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Neuroscience

कृन्तकों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग Synaptic टैगिंग / कैद और क्रॉस-कब्जा की जांच

Published: September 4, 2015 doi: 10.3791/53008
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Physiology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Neurobiology/Aging Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया।

कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव की 1. तैयारी (ACSF)

  1. 124 सोडियम क्लोराइड, 3.7 KCl (मिमी) MgSO 4 .7H 2 हे 1.0, 2.5 2 CaCl .2H 2 ओ से मिलकर ACSF, 1.2 के.एच. 2 4 पीओ, 24.6 3 NaHCO, और 10 डी ग्लूकोज तैयार करें। Electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के मिश्रण (carbogen)। दोनों विच्छेदन, टुकड़ा तैयारी के लिए 21 उपयोग इस ACSF और छिड़काव के लिए साथ संतृप्ति के लिए bubbled जब ACSF की पीएच 7.2-7.4 के बीच है सुनिश्चित करें।
    नोट: मापने और ACSF के आयोजन के लिए स्वच्छ तंत्र का प्रयोग करें। अशुद्ध उपकरण का उपयोग कर बादल समाधान या अवक्षेप के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। सभी तैयारियों के लिए विआयनीकृत पानी का प्रयोग करें।
  2. 3 NaHCO को छोड़कर एक 2 एल 10x ACSF स्टॉक तैयार 4 .7H 2 0 (4.92g), 2 CaCl .2H 2 0 (7.56 छ), के.एच. 2 4 पीओ (3.28 2 एल की एक मात्रा के छ) और ऊपर सभी अभिकर्मकों भंग कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करते हुए कम से कम 30 मिनट के लिए लगातार हिलाओ। 4 ओ सी में शेयर की दुकान और दो ​​सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
  3. विच्छेदन और प्रयोगों के लिए पहले, 3 NaHCO और डी ग्लूकोज के लिए जरूरी मात्रा के अलावा के साथ-साथ एक बड़ा फ्लास्क में ACSF शेयर पतला। 1 एल समाधान के लिए, 2.07 छ 3 NaHCO और 1.802 जी डी ग्लूकोज को जोड़ने के बाद 1 एल के लिए शेयर के 100 मिलीलीटर पतला। ACSF किसी भी वेग या अघुलित कणों से मुक्त एक स्पष्ट समाधान होना चाहिए।
  4. कूल के बारे में 200-300 मिलीलीटर बर्फ पर ACSF की, विच्छेदन के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा। विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया ACSF 2-4 डिग्री सेल्सियस के बीच है कि सुनिश्चित करें। Electrop के लिए शेष ACSF का प्रयोग करेंhysiological प्रयोगों। बुलबुला सभी ACSF समाधान लगातार carbogen (5% सीओ 2, 95% ओ 2) के साथ संतृप्ति के लिए। ACSF शांत करने के लिए इंतज़ार कर रही है, वहीं विच्छेदन क्षेत्र और टुकड़ा चैम्बर तैयार करते हैं।

इंटरफ़ेस चैंबर के 2. तैयारी

नोट: एक इंटरफेस मस्तिष्क टुकड़ा चैम्बर (चित्रा 2 बी) स्लाइस incubating और electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान उन्हें बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया, दो डिब्बों के होते हैं। निचले सदन में एक तापमान नियंत्रक से 32 डिग्री सेल्सियस पर रखा आसुत जल और लगातार carbogen साथ bubbled शामिल हैं।

  1. तापमान नियंत्रक पर स्विच और 32 डिग्री सेल्सियस पर यह पूर्व निर्धारित। इनफ्लो ट्यूबिंग के माध्यम से आसुत जल चलाकर 10 मिनट से 15 के लिए ऊपरी सदन धो लें। ऊपरी सदन शुद्ध रखने से पहले साफ है कि सुनिश्चित करें। नीचे कक्ष में है कि जल स्तर आसुत जल से भरे लगभग 70% है की जाँच करें।
  2. इसे रखोऊपरी सदन में शुद्ध स्लाइस के लिए एक आराम की सतह (चित्रा -2) प्रदान करने के लिए। समाधान स्तर पर्याप्त शुद्ध के पूरे क्षेत्र में गीला है कि यह सुनिश्चित करने के लिए बहिर्वाह ट्यूबिंग समायोजित करें। ऊपरी सदन के भीतर एक humidified carbogen वातावरण बनाए रखने के लिए नेट के ऊपर ढक्कन रखें।
  3. / मिनट 1 मिलीलीटर के लिए प्रवाह दर को समायोजित करें। टुकड़ा ऊष्मायन अवधि और प्रयोग के दौरान इस प्रवाह की दर को बनाए रखें। हौसले से तैयार 1x ACSF carbogenating शुरू और ACSF में इनफ्लो ट्यूबिंग विसर्जित कर दिया। ACSF इसके साथ भरा होना carbogen साथ और ऊपरी सदन के लिए संतृप्त किए जाने के लिए 20 मिनट की अनुमति दें।

