Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים.
1. עכבר הכנה
- השתמש בעכברים על ~ 20 גרם במשקל גוף או מעל ~ 6 שבועות בגיל לניתוח.
- לפני הניתוח, לתת עכברים כרצונך אוכל ומי מודעת מעבדה ולשמור על מחזור אור-חושך 00:12 שעות.
- לגלח את אזור הניתוח עם גוזז שיער. להרדים עכברים בזריקת intraperitoneal של 80 מ"ג / קילוגרם קטמין ומ"ג 12 / קילוגרם xylazine. מינון זה מעמיד את העכברים לתוך שינה בכמה דקות ומספק הרדמה מספיק לניתוחים הבאים.
- לאשר הרדמה נכונה המבוססת על היעדר רפלקס קרנית והכחשת איבר כאשר שודדים הוא צבט. החל הסיכה משחה עיניים על עיניים כדי למנוע יובש.
- לעקר עור עם פתרון בבטאדין.
2. קיבה Reflux דגם (איור 1)
- הפוך עליוןחתך קו האמצע של ~ 2 סנטימטר החל מxiphoid מצביע על פי הטבעת.
- פתח את חלל הבטן דרך קו האמצע. הסר את xiphoid כדי לשפר את החשיפה עם זוג מספריים.
- נפרד ולחתוך את רקמות חיבור בין הכבד והקיבה. לקשור ולחתוך את חבילת הכלי בין הטחול וקרקעית העין כדי בחינם לגמרי קרקעית העין.
- הפעל קרקעית העין מעט שמאלה ולחשוף את צד השמאל של צומת גסטרו בתחום. לעשות חתך אורכי 5 מ"מ על השריר לאורך הוושט הדיסטלי באמצעות מספריים חדים לחשוף את האפיתל.
- גזור לפתוח את האפיתל לאורך אותו הכיוון (חתך 1, איור 1). הפוך שלושה חתכים בforestomach (חתך 2, 3 ו -4, איור 1) לחתוך את רוב forestomach עם מספריים הפעלה חדים. אם הבטן אינה ריקה, להסיר בזהירות את תוכן קיבה.
- הנח sutu 8-0 proleneמחדש (עם נקודה להתחדד מחט) דרך נקודה (בוושט) ונקודה "(על forestomach) עם רירית מדויקת לרירית אופוזיציה. כמו כן תפרי מקום דרך נקודת B ונקודה ב ', וזוגות אחרים של נקודות, בהתאמה. באופן שווה בחלל תפרים אלה 3-4 מ"מ אחד מהשני.
- שטוף את חלל הבטן עם מלח רגיל לנקות דם ותוכן קיבה. סגור את דופן בטן עם תפרי משי ועור עם קליפים מתכת.
3. Reflux דגם מעורב (איור 1 ג)
- בצע את השלבים 2.1-2.4 לחשוף את צומת גסטרו.
- בעדינות להפריד את צד הגב של הוושט מכלי הדם מאחורי הוושט. לעבור קצה כותנה קטן בין כלי הוושט ודם.
הערה: הכותנה ניתן להסיר באופן חלקי מהקצה כדי להקטין את הגודל שלה. טיפ כותנה זה משרת שתי מטרות, מרים את הוושט והגנה על כלי הדם. - הפוך Inc שני 5 מ"מ האורךisions כל בצומת גסטרו והקצה הפרוקסימלי של התריסריון הסמוך לשוער עם מספריים הפעלה חדים. לחתך בתריסריון, להימנע מכלי דם ולהציב בגבול נגד mesenteric.
- Anastomose החתכים עם רירית מדויקת לרירית אופוזיציה עם 8-0 תפרי Prolene שהופסקו. בדרך כלל למקם 3-4 תפרים בצד הגב ו2-3 תפרים בצד הקדמי.
- הסר את קצה הכותנה. שטוף את חלל הבטן עם מלח רגיל ולסגור את דופן הבטן והעור.
4. התריסריון Reflux דגם (1D איור)
- עקוב צעד 3.1-3.4 ליצור מעורב ריפלוקס.
- בזהירות להרים את הבטן לחשוף הצד האחורי שלה. אונה של הכבד עלולה להיתפס על ידי רקמות חיבור בין הכבד והחלק האחורי של הבטן. בזהירות לחתוך רקמות חיבור, כראוי להגן על הכבד, ולחשוף את כלי הדם בצד הגב של הוושט.
- ולקשורלחתוך את כלי הדם. לקשור ולחתוך את הוושט בצומת גסטרו.
- לקשור את תריסריון בשוער. לקשור ולחתוך את mesenterium. הסר את כל הבטן.
- שטוף את חלל הבטן עם מלח רגיל. סגור את דופן הבטן והעור.
טיפול 5. לאחר ניתוח
- לאחר הניתוח לשמור על טמפרטורת גוף עם כרית חימום. רק לאחר שהשיב את כיבה sternal, למקם את העכברים חזרה עם בעלי חיים אחרים.
- תן אנטיביוטיקה ומשככי כאבים כדי למנוע זיהום ולהקל על כאב. הזרק Baytril (10 מ"ג / קילוגרם, IP, QD, במשך 3 ימים) כדי למנוע זיהום, וhydrochloride עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם, SC, הצעה. במשך יומיים) כמשכך כאבים. הצום הוא לא הכרחי לאחר ניתוח.
