Protocol
Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av National University of Singapore.
1. Framställning av artificiell cerebrospinalvätska (ACSF)
- Förbered ACSF som består av (i mM) 124 NaCl, 3,7 KCl, 1,0 MgSO 4 .7H 2 O, 2,5 CaCl2 .2H 2 O, 1,2 KH 2 PO 4, 24,6 NaHCOs 3, och 10 D-glukos. Se till att pH-värdet för ACSF är mellan 7,2-7,4 när bubblade till mättnad med 95% O2 och 5% CO2 blandning (carbogen). 21 Använd denna ACSF för både dissekering, skiva förberedelse och perfusion under elektrofysiologiska inspelningar.
OBS: Använd ren apparat för att mäta och hålla ACSF. Med hjälp av orena apparat kan leda till grumliga lösningar eller bildning av fällningar. Använd avjoniserat vatten för alla förberedelser. - Bered en 2 L 10x ACSF lager exklusive NaHCO 3 4 .7H 2 0 (4,92 g), CaCl2 .2H 2 0 (7,56 g), KH 2 PO 4 (3,28 g) och fyll upp till en volym på 2 L. Rör kontinuerligt under minst 30 minuter med hjälp av en magnetisk omrörare för att säkerställa att alla reagenser löses. Förvara lager i 4 ° C och använd inom 2 veckor.
- Före dissektion och experimenten, späd ACSF lager i en mätkolv tillsammans med tillsatsen av nödvändiga mängder av NaHCOs 3 och D-glukos. För en L-lösning, späd 100 ml av beståndet till ett L efter tillsats av 2,07 g NaHCO 3 och 1,802 g D-glukos. ACSF ska vara en klar lösning fri från fällning eller oupplösta partiklar.
- Cool ca 200-300 ml ACSF på is, som ska användas under dissekering. Kontrollera att ACSF används för dissekering är mellan 2-4 ° C. Använd återstående ACSF för electrophysiological experiment. Bubble alla ACSF lösningar till mättnad med karbogen (5% CO2, 95% O2) kontinuerligt. I väntan på ACSF svalna, förbereda dissektion området och munstyckskammaren.
2. Framställning av Interface avdelningen
OBS: Ett gränssnitt hjärn munstyckskammaren, som används för inkubation av segment och behålla dem under elektrofysiologiska inspelningar (figur 2B), består av två avdelningar. Den nedre kammaren innehåller destillerat vatten som hölls vid 32 ° C med en temperaturstyrenhet och bubblades kontinuerligt med carbogen.
- Slå på temperaturkontroll och förinställda den vid 32 ° C. Tvätta den övre kammaren för 10 till 15 minuter genom att köra destillerat vatten genom inflödesslangen. Se till att den övre kammaren är ren innan du placerar på nätet. Kontrollera att vattennivån i den nedre kammaren är cirka 70% fylld med destillerat vatten.
- Placeranetto i den övre kammaren för att åstadkomma en viloyta för skivor (figur 2C). Justera utflödet slangen för att säkerställa att lösningen nivån är tillräckligt väta hela området av nätet. Placera locket över nätet för att upprätthålla en fuktig karbogen atmosfär inuti den övre kammaren.
- Justera flödeshastigheten till 1 ml / min. Behåll denna flödeshastighet hela segmentet inkubationstiden och experimentet. Börja carbogenating nyberedd 1x ACSF och sänk inflödet slangen i ACSF. Tillåt 20 min för ACSF att vara mättad med karbogen och för den övre kammaren för att fyllas med den.
3. Framställning av akut hippocampus skivor
OBS: dissektion protokoll består av (1) Avlägsnande av hjärnan från djuret i kallt ACSF och (2) Isolering och skivning av hippocampus. För nervceller att förbli livskraftig, isolera och placera hjärnan i kallt ACSF snabbt och slutföra helaprocess inklusive skivning inom 3-5 minuter.
- Borttagning av hjärnan i kallt ACSF
- Lägg ut dissektion verktyg på det sätt som visas i figur 1A. Ordna verktygen enligt den ordning de används för att underlätta dissekering processen. Innan du börjar, se till att alla dissektion verktyg är redo.
- Montera ett rakblad, rengöras med etylacetat, absolut etanol och destillerat vatten, på den manuella vävnad chopper (Figur 1B), fast den ordentligt och se till att skäreggen jämnt linje. Test hugga en bit filterpapper för att se till att bladet sitter fast ordentligt. Ställ skjut Vernier mikrometer till sin startposition.
- Avliva djuret med användning av koldioxid (CO 2) i en induktionskammare och halshugga med bandage sax eller Guillotine. Med hjälp av en iris sax, ta bort huden och päls ovanför skallen. Skär ett snitt genom den bakre för att avlägsna brainstem.Make ett litet snitt längs the högra sidan av skallen och en längre snitt på vänster sida.
OBS! Gör endast ett litet snitt på den sida som används för experimenten för att undvika att skada den. När du sätter saxen, se till att den kraft som appliceras är uppåt för att undvika skador på hjärnan. - Försiktigt bort skallen med ett ben rongeur start från vänster till höger sida av skallen för att avslöja cortex. Ett tunt skikt av dura kan också ses. Försiktigt bort frontplåtarna med rongeur. Avlägsna det mesta av dura tillsammans med de främre plattorna.
OBS! Var försiktig så att dura inte skära genom hjärnvävnaden. - Avlägsna återstående dura, om någon, specifikt i korsningen mellan cortex och cerebellum med den platta änden av en spatel. För steg 3.1.5 och 3.1.6, bibehålla trycket uppåt dvs bort från hjärnan för att undvika att skada den. Med hjälp av spateln, försiktigt scoop hjärnan till en petriskål fylld med kallt och carbogenated ACSF (2-4 ° C), placed på ett aluminium kylblock.
- Isolering av hippocampus
- Med användning av en skalpell görs ett rakt snitt för avlägsnande av lillhjärnan och en annan snitt för att avlägsna den främre delen av hjärnan (ungefär kvart). Gör ett grunt snitt längs mittlinjen.
- Försiktigt bort cortex med en skära scaler, med början från mittlinjen för att avslöja rygg hippocampus. Ta bort lagret av cortex ovanför hippocampus. Använd fingrarna eller vinklade pincett för att stödja hjärnan. Gör ett litet snitt i hippocampus commissure. Försiktigt bort hippocampus med skäran scaler utgående från rygg hippocampus som använder rullande rörelser.
OBS! Var försiktig för att undvika stretching och riva hippocampus. - Ta bort alla cortex och bindväv runt den isolerade hippocampus med skäran scaler.
- Skivning hippocampus vävnad och överföra skivorna på gränssnittet kammaren
- Placera en bit av ACSF-indränkt filtrerpapper (grad 1, 30 mm) på skivning skede av det manuella skärorganet. Kammar och placera hippocampusvävnad på filterpapperet. Flytta filterpapper för att rikta in hippocampus vid en lämplig orientering i förhållande till bladet på skärorganet, så att hippocampus skivas med en vinkel av omkring 70 ° till fimbria.
- Blot överskottslösningen omger hippocampusvävnad med ett vikt filterpapper (Grad 1, 85 mm) som lämnar hippocampus något vått. Börja skära hippocampus tvären. Skiva och kassera vävnad från den yttersta änden av hippocampus där segmentet morfologi är inte klart.
- Skiva kvarvarande vävnaden i 400 | j, m-tjocka skivor. Plocka upp hippocampus skivor försiktigt från bladet med en borste med mjuk borst som använder mjuka svepa rörelser och lägg skivorna i en liten bägare fylld med kallt carbogenated ACSF. Utför stegen 3.3.1-3.3.3 så snabbt som möjligt eftersom hippocampusvävnad exponeras för luft.
OBS: I allmänhet två tredjedelar av hippocampus skivas och 4-6 skivor med tydlig morfologi kan framställas. - Överför skivorna försiktigt på nätet i munstyckskammaren med en ren plast pasteurpipett med en bred spets (tillverkad genom att skära bort 2-3 cm av spetsen). Justera noggrant positionen för skivorna på nätet med användning av en liten spruta med en böjd spets. Placera skivorna på ett sätt som underlättar elektrod plats och inspelning. Kontrollera att skivorna är tillräckligt omgivna av ACSF men inte nedsänkta eller flytande (Figur 2C-D). Täck kammaren och inkubera skivorna för 2-3 timmar.
OBS: Det pyramidala cellskiktet i friska skivor bör visa viss öppenhet.
4. Registrering av CA3-CA1 Synaptic svar
OBS: elektrofysiologi set-up som används för fältpotential inspelning visas i figur 2A. En Faradag bur rekommenderas starkt om den elektriska störningar är bortom kontroll efter korrekt jordning av de elektriska inställningar. Många olika typer av submersa och gränssnittskammare är kommersiellt tillgängliga. Men gränssnittskammare föredragna som skivor uppvisar mer robust synaptiska svar i dem.
- Placering av elektroderna
- Slå på den elektriska apparaten (stimulatorer och förstärkare) som skall användas. Montera och säkra stimulerande och inspelning elektroder i plexiglas innehavarna av de mikromanipulatorer.
OBS: Vi använder monopolära, lackbelagda, rostfria elektroder av 5 MQ motstånd för både stimulerande och inspelningsändamål. - Före användning, infoga dessa elektroder inuti drog glaskapillärer och säkra med epoxilim exponera endast liten del av elektrodspetsen (Figur 2E). Detta ger styrka åt de annars slanka elektroderna och hjälper till att säkra dem ordentligt i electrode hållare.
- Guidad under mikroskopet, placera stimulerande elektroden (er) i stratum radiatum av CA1 regionen för att stimulera Schaffer säkerheter fibrer och inspelningen elektroden i den apikala dendritiska regionen CA1 att spela fält EPSP (fEPSP) svar.
OBS: Närmar vätskeytan ovanför segmentet med elektrod ger ett ljud som hjälper till att lokalisera snabbt ytan av den del (tillgänglig, är förstärkaren ansluten till en högtalare). - I synaptiska taggning och infångningsexperiment, enligt behovet av experimentet, position två eller tre stimulerande elektroder (S1, S2 eller S3) på vardera sidan av den registrerande elektroden att stimulera två eller flera oberoende men överlappande ingångar. Placera stimulerande och inspelning elektroder ca 200 um isär.
- Om det behövs, lokalisera en annan inspelning elektrod i stratum pyramidale skiktet för inspelning av populationsspetsen (figur 3A) .När bådeelektroder har rört skiva, med hjälp av förvärv programvara, ge en teststimulation att säkerställa en korrekt fEPSP signal.
OBS: Vi använder bifasiska, konstantströmpulser (impuls varaktighet 0,1 ms / halv wave) för teststimulation. - När en ordentlig fEPSP signal erhålls, sänk försiktigt elektroderna om 200 um djup med hjälp av fina rörelse knoppar av manipulatorer. Låt 20 minuter för skivor att återhämta sig. Testa vägen självständighet med en parade puls underlättande protokoll 27,28.
- Slå på den elektriska apparaten (stimulatorer och förstärkare) som skall användas. Montera och säkra stimulerande och inspelning elektroder i plexiglas innehavarna av de mikromanipulatorer.
- Input-output relation
- Bestäm input-output relation (afferenta stimulering vs fEPSP lutning) för varje ingång genom att mäta lutningsvärdet på en rad olika strömstyrkor. Utför denna mellan 20 iA till 100 iA. Ställ sedan in stimuleringsnivån för varje ingång för att erhålla 40% av den maximala fEPSP lutning. Hålla denna konstant genom experimentet.
- Efter 15-20 minuter, börja spela baslinjen. Övervaka fEPSP lutning noga under denna period och återställa stimulusintensitet om lutningen varierar mer än 10% från inställt värde och starta en ny baslinje. Spela minst 30 minuter eller en timme stabil baslinje innan du fortsätter.
OBS: För testet eller baslinjen stimulans, använder vi fyra svep av 0,2 Hz bifasiska, konstanta strömpulser (0,1 ms per polaritet) ges varje 5 min. En genomsnittlig lutning av dessa fyra svar då betraktas som en upprepning. Signalerna filtreras och förstärks av en differentialförstärkare, digitaliseras med hjälp av en analog-till-digitalomvandlare och övervakades online med skräddarsydd mjukvara.
- Induktion av LTP / LTD använder stimuleringsprotokoll
OBS: Både LTP och LTD har klassificerats som tidig och sen-LTP / LTD baserat på kraven i proteinsyntes; den senare kräver översättning och / eller transkription för sin sena underhåll [för översikt se 4]. En mängd olika elektriska stimulering paradigm kan specifically förmå de olika former av LTP och LTD.- WTET: 100 Hz, 21 bifasiska konstant strömpulser (0,2 msek per fas).
- STET: Tre skurar av 100 pulser för en sekund (100 Hz) var 10 min (pulsbredd 0,2 ms per fas).
- 900 skurar under en 15 min varaktighet. 1 skur består av 3 pulser (0,2 msek bredd) med en mellanpulsintervall på 50 msek (20 Hz). Den interskurintervall är 1 sek (totalt antal pulser 2700).
5. Rengöring av Slice avdelningen och Perfusion System
- Efter inspelningen är över, samla hippocampus skivor för ytterligare biokemisk analys eller annars kasta på lämpligt sätt. Stäng av carbogen försörjningen och temperaturkontroll. Tvätta carbogen bubblare i destillerat vatten.
- Rengör nätet noggrant med en borste och destillerat vatten. Tvätta rigg för 15-20 min med destillerat vatten vid en högre flödeshastighet. En gång i 3-4 dagar, ändra destillerat vatten inedre avdelning av kammaren och även rena kammaren regelbundet med 3% -ig väteperoxidlösning för att undvika svamptillväxt.
Representative Results
Den beskrivna metoden har använts för att studera långvariga former av LTP / LTD och dess associativa interaktioner såsom synaptiska märkning och kors fånga från akut hippocampus skivor av vuxna råttor. 23 Denna teknik har visat sig vara effektiv för experiment med både råttor (Wistar) och en mängd olika musstammar 30,31. Metodiken har använts med framgång för stabila LTP inspelningar av upp till 8-12 timmar. 32
Den "tag" som av den svaga tetanization av en ingång (S1) fångar "PRP" inducerad av den starka tetanization annan oberoende men överlappande ingång (S2, figur 3B, fyllda cirklar) och därigenom omvandla den annars ruttnande form av LTP (tidigt -LTP) i S1 till en långvarig en (Figur 3B, öppna cirklar) (För jämförelse av tidig LTP inducerad av WTET se 20,33). De PRP fångas av den svagatetanization set tag behöver inte nödvändigtvis komma från STET-inducerade sent LTP, men kan också lämnas av SLFS-inducerade sent LTD. Denna typ av positiva associativa samverkan mellan LTP och LTD kallas "cross-märkning / capture". Den WTET-inducerad tidig LTP i S1 blir förstärkt sent-LTP (figur 3C, ofyllda cirklar) genom att fånga de PRP tillhandahålls av SLFS-inducerade sen LTD i S2 (Figur 3C, fyllda cirklar). Statistiskt signifikant potentiering eller depression bibehölls i S1 och S2 i båda fallen i jämförelse med sin egen baslinje (Wilcoxon test, P <0,05).
För taggen-PRP interaktion förekomma, (svag-före-stark / stark-före-svag) är inte avgörande så länge den tidsmässiga ordningen för de två händelserna som tidsfönstret mellan de två händelserna förblir inom området av från 30 till 60 minuter. Det vore klokt att ta en tredje, oberoende men överlappande synaptic isätta och använda den som en baslinje kontroll för att övervaka stabiliteten i inspelningar. De elektriska stimuleringsprotokoll som används för att framkalla tidiga och sena former av LTP / LTD måste valideras i enkelingångs experiment för konsekvens och tillförlitlighet innan du använder dem i STC experiment. Vi vill också betona vikten av slice förberedelse metoder som beskrivs i protokollet, eftersom framgången för dessa experiment är starkt beroende av kvaliteten på skivorna.
Figur 1. (A) Verktyg som används vid dissekering av hippocampus: (a) Bandage sax (b) Iris sax (c) Bone rongeur (d) Tunn spatel, (e) Skalpell nummer 11 (f) Sickle scaler (g) Mjuk -bristle pensel (h) Plast pasteurpipett (i) filterpapper (85mm) (j) filterpapper (30mm) (k) Glas bägare (l) Aluminium kylning block för att passa petriskål och bägare(m) petriskål. (B) Manuell vävnads chopper. (a) Platform (b) Skär arm med bladhållaren (c) Vernier mikrometer, upplösning 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Elektrofysiologi installation för fältpotential inspelningar som består av (A) stimulatorer (b) en differentialförstärkare (c) en analog-till-digital-omvandlare (d) oscilloskop (e) dator med förvärv programvara (f) Vibrations- resistent bords (g) mikroskop med> 4x förstoring (h) gränssnitt hjärn munstyckskammaren (i) ett perfusion system för ACSF och carbogen försörjning (j) temperaturreglering (k) en belysningskälla (l) manipulatorer med elektrodhållare. (B) Gränssnitt hjärna-slicekammare. (C) & (D) hippocampus skivor i gränssnittet kammaren. (E) Rostfritt stål elektroden förseglas i en glaskapillär. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. (A) Schematisk representation av en tvärgående hippocampus skiva och elektrod läge för fältpotential inspelning: I denna representation är två stimulerande elektroder (S1 och S2) som är placerad i stratum radiatum av CA1-regionen för att stimulera två oberoende men överlappande synaptiska ingångar PÅ CA1 pyramidala nervceller. Två extracellulära inspelning elektroder, en för att spela in fält EPSP (excitatoriska postsynaptiska potentialen) från den apikala dendritiska facket och en annan att spela somatisk befolkningen spik från pyramidcellorgan, finns i stratum radiatum och stratum pyramidale respektive. CA1- cornu Ammonis region 1, CA3- Cornu Ammonis region 3, DG- gyrus gyrus, SC- Schaffer säkerheter fibrer, S1- stimulerande elektrod 1, S2-stimulerande elektrod 2. (B) Svag innan stark paradigm för att studera STC: Svag tetanization (WTET) appliceras till S1 (ofyllda cirklar) för att inducera tidig-LTP följt av stark tetanization (STET) av S2 (fyllda cirklar) vid 30 min för att inducera sent-LTP. Den tidiga-LTP i S1 blir förstärkt sent-LTP visar märkning och fånga interaktion (n = 6) (C) Svag innan stark paradigm för att studera kors märkning. Tidig LTP induceras av WTET i S1 (öppna cirklar) följt genom induktion av sent-LTD i S2 (fyllda cirklar) med användning SLFS efter 30 minuter. I S1 är tidig LTP transformeras till sent LTP varar 6 h visar kors märkning och fånga (n = 6). Single pilen representerar svag tetanization tillämpas för att inducera tidig LTP. Triplett av pilar representerarstark tetanization för inducering sent-LTP. Den brutna pilen representerar tidpunkt vid vilken SLFS applicerades på den representativa synaptiska ingång för att inducera sent LTD. Felstaplar visar SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Akut hippocampus skiva är ett utmärkt modellsystem för studier av LTP och andra funktionella plasticitet processer såsom STC och tvär capture. Det bevarar mycket av den laminära strukturella nätverk av hippocampus kretsar, ger en exakt elektrodplaceringar och erbjuder vid sidan, en öppen plattform för snabb neurofarmakologisk manipulering utan blod-hjärnbarriären.
I den här artikeln beskrivs metoden för framställning av livskraftiga akut hippocampus skivor från unga vuxna råttor och använda dem för att undersöka STC och kors märkning. Tidigare forskning har betonat att kön och ålder av djuren är viktiga faktorer att tänka på för användning i elektrofysiologiska studier. 27,28 Därför unga vuxna djur med fullt uttryckt vuxna receptorfunktioner (Wistar råttor åldern 5-7 veckor) används. 23 Vissa asymmetrier i anslutningarna mellan vänster och höger hippocampus har noterats hos gnagare 29 ochstora skillnader i NMDA-receptorexpression har rapporterats såväl 34. Vi har använt rätt hippocampus för att stämma överens med våra tidigare LTP studier. 23,32 emellertid något av hippocampi kan användas så länge som konsekvens upprätthålls.
Som i alla protokoll, är det mycket viktigt att utföra isolering och skivning förfaranden snabbt men noga med att vävnaden inte sträcks, skadad, gjorde torr eller hypoxisk. Variationerna i pH, temperatur och joniska sammansättningen av lösningarna kan ha djupgående effekt på livskraften hos skivorna och resultaten. Därför sådana variationer bör undvikas. Det har visat sig att glutamatreceptorberoende kalciumfrisättning inträffar under framställningsstegen irreversibelt kan påverka proteinsyntesen i nervvävnad 35,36, 37. Använda manuella vävnadsskärmaskiner kan hjälpa till att minimera detta genom att låta processen vara klar mycket snabbt jämfört med vibraslicers. Men många laboratorier också effektivt använda vibraslicers med nödvändiga försiktighetsåtgärder för att bevara slice livskraft. En annan viktig faktor att beakta är den långa inkubationstiden innan experimenten. Detta har uppmärksammats för att vara riktigt avgörande för att uppnå stabilitet i metabola statliga och kinasaktiveringsnivåerna i skivor efter störningen orsakade under beredning 23. Sådan stabilitet är nödvändig för konsekvens i långsiktiga inspelningar. Vi åter betona på denna observation och föreslå de långa inkubationstid timmar ca 3 tim.