एक्यूट हिप्पोकैम्पस स्लाइस की 3. तैयारी

नोट: विच्छेदन प्रोटोकॉल ठंड ACSF और (2) अलगाव और हिप्पोकैम्पस के टुकड़ा करने की क्रिया में पशु से मस्तिष्क की (1) को हटाने के होते हैं। न्यूरॉन्स, व्यवहार्य रहना अलग करने और जल्दी से ठंड ACSF में मस्तिष्क जगह है और पूरे पूरा करने के लिए आदेश में3-5 मिनट के भीतर करने की क्रिया सहित प्रक्रिया।

  1. ठंड ACSF में मस्तिष्क का हटाया
    1. चित्रा 1 ए में दिखाया ढंग से विच्छेदन उपकरण बाहर करना। विच्छेदन प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए उपयोग के आदेश के अनुसार उपकरणों की व्यवस्था। शुरू करने से पहले, सभी विच्छेदन उपकरण तैयार कर रहे हैं।
    2. , एथिल एसीटेट, पूर्ण इथेनॉल और आसुत जल से साफ एक रेजर ब्लेड, माउंट मैनुअल ऊतक हेलिकॉप्टर (चित्रा 1 बी) पर मजबूती से यह सुरक्षित और अत्याधुनिक समान रूप से गठबंधन किया है कि यह सुनिश्चित करें। फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा काट टेस्ट ब्लेड मजबूती से सुरक्षित है यह सुनिश्चित करने के लिए। इसके शुरू करने की स्थिति रपट वर्नियर माइक्रोमीटर सेट करें।
    3. एक प्रेरण कक्ष में जानवर का उपयोग कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) euthanize और पट्टी कैंची या गिलोटिन के साथ सिर काटना। एक आईरिस कैंची का प्रयोग, खोपड़ी के ऊपर की त्वचा और फर हटा दें। Brainstem.Make वीं के किनारे एक छोटा सा चीरा को दूर करने के पीछे के माध्यम से एक कटौती करेंखोपड़ी के सही पक्ष और बाईं तरफ एक लंबा चीरा ई।
      चेतावनी! यह हानिकारक से बचने के प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है उस तरफ करने के लिए केवल एक छोटा सा चीरा। कैंची डालने, जब लागू बल मस्तिष्क को नुकसान से बचने के लिए ऊपर की तरफ है कि सुनिश्चित करें।
    4. ध्यान कोर्टेक्स प्रकट करने के लिए खोपड़ी के दाईं ओर करने के लिए बाएँ से शुरू rongeur एक हड्डी के साथ खोपड़ी को हटा दें। ड्यूरा की एक पतली परत भी देखा जा सकता है। ध्यान rongeur साथ ललाट प्लेटों को हटा दें। ललाट प्लेटों के साथ-साथ ड्यूरा के सबसे निकालें।
      चेतावनी! ड्यूरा मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से टुकड़ा नहीं है कि सावधान रहें।
    5. विशेष रूप से एक रंग के फ्लैट अंत के साथ कोर्टेक्स और सेरिबैलम के बीच जंक्शन में, यदि कोई हो, शेष ड्यूरा निकालें। कदम 3.1.5 और 3.1.6 के लिए, यह हानिकारक से बचने के मस्तिष्क से दूर, ऊपर की तरफ यानी दबाव बनाए रखें। रंग का प्रयोग, धीरे ठंड और carbogenated ACSF (2-4 डिग्री सेल्सियस) से भरा एक पेट्री डिश, पीएलए में मस्तिष्क स्कूपएक एल्यूमीनियम ठंडा ब्लॉक पर ced।
  2. हिप्पोकैम्पस का अलगाव
    1. एक छुरी का प्रयोग, एक सीधे कट मस्तिष्क (लगभग एक चौथाई) का अग्र भाग को दूर करने के सेरिबैलम और एक और कटौती को दूर करने के लिए बनाते हैं। Midline के साथ एक उथले कटौती करें।
    2. ध्यान से पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस प्रकट करने के लिए midline से शुरू, एक दरांती scaler साथ कोर्टेक्स को हटा दें। हिप्पोकैम्पस ऊपर कोर्टेक्स की परत निकालें। मस्तिष्क का समर्थन करने के लिए उंगलियों या angled संदंश का प्रयोग करें। हिप्पोकैम्पस संयोजिका करने के लिए एक छोटा सा कटौती करें। धीरे रोलिंग गतियों का उपयोग पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस से शुरू दरांती scaler साथ हिप्पोकैम्पस को हटा दें।
      चेतावनी! खींच और हिप्पोकैम्पस फाड़ से बचने के लिए कोमल।
    3. दरांती scaler के साथ पृथक हिप्पोकैम्पस के आसपास किसी भी कोर्टेक्स और संयोजी ऊतक निकालें।
  3. हिप्पोकैम्पस ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया और इंटरफ़ेस चैम्बर पर स्लाइस स्थानांतरित
    1. ACSF- का एक टुकड़ा रखेंमैनुअल स्लाइसर का टुकड़ा करने की क्रिया के लिए मंच पर लथपथ फिल्टर पेपर (ग्रेड 1, 30 मिमी)। स्कूप और फिल्टर पेपर पर हिप्पोकैम्पस ऊतक जगह है। हिप्पोकैम्पस के बारे में 70 ओ झल्लरी करने के कोण पर कटा हुआ है कि इतने स्लाइसर के ब्लेड के संबंध में एक उचित अभिविन्यास में हिप्पोकैम्पस के लिए पंक्ति में फिल्टर पेपर ले जाएँ।
    2. एक जोड़ फिल्टर पेपर के साथ हिप्पोकैम्पस ऊतक (ग्रेड 1, 85 मिमी) थोड़ा गीला हिप्पोकैम्पस छोड़ने आसपास के अतिरिक्त समाधान दाग। Transversely हिप्पोकैम्पस टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करें। टुकड़ा आकृति विज्ञान स्पष्ट नहीं है जहां स्लाइस हिप्पोकैम्पस के चरम छोर से ऊतक त्यागने और।
    3. 400 माइक्रोन मोटी स्लाइस में शेष ऊतक स्लाइस। कोमल स्वाइप आंदोलनों का उपयोग कर नरम bristles के साथ एक ब्रश के साथ ब्लेड से धीरे हिप्पोकैम्पस स्लाइस उठाओ और ठंड carbogenated ACSF के साथ भरा एक छोटा सा बीकर में स्लाइस जगह। चरणों का प्रदर्शन 3.3.1-3.3.3 के रूप में जल्दी संभव के रूप में हिप्पोकैम्पस ऊतक हवा के संपर्क में है के बाद से।
      नोट: आम तौर पर हिप्पोकैम्पस के दो तिहाई से कटा हुआ है, और स्पष्ट आकृति विज्ञान के साथ 4-6 स्लाइस तैयार किया जा सकता।
    4. धीरे (टिप के 2-3 सेमी की दूरी पर काटने से बना) एक व्यापक टिप के साथ एक साफ प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का उपयोग टुकड़ा चैम्बर में नेट पर स्लाइस स्थानांतरण। ध्यान से एक तुला टिप के साथ एक छोटे से सिरिंज का उपयोग कर नेट पर स्लाइस की स्थिति को समायोजित। इलेक्ट्रोड स्थान और रिकॉर्डिंग की सुविधा है कि एक तरीके से स्लाइस रखें। स्लाइस पर्याप्त ACSF से घिरे हैं लेकिन जलमग्न या (चित्रा -2 सी डी) चल नहीं रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें। चैम्बर कवर और 2-3 घंटे के लिए स्लाइस सेते हैं।
      नोट: स्वस्थ स्लाइस में पिरामिड सेल परत कुछ पारदर्शिता दिखानी चाहिए।