דיאטה נוזלית או רכה עלולה להיות נתון. - להעריך את מצב בריאות הכללי בbasis.If היומי העכברים להראות הסימנים הבאים (הפסד דרמטי במשקל> 15%, חוסר האפליקציהetite, ניקוד, לפרוק מהפה, האף או עיניים, חווה כפופה, חוסר הפעילות, פעילות טיפוח חריגה), להרדים את העכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רוב העכברים (> 95%) יכולים לשרוד את הניתוח. בתקופה סביב הניתוח, סיבות מוות המובילות כוללות מנת יתר של חומרי הרדמה, דימום ומסיבות לא ידועות.
ארבעה שבועות לאחר ניתוח,> 90% עכברים עם ריפלוקס קיבה או מעורב ריפלוקס ו> 80 עכברי% עם ריפלוקס התריסריון יכולים לשרוד. במהלך תקופה זו, עכברים בעיקר מתים מצרות וחוסר היכולת לאכול בושט. עכברים אלה מראים סימנים של לחץ חמור (יציבה כפופה, חוסר פעילות, הקאות, עיניים שקועות, ניקוד, וכו ') וצריכים להיות מורדמים. טיפול רפואי באנטיביוטיקה ועירוי בדרך כלל לא יכול להציל את העכברים האלה ממוות. עכברים בדרך כלל לרדת במשקל גופם על ידי כמה גרם לאחר ניתוח, במיוחד אלו עם ריפלוקס התריסריון. עם זאת משקל גוף יתאושש ולהגדיל בהמשך.
ארבעים שבועות לאחר הניתוח,> עכברי 80% עם קיבה ומעורב ריפלוקס ו> 70 עכברי% עם ריפלוקס התריסריון יכולים לשרוד. During תקופה זו, כמה עכברים עלולים למות מתת תזונה או מסיבות לא ידועות. יש לנו כל הזמן עכברים 80 שבועות לאחר ניתוח. באופן כללי, הם עדיין די פעילים ובריאים 9.
בארבעה שבועות לאחר ניתוח, את הארכיטקטורה של האפיתל הוושט ייפגע פחות או יותר על ידי ריפלוקס. תחת מיקרוסקופ, האפיתל הופך עבה יותר וpapilla מתארכת. פרוליפרציה המוגברת של תאים וחדירה של תאים דלקתיים (למשל, נויטרופילים, תאי פיטום ואאוזינופילים) אפיתל הן סימנים ברורים של ושט (איור 2). ציטוקינים באפיתל הוושט (למשל, IL1β, IL6 וIL8) הם גבוהים במיוחד בנוכחות של ריפלוקס התריסריון 11. תחת מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, חלל אינטר מורחב משקף את ירידת הערך של תפקוד מחסום האפיתל 12. , התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל פונקציה-חכמה היא ירד באופן דרמטי, במיוחד בנוכחות duodenריפלוקס אל.
איור 1: (א) האנטומיה של מערכת העיכול העליונה בעכברים (מול נוף וצד נוף); (ב) ריפלוקס קיבה (מבט מצד); (ג) ריפלוקס מעורב (מול נוף); (ד) ריפלוקס התריסריון (מול נוף).
איור 2: היסטולוגיה של אפיתל הוושט העכבר ללא ריפלוקס (), או עם ריפלוקס קיבה (ב '), ריפלוקס המעורב (C), ריפלוקס התריסריון (ד'). בר סולם = 50 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דגמים ניתוחיים שונים הוקמו לחקות קיבה, התריסריון ומעורב ריפלוקס במכרסמים. שלושת נהלים אלה שתוארו כאן הם מתאימים לניסוי ארוך טווח עם מחירים סבירים של הישרדות לאחר ניתוח. חוקר עם ניסיון ניתוחי צריך להיות מסוגל לתפוס את הטכניקה לאחר תקופה קצרה של תרגול.
דימום יכול לנבוע מזריקת intraperitoneal של הרדמה לפני הניתוח, חתך של הכבד בהפרדה של רקמות חיבור בין הכבד והקיבה, והנזק מכוון של כלי הדם. זו יש להימנע ככל האפשר. מיני-כויה הפועלת על סוללות ניתן להשתמש כדי לעצור את הדימום אם מתאים. מוגזם יש להימנע מתיחה הרבה ככל האפשר כאשר איברים ורקמות הם המניפולציה. הטיפים של פינצטה יכולים להיות עטופים בצמר גפן, או טיפים כותנה ניתן להשתמש כמו מקלות אכילה להחליף פינצטה. יש וושט העכבר שתי שכבות או שתיים & #8220; צינורות ", אדמדם חיצוני" צינור שרירים "ופנימי לבנבן" צינור אפיתל ". כאשר חתך נעשה בוושט, שתי השכבות צריכה לחתוך פתוח. תפרים צריכים להיות מחולק באופן שווה עם רירית מדויקת לרירית אופוזיציה. דליפה עלולה לגרום ממרחק גדול בין התפרים, ואילו צרות עלולות להתפתח בשל מרחק צר בין התפרים. עם זאת, צרות עלולות לחסום את המעבר של מזון ולגרום למוות לאחר ניתוח, ואילו דליפה קלה עשויה להיות קבועה על ידי הדבקה מקומית ותגובת fibrotic וכך היא בדרך כלל לא סכנת חיים.
ישנם מספר עקרונות ביקורתי כלליים לעקוב בפרