माउस मानव प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत हमेशा प्रदर्शन नहीं किया जा सकता है जब हूआदमी कैंसर कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाता है। जब भी दो अलग अलग प्रजातियों के साथ इस मॉडल का उपयोग करने की योजना बना, जांच की प्रोटीन की अनुरूपता परीक्षण किया जाना चाहिए और अगर वहाँ उच्च अनुरूपता है परख प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त माना जाता है। साथ ही, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि डीआरजी परख इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित के रूप में अन्य कोशिकाओं, न केवल न्यूरॉन्स (यानी, श्वान कोशिकाओं, fibroblasts, मैक्रोफेज, आदि) सहित तंत्रिका microenvironment प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, विशेष सेल आबादी विशेष रूप से परीक्षण नहीं किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
Operating microscope Leica M205
Time Lapse System Zeiss
Forceps Sigma-Aldrich F4142 
Surgical blade Sigma-Aldrich Z309036
Scissors Sigma-Aldrich S3271
35 mm Petri dishes, glass bottom de groot 60-627860
Name Company  Catalog Number Comments
Materials:
70% ethanol Sigma
Cold PBS Biological industries 02-023-1A
DMEM Biological industries 01-055-1A
FCS Rhenium 10108165
Penicillin and streptomycin Biological industries 01-031-1B
Sodium Pyruvate Biological industries 03-042-1B
L-Glutamine Biological industries 03-020-1B
Growth factor-depleted matrigel Trevigen 3433-005-01

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 110 पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) तंत्रिका आक्रमण अग्न्याशय प्रोस्टेट सेल neurotropic
पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि आदर्श: कैंसर तंत्रिका आक्रमण की <em>इन विट्रो</em> मॉडलिंग <em>में</em>
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Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In More

Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model. J. Vis. Exp. (110), e52990, doi:10.3791/52990 (2016).

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