सीए 3-सीए 1 synaptic प्रतिक्रियाओं का 4. रिकॉर्डिंग

नोट: क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट-अप चित्रा 2A में दिखाया गया है। एक Faraबिजली के हस्तक्षेप विद्युत सेटिंग्स की उचित ग्राउंडिंग के बाद नियंत्रण से परे है, तो दिन के पिंजरे पुरजोर सिफारिश की है। डूबे हुए है और इंटरफेस कक्षों से कई अलग अलग प्रकार के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि, इंटरफेस कक्षों उन में स्लाइस प्रदर्शनी और अधिक मजबूत synaptic प्रतिक्रियाओं के रूप में पसंद कर रहे हैं।

  1. इलेक्ट्रोड की पोजिशनिंग
    1. बिजली के उपकरण को चालू करें (stimulators और विस्तारक) इस्तेमाल किया जाएगा। माउंट और micromanipulators के plexiglass धारकों में उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सुरक्षित है।
      नोट: हम Monopolar, दोनों उत्तेजक और रिकॉर्डिंग प्रयोजनों के लिए 5 MΩ प्रतिरोध का लाह-लेपित, स्टेनलेस स्टील इलेक्ट्रोड का उपयोग करें।
    2. उपयोग करने से पहले, खींच गिलास केशिकाओं के अंदर इन इलेक्ट्रोड डालने और epoxy गोंद इलेक्ट्रोड टिप (चित्रा 2 ई) के ही छोटे से हिस्से को प्रकाश में लाने के साथ सुरक्षित है। यह तो पतला इलेक्ट्रोड को शक्ति देता है और हाथी में मजबूती से उन्हें सुरक्षित करने में मदद करता हैctrode धारकों।
    3. माइक्रोस्कोप के तहत निर्देशित, क्षेत्र-EPSP (fEPSP) प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए सीए 1 के शिखर वृक्ष के समान क्षेत्र में Schaffer जमानत के तंतुओं और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को प्रोत्साहित करने के लिए सीए 1 क्षेत्र की परत radiatum में उत्तेजक इलेक्ट्रोड (एस) की स्थिति।
      नोट: इलेक्ट्रोड के साथ टुकड़ा ऊपर तरल सतह के पास आ जल्दी टुकड़ा (बशर्ते, एम्पलीफायर एक लाउडस्पीकर से जुड़ा है) की सतह का पता लगाने में मदद करता है एक आवाज़ देता है।
    4. अन्तर्ग्रथनी टैगिंग और कब्जा प्रयोगों में, प्रयोग की जरूरत के अनुसार, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के दोनों तरफ की स्थिति में दो या तीन उत्तेजक इलेक्ट्रोड (एस 1, एस 2 या S3) दो या अधिक स्वतंत्र लेकिन ओवरलैपिंग आदानों को प्रोत्साहित करने के लिए। अलग 200 माइक्रोन के बारे में उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड स्थिति।
    5. यदि आवश्यक हो, जनसंख्या स्पाइक (चित्रा 3) की रिकॉर्डिंग के लिए परत pyramidale परत में एक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का पता लगाने .जब दोनोंइलेक्ट्रोड अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग, टुकड़ा छुआ है, एक उचित fEPSP संकेत सुनिश्चित करने के लिए एक परीक्षण उत्तेजना दे।
      नोट: हम परीक्षण उत्तेजना के लिए biphasic, निरंतर वर्तमान दालों (आवेग अवधि 0.1 मिसे / आधे लहर) का उपयोग करें।
    6. एक उचित fEPSP संकेत प्राप्त हो जाने के बाद, ध्यान से गहरी manipulators के ठीक आंदोलन knobs का उपयोग 200 माइक्रोन के बारे में इलेक्ट्रोड कम है। स्लाइस को ठीक करने के लिए 20 मिनट की अनुमति दें। एक बनती पल्स सरलीकरण प्रोटोकॉल 27,28 के साथ मार्ग स्वतंत्रता का परीक्षण करें।
  2. इनपुट-आउटपुट संबंध
    1. वर्तमान तीव्रता के एक रेंज में ढलान मूल्य को मापने के द्वारा प्रत्येक इनपुट के लिए इनपुट-आउटपुट संबंध (fEPSP ढलान बनाम अभिवाही उत्तेजना) का निर्धारण करते हैं। 100 μA के लिए 20 μA के बीच इस प्रदर्शन करना। तब अधिकतम fEPSP ढलान का 40% प्राप्त करने के लिए प्रत्येक इनपुट के लिए उत्तेजना तीव्रता निर्धारित किया है। प्रयोग के दौरान यह निरंतर रखें।
    2. 15-20 मिनट के बाद, आधारभूत रिकॉर्डिंग शुरू। च मॉनिटरEPSP इस अवधि के दौरान बारीकी ढलान और ढलान निर्धारित मूल्य से 10% से अधिक उतार चढ़ाव होता रहता है, तो उत्तेजना तीव्रता से कायम है और एक नया आधारभूत शुरू करते हैं। आगे बढ़ने से पहले रिकार्ड कम से कम 30 मिनट या 1 घंटा स्थिर आधारभूत।
      नोट: परीक्षण या आधारभूत उत्तेजना के लिए, हम हर 5 मिनट दिए गए 0.2 हर्ट्ज biphasic, निरंतर वर्तमान दालों के चार स्वीप (polarity के प्रति 0.1 मिसे) का उपयोग करें। इन चार प्रतिक्रियाओं के एक औसत ढलान फिर एक दोहराने के रूप में माना जाता है। संकेतों को एक एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर का उपयोग कर डिजीटल और कस्टम बनाया सॉफ्टवेयर के साथ ऑनलाइन निगरानी, ​​एक अंतर एम्पलीफायर द्वारा फ़िल्टर और परिलक्षित कर रहे हैं।
  3. एलटीपी / लिमिटेड की प्रेरण उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग
    नोट: एलटीपी और लि दोनों के रूप में जल्दी में वर्गीकृत किया गया है और प्रोटीन संश्लेषण की आवश्यकताओं के आधार पर देर-एलटीपी / लिमिटेड; अपने देर से रखरखाव के लिए बाद की आवश्यकता अनुवाद और / या प्रतिलेखन [समीक्षा के लिए 4 देखें]। बिजली की उत्तेजना के मानदंड की एक किस्म specificall कर सकते हैंY एलटीपी और लिमिटेड के विभिन्न रूपों को प्रेरित।
    1. WTET: 100 हर्ट्ज, 21 biphasic लगातार चालू दालों (चरण प्रति 0.2 मिसे)।
    2. STET: एक सेकंड (100 हर्ट्ज) हर 10 मिनट (चरण प्रति चौड़ाई 0.2 मिसे नाड़ी) के लिए 100 दालों के तीन फटने।
    3. एक 15 मिनट की अवधि से अधिक 900 फटने। 1 फट 50 ​​मिसे (20 हर्ट्ज) के एक interpulse अंतराल के साथ 3 दालों (0.2 मिसे चौड़ाई) के होते हैं। इंटर फट अंतराल 1 सेकंड (दालों 2,700 की कुल संख्या) है।