En mängd olika stimuleringsparametrar är kända för att inducera LTP, men de molekylära mekanismerna framkallade i varje fall får inte vara samma (för översikt se 38). Detta kan påverka hållbarheten och andra egenskaper hos LTP som i sin tur kan påverka resultaten av synaptiska taggning och infångningsexperiment. Därför är det viktigt att validera stimulerings paradigm och egenskaperav den framkallade LTP enligt villkoren i den utförande laboratoriet och upprätthålla konsekvens.
Vi generellt inte anser experiment med mycket stora presynaptiska fiber volleys och med maximal fEPSPs mindre än 0,5 mV och experiment med stora förändringar i fiber volley under inspelningarna också avvisas. Vidare, när de utför två-pathway eller tre-pathway experiment, är det viktigt att se vägen oberoende. Detta kan utföras med en parade puls underlättande protokoll 28.
En nackdel av gränssnittsregistreringssystem är bildandet av kondenseringsdroppar på elektroderna under de långa inspelnings timmar på grund av temperaturskillnader och luftfuktighet mellan kammaren och omgivningen. Dessa droppar måste noga blottades då och då. Annars dropparna kan droppa på skivorna och orsaka störningar eller förlust av signaler. Vi tacklar brukar detta by skickligt läsk dropparna guidade under mikroskop med hjälp av en smal filterpapper veke, utan att vidröra elektroderna. Men skulle den bästa lösningen vara att använda ett centraliserat värmesystem, såsom ETC system utvecklat av University of Edinburgh forskare.
På en avslutande anmärkning, existerar en mängd olika metoder i laboratorier världen över, som används för framställning av hippocampus skivor för olika experimentella ändamål. Vart och ett av det förfarande erbjuder vissa fördelar över den andra. Man måste noggrant optimera små detaljer i protokollet för att passa syftet med försöket. Vi hoppas att denna artikel bidrar till att förbättra vissa aspekter av den metod för att studera sent associativa processer som STC och tvär capture.
Disclosures
Fri tillgång till denna video artikeln är sponsrad av Cerebos Pacific Limited.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Dissection Tools | |||
| 1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
| B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
| 2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
| BC100R | |||
| 3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
| 4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
| B-Braun/Aesculap, Germany | |||
| BB73 | |||
| 5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
| 6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
| 7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
| 8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
| II. ACSF component chemicals | |||
| 1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| 4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| 5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| 6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| III. Electrophysiology Instruments | |||
| 1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
| 2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
| 3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
| 4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
| 5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
| 6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
| 7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
| 8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
| 9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
| 10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
| 11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
| 00-42-102-0000 (MM-32) |
References
- Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
- Siegelbaum, S. A., Kandel, E. R. Learning-related synaptic plasticity: LTP and LTD. Current Opinion in Neurobiology. 1, 113-120 (1991).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual review of neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: An Embarrassment of Riches. Neuron. 44, 5-21 (2004).
- Krug, M., Lossner, B., Ott, T. Anisomycin blocks the late phase of long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats. Brain research bulletin. 13, 39-42 (1984).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin blocks an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain research. 452, 57-65 (1988).
- Otani, S., Marshall, C. J., Tate, W. P., Goddard, G. V., Abraham, W. C. Maintenance of long-term potentiation in rat dentate gyrus requires protein synthesis but not messenger RNA synthesis immediately post-tetanization. Neuroscience. 28, 519-526 (1989).
- Frey, U., Frey, S., Schollmeier, F., Krug, M. Influence of actinomycin D, a RNA synthesis inhibitor, on long-term potentiation in rat hippocampal neurons in vivo and in vitro. The Journal of physiology. 490 (3), 703-711 (1996).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. A macromolecular synthesis-dependent late phase of long-term potentiation requiring cAMP in the medial perforant pathway of rat hippocampal slices). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 3189-3198 (1996).
- Manahan-Vaughan, D., Kulla, A., Frey, J. U. Requirement of translation but not transcription for the maintenance of long-term depression in the CA1 region of freely moving rats. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 8572-8576 (2000).
- Frey, U., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385, 533-536 (1997).
- Frey, U., Morris, R. G. Weak before strong: dissociating synaptic tagging and plasticity-factor accounts of late-LTP. Neuropharmacology. 37, 545-552 (1998).
- Redondo, R. L., Morris, R. G. Making memories last: the synaptic tagging and capture hypothesis. Nature reviews. Neuroscience. 12, 17-30 (2011).
- Martin, K. C., Kosik, K. S. Synaptic tagging -- who's it? Nature reviews. Neuroscience. 3, 813-820 (2002).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging: implications for late maintenance of hippocampal long-term potentiation. Trends in neurosciences. 21, 181-188 (1998).
- Martin, K. C. Synaptic tagging during synapse-specific long-term facilitation of Aplysia sensory-motor neurons. Neurobiology of learning and memory. 78, 489-497 (2002).
- Shires, K. L., Da Silva, B. M., Hawthorne, J. P., Morris, R. G., Martin, S. J. Synaptic tagging and capture in the living rat. Nature communications. 3, (2012).
- Ramachandran, B., Frey, J. U. Interfering with the actin network and its effect on long-term potentiation and synaptic tagging in hippocampal CA1 neurons in slices in vitro. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12167-12173 (2009).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Identification of compartment- and process-specific molecules required for 'synaptic tagging' during long-term potentiation and long-term depression in hippocampal CA1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 5068-5080 (2007).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Sacktor, T. C., Frey, J. U. Synaptic tagging and cross-tagging: the role of protein kinase Mzeta in maintaining long-term potentiation but not long-term depression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 5750-5756 (2005).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic Tagging and Capture: Differential Role of Distinct Calcium/Calmodulin Kinases in Protein Synthesis-Dependent Long-Term Potentiation. The Journal of Neuroscience. 30, 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Frey, J. U. Late-associativity, synaptic tagging, and the role of dopamine during LTP and LTD. Neurobiology of learning and memory. 82, 12-25 (2004).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Current Opinion in Neurobiology. 15, 607-613 (2005).
- Villers, A., Ris, L. Improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Pohle, W., Reymann, K., Jork, R., Malisch, R. The influence of experimental conditions on the morphological preservation of hippocampal slices in vitro. Biomedica biochimica acta. 45, 1145-1152 (1985).
- Reymann, K. G., et al. The duration of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampal slice preparation. Brain research bulletin. 15, 249-255 (1985).
- Sajikumar, S., Korte, M. Different compartments of apical CA1 dendrites have different plasticity thresholds for expressing synaptic tagging and capture. Learning & Memory. 18, 327-331 (2011).
- Li, Q., et al. Making Synapses Strong: Metaplasticity Prolongs Associativity of Long-Term Memory by Switching Synaptic Tag Mechanisms. Cerebral Cortex. 24, 353-363 (2014).
- Sajikumar, S., Frey, J. U. Anisomycin inhibits the late maintenance of long-term depression in rat hippocampal slices in vitro. Neuroscience Letters. 338, 147-150 (2003).
- Ishikawa, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Diversity of neuropsin (KLK8)-dependent synaptic associativity in the hippocampal pyramidal neuron. The Journal of physiology. 589, 3559-3573 (2011).
- Ishikawa, Y., Horii, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Neuropsin (KLK8)-dependent and -independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 843-849 (2008).
- Sajikumar, S., Morris, R. G. M., Korte, M. Competition between recently potentiated synaptic inputs reveals a winner-take-all phase of synaptic tagging and capture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 12217-12221 (2014).
- Navakkode, S., Sajikumar, S., Frey, J. U. The type IV-specific phosphodiesterase inhibitor rolipram and its effect on hippocampal long-term potentiation and synaptic tagging. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 7740-7744 (2004).
- Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nature. 14, 1413-1415 (2011).
- Frey, U., Huang, Y. Y., Kandel, E. R. Effects of cAMP Simulate a Late Stage of LTP in Hippocampal CA1 Neurons. Science. 260, 1661-1664 (1993).
- Erdogdu, G., Uto, A., Hossmann, K. -A. The effect of global ischemia and recirculation of rat brain on protein synthesis in vitro. Metab Brain Dis. 8, 199-206 (1993).
- Djuricic, B., Berger, R., Paschen, W. Protein synthesis and energy metabolism in hippocampal slices during extended (24 hours) recovery following different periods of ischemia. Metab Brain Dis. 9, 377-389 (1994).
- Park, P., et al. NMDA receptor-dependent long-term potentiation comprises a family of temporally overlapping forms of synaptic plasticity that are induced by different patterns of stimulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369, 20130131 (2014).