स्लाइस चैंबर और छिड़काव प्रणाली 5. सफाई

  1. रिकॉर्डिंग के बाद खत्म हो गया है, आगे के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए हिप्पोकैम्पस स्लाइस इकट्ठा या किसी और उचित रूप से त्यागें। Carbogen आपूर्ति और तापमान नियंत्रक को बंद कर दें। आसुत जल में carbogen bubbler धो लें।
  2. एक ब्रश और आसुत पानी से अच्छी तरह शुद्ध साफ करें। एक उच्च प्रवाह दर पर आसुत जल से 15-20 मिनट के लिए रिग धो लें। 3-4 दिन में एक बार में आसुत जल बदलनिचले सदन के डिब्बे और 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के साथ चैम्बर नियमित रूप से यह भी साफ कवक विकास से बचने के लिए।

Representative Results

वर्णित पद्धति (Wistar)। ऐसे वयस्क चूहों की तीव्र hippocampal स्लाइस से synaptic टैगिंग और पार पकड़ने के रूप में एलटीपी / लिमिटेड और उसकी साहचर्य बातचीत के लंबे समय तक चलने रूपों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 23 इस तकनीक को दोनों चूहों के साथ प्रयोगों के लिए प्रभावी साबित हो गया है और माउस की एक किस्म 30,31 उपभेदों। कार्यप्रणाली अप करने के लिए 8-12 घंटे की स्थिर एलटीपी रिकॉर्डिंग के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। 32

जल्दी एलटीपी की, (चित्रा 3 बी, भरा हलकों एस 2) जिससे बदलने अन्यथा खस्ताहाल प्रपत्र (एक इनपुट (एस 1) के कमजोर धनुष्टकार का उत्पन्न होना द्वारा निर्धारित 'टैग' 'PRPs' एक स्वतंत्र लेकिन ओवरलैपिंग इनपुट की मजबूत धनुष्टकार का उत्पन्न होना द्वारा प्रेरित कब्जा एक लंबे समय तक चलने वाले एक (चित्रा 3 बी, खुला हलकों) में एस 1 में -LTP) (WTET से प्रेरित जल्दी-एलटीपी की तुलना के लिए) 20,33 देखते हैं। कमजोर द्वारा कब्जा कर लिया PRPsधनुष्टकार का उत्पन्न होना सेट टैग जरूरी STET प्रेरित देर एलटीपी से आने की जरूरत नहीं है, लेकिन यह भी SLFS प्रेरित देर लिमिटेड द्वारा प्रदान किया जा सकता है। एलटीपी और लिमिटेड के बीच सकारात्मक साहचर्य बातचीत के इस प्रकार 'पार-टैगिंग / कब्जा' के रूप में जाना जाता है। एस 1 में WTET प्रेरित जल्दी-एलटीपी S2 में SLFS प्रेरित देर लिमिटेड द्वारा प्रदान की PRPs (चित्रा -3 सी, भरा हलकों) पर कब्जा करने से देर-एलटीपी (चित्रा -3 सी, खुला हलकों) को मजबूत बनाया जाता है। अपने स्वयं के आधारभूत की तुलना में जब सांख्यिकीय महत्वपूर्ण potentiation या अवसाद दोनों ही मामलों में एस 1 और एस 2 में बनाए रखा गया था (Wilcoxon परीक्षण, पी <0.05)।

टैग-पीआरपी बातचीत के लिए होते हैं (कमजोर पहले मजबूत / मजबूत-पहले कमजोर) दो घटनाओं के बीच समय खिड़की 30-60 की सीमा के भीतर रहता है, दो घटनाओं के अस्थायी आदेश लंबे समय के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है मिनट। आईटी में एक तीसरे स्वतंत्र लेकिन ओवरलैपिंग अन्तर्ग्रथनी शामिल करने के लिए वार किया जाएगारख दिया और रिकॉर्डिंग की स्थिरता की निगरानी के लिए एक आधारभूत नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल करते हैं। एलटीपी / लिमिटेड के early- और देर रूपों को प्रेरित किया जाता बिजली की उत्तेजना प्रोटोकॉल एसटीसी प्रयोगों में उन का उपयोग करने से पहले स्थिरता और विश्वसनीयता के लिए एकल इनपुट प्रयोगों में मान्य किया जाना चाहिए। हम भी इन प्रयोगों की सफलता स्लाइस की गुणवत्ता पर काफी निर्भर करता है के बाद से प्रोटोकॉल में वर्णित टुकड़ा तैयारी पद्धति के महत्व पर जोर देना चाहूंगा।

चित्र 1
हिप्पोकैम्पस के विच्छेदन में इस्तेमाल चित्रा 1 (ए) उपकरण: (क) पट्टी कैंची (ख) आइरिस कैंची (ग) अस्थि rongeur (घ) पतली रंग, शीतल (ई) स्केल्पल संख्या 11 (च) सिकल scaler (G) -bristle पेंट ब्रश (ज) प्लास्टिक पाश्चर विंदुक (i) के फिल्टर पेपर (85mm) (जे) फिल्टर पेपर (30mm) (कश्मीर) पेट्री डिश और बीकर फिट करने के लिए ग्लास बीकर (एल) एल्यूमिनियम ठंडा ब्लॉकों(एम) पेट्री डिश। (बी) मैनुअल ऊतक हेलिकॉप्टर। (क) प्लेटफार्म (ख) ब्लेड धारक (ग) वर्नियर माइक्रोमीटर, संकल्प 10 माइक्रोन के साथ हाथ काटना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट-अप (ए) stimulators से मिलकर क्षेत्र के संभावित रिकॉर्डिंग के लिए (ख) एक अंतर एम्पलीफायर (ग) एक एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर (घ) आस्टसीलस्कप (ई) के अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (च) के साथ कंप्यूटर Vibration- प्रतिरोधी टेबल टॉप इलेक्ट्रोड धारकों के साथ> 4x बढ़ाई (ज) इंटरफेस मस्तिष्क टुकड़ा चैम्बर (मैं) ACSF और carbogen आपूर्ति (जे) तापमान नियंत्रक (कश्मीर) के लिए एक छिड़काव प्रणाली एक रोशनी स्रोत (एल) चालाकी के साथ (G) माइक्रोस्कोप। (बी) इंटरफ़ेस मस्तिष्क टुकड़ाचैम्बर। (सी) एवं (घ) इंटरफेस कक्ष में hippocampal स्लाइस एक गिलास केशिका में तय हो गया। (ई) स्टेनलेस स्टील इलेक्ट्रोड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. (क) क्षेत्र के संभावित रिकॉर्डिंग के लिए एक अनुप्रस्थ हिप्पोकैम्पस टुकड़ा और इलेक्ट्रोड स्थान की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: इस प्रतिनिधित्व में, दो उत्तेजक इलेक्ट्रोड (एस 1 और एस 2) को प्रोत्साहित करने के लिए सीए 1 क्षेत्र की परत radiatum में तैनात हैं दो स्वतंत्र लेकिन ओवरलैपिंग सीए 1 पिरामिड न्यूरॉन्स पर अन्तर्ग्रथनी आदानों। दो बाह्य रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, एक शिखर वृक्ष के समान डिब्बे से क्षेत्र-EPSP (उत्तेजक बाद synaptic संभावित) दर्ज करने के लिए और एक और पिरामिड सेल से दैहिक आबादी कील रिकॉर्ड करने के लिएनिकायों, क्रमशः परत radiatum और परत pyramidale में स्थित हैं। CA1- कोर्नु एम्मोनिस क्षेत्र 1, CA3- कोर्नु एम्मोनिस क्षेत्र 3, DG- दांतेदार गाइरस, SC- Schaffer जमानत के फाइबर, S1- उत्तेजक इलेक्ट्रोड 1, एस 2-उत्तेजक इलेक्ट्रोड 2. (बी) के कमजोर एसटीसी का अध्ययन करने के लिए मजबूत प्रतिमान से पहले: कमजोर धनुष्टकार का उत्पन्न होना (WTET) देर एलटीपी प्रेरित करने के लिए 30 मिनट में एस 2 की मजबूत धनुष्टकार का उत्पन्न होना (STET) (भरा हलकों) के बाद जल्दी-एलटीपी उत्प्रेरण के लिए (खुला हलकों) एस 1 के लिए आवेदन किया है। एस 1 में जल्दी-एलटीपी टैगिंग दिखा देर एलटीपी को मजबूत बनाया और क्रॉस-टैगिंग का अध्ययन करने के लिए मजबूत प्रतिमान से पहले (एन = 6) (सी) के कमजोर बातचीत पर कब्जा हो जाता है। जल्दी-एलटीपी पीछा एस 1 (खुला हलकों) में WTET से प्रेरित है 30 मिनट के बाद SLFS का उपयोग कर S2 में देर लिमिटेड की प्रेरण (भरा हलकों) द्वारा। एस 1 में, जल्दी-एलटीपी पार टैगिंग और कब्जा दिखा 6 घंटा तक चलने देर एलटीपी को तब्दील हो जाता है (एन = 6)। एकल तीर जल्दी-एलटीपी उत्प्रेरण के लिए आवेदन कमजोर धनुष्टकार का उत्पन्न होना प्रतिनिधित्व करता है। तीर की ट्रिपलेट का प्रतिनिधित्व करता हैदेर-एलटीपी उत्प्रेरण के लिए मजबूत धनुष्टकार का उत्पन्न होना। टूटे हुए तीर SLFS देर लिमिटेड प्रेरित करने के लिए प्रतिनिधि synaptic इनपुट करने के लिए लागू किया गया था, जिस पर समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि सलाखों SEM संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक्यूट hippocampal टुकड़ा एलटीपी और इस तरह एसटीसी और पार पकड़ने के रूप में अन्य कार्यात्मक प्लास्टिसिटी प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है। यह हिप्पोकैम्पस सर्किट के लामिना संरचनात्मक नेटवर्क का ज्यादा सटीक, इलेक्ट्रोड स्थानों की अनुमति देता है और एक रक्त मस्तिष्क बाधा के बिना, के साथ-साथ तेजी से neuropharmacological हेरफेर के लिए एक खुला मंच प्रदान करता है बरकरार रखता है।

यह लेख युवा वयस्क चूहों से व्यवहार्य तीव्र hippocampal स्लाइस की तैयारी के लिए कार्यप्रणाली का वर्णन करता है और एसटीसी और क्रॉस-टैगिंग की जांच करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं। पिछले अनुसंधान जानवरों की लिंग और उम्र इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पढ़ाई में उपयोग के लिए विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं कि जोर दिया है। पूरी तरह से व्यक्त वयस्क रिसेप्टर कार्यों (5-7 सप्ताह के आयु वर्ग के पुरुष Wistar चूहों) के साथ 27,28 इसलिए युवा वयस्क जानवरों का इस्तेमाल किया जाता है। 23 विषमताओं छोड़ दिया और सही हिप्पोकैम्पस के बीच कनेक्शन में कृन्तकों 29 में उल्लेख किया गया है औरNMDA रिसेप्टर अभिव्यक्ति में प्रमुख मतभेद अच्छी तरह से 34 के रूप में सूचित कर दिया गया है। हम फिर भी। हमारे पिछले एलटीपी पढ़ाई के साथ संगत होना करने के लिए 23,32 सही हिप्पोकैम्पस का इस्तेमाल किया है hippocampi के रूप में या तो लंबे समय तक निरंतरता बनाए रखा है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

किसी भी प्रोटोकॉल के रूप में, यह अलगाव और ऊतक, फैला क्षतिग्रस्त, सूखा या hypoxic नहीं गाया है कि जल्दी प्रक्रियाओं टुकड़ा करने की क्रिया है लेकिन देखभाल प्रदर्शन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। पीएच, तापमान और समाधान की आयनिक संरचना में बदलाव के स्लाइस और परिणामों की व्यवहार्यता पर गहरा असर पड़ सकता है। इसलिए इस तरह के बदलाव से परहेज किया जाना चाहिए। यह तैयारी चरणों के दौरान होने वाली ग्लूटामेट रिसेप्टर पर निर्भर कैल्शियम रिहाई अचल तंत्रिका ऊतक 35,36, 37 में प्रोटीन संश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं कि देखा गया है। मैनुअल ऊतक स्लाइसर का उपयोग करते हुए छठी की तुलना में बहुत जल्दी पूरा होने की प्रक्रिया की अनुमति देकर इस कम करने में मदद कर सकते हैंbraslicers। हालांकि, कई प्रयोगशालाओं भी प्रभावी ढंग से टुकड़ा व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए आवश्यक सावधानियों के साथ vibraslicers का उपयोग करें। विचार करने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कारक प्रयोगों के शुरू करने से पहले लंबे समय तक ऊष्मायन अवधि है। इस अशांति तैयारी 23 के दौरान की वजह से बाद स्लाइस में चयापचय राज्य और काइनेज सक्रियण के स्तर में स्थिरता प्राप्त करने के लिए वास्तव में महत्वपूर्ण होने के लिए उल्लेख किया गया है। इस तरह की स्थिरता लंबे समय तक रिकॉर्डिंग में स्थिरता के लिए आवश्यक है। हम इस अवलोकन पर फिर से जोर देना और के बारे में 3 घंटे की लंबी ऊष्मायन घंटे सुझाव देते हैं।

उत्तेजना मानकों की एक किस्म एलटीपी प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, लेकिन हर मामले में हासिल आणविक तंत्र (समीक्षा के लिए 38 देखें) ही नहीं हो सकता। यह स्थायित्व और बदले में, अन्तर्ग्रथनी टैगिंग और कब्जा प्रयोगों के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, जो एलटीपी की अन्य विशेषताओं को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए यह उत्तेजना मानदंड और विशेषताओं को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हैहासिल एलटीपी का प्रदर्शन कर प्रयोगशाला की परिस्थितियों में और स्थिरता बनाए रखने के लिए।

हम आम तौर पर बहुत बड़ी प्रेस्य्नाप्तिक फाइबर गलौज के साथ और अधिक से अधिक 0.5 एम वी से कम fEPSPs और रिकॉर्डिंग भी खारिज कर रहे हैं के दौरान फाइबर वॉली में काफी परिवर्तन से जुड़े प्रयोगों के साथ प्रयोगों पर विचार नहीं है। इसके अलावा, दो मार्ग या तीन मार्ग प्रयोगों प्रदर्शन, जबकि यह मार्ग स्वतंत्रता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक बनती पल्स सरलीकरण प्रोटोकॉल 28 के साथ किया जा सकता है।

इंटरफेस रिकॉर्डिंग सिस्टम का एक नकारात्मक पक्ष यह चैम्बर और आसपास के बीच तापमान और आर्द्रता के मतभेद के कारण लंबे समय रिकॉर्डिंग घंटों के दौरान इलेक्ट्रोड पर संक्षेपण बूंदों के गठन की है। इन बूंदों को ध्यान से समय-समय पर मिट जाने की जरूरत है। अन्यथा बूंदों स्लाइस पर ड्रिप और अशांति या संकेतों का भी नुकसान हो सकता है। हम आम तौर पर इस ख से निपटनेY खूबी इलेक्ट्रोड को छूने के बिना, एक पतला फिल्टर पेपर बाती का उपयोग कर खुर्दबीन के तहत निर्देशित बूंदों सोख्ता। हालांकि, सबसे अच्छा समाधान इस तरह के एडिनबर्ग विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं ने द्वारा विकसित प्रणाली आदि के रूप में एक केंद्रीय हीटिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए किया जाएगा।

एक समापन पर ध्यान दें, तरीकों की एक किस्म के विभिन्न प्रयोजनों के लिए प्रयोगात्मक हिप्पोकैम्पस स्लाइस की तैयारी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि दुनिया भर में प्रयोगशालाओं में मौजूद हैं। प्रक्रिया का एक दूसरे पर कुछ लाभ प्रदान करता है। एक सावधानी से प्रयोग के उद्देश्य के अनुरूप करने के लिए प्रोटोकॉल के मिनट विवरण का अनुकूलन करने की जरूरत है। हम इस लेख में इस तरह एसटीसी और पार पकड़ने के रूप में देर से साहचर्य प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की पद्धति के कुछ पहलुओं में सुधार लाने में मदद करता है कि उम्मीद है।

Disclosures

इस वीडियो लेख के लिए ओपन एक्सेस Cerebos प्रशांत लिमिटेड द्वारा प्रायोजित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Dissection Tools
1. Bandage scissors KLS Martin, Germany 21-195-23-07
B-Braun/Aesculap, Germany LX553R
2. Iris scissors B-Braun/Aesculap, Germany BC140R,
BC100R
3. Bone rongeur World Precision Instruments (WPI), Germany 14089-G
4. Scalpel World Precision Instruments (WPI), Germany; 500236-G
B-Braun/Aesculap, Germany
BB73
5. Scalpel blade#11 B-Braun/Aesculap, Germany BB511
6. Sickle scaler KLS Martin, Germany 38-685-00
7. Angled forceps B-Braun/Aesculap, Germany BD321R
8. Anesthetizing/Induction chamber MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon AS-01-0530-LG
II. ACSF component chemicals
1. Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
2. Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) Sigma-Aldrich M1880
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma-Aldrich C3881
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) Sigma-Aldrich G7021
III. Electrophysiology Instruments
1. Microscope Olympus, Japan Model SZ61
2. Temperature Controller Scientific Systems Design Inc. Canada PTC03
3. Differential AC Amplifier AM Systems, USA Model 1700
4. Isolated Pulse Stimulator AM Systems, USA Model 2100
5. Oscilloscope Rhode & Schwarz HM0722
6. Digital-Analog Converter Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK CED-Power 1401-3
7. Interface Brain Slice Chamber Scientific Systems Design Inc. Canada BSC01
8. Tubing Pump Ismatec, Idex Health & Science, Germany REGLO-Analog
9. Carbogen Flowmeter Cole-Parmer 03220-44
10. Fiber Light Illuminator Dolan-Jenner Industries Fiber Lite MI-150
11. Micromanipulators Marzhauser Wetzlar, Germany 00-42-101-0000 (MM-33)
00-42-102-0000 (MM-32)

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 103 दीर्घकालिक potentiation लंबे समय तक अवसाद Synaptic टैगिंग Synaptic टैगिंग और कब्जा क्रॉस-कब्जा
कृन्तकों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग Synaptic टैगिंग / कैद और क्रॉस-कब्जा की जांच
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Shetty, M. S., Sharma, M., Hui, N.… More

Shetty, M. S., Sharma, M., Hui, N. S., Dasgupta, A., Gopinadhan, S., Sajikumar, S. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J. Vis. Exp. (103), e53008, doi:10.3791/53008 (2015).

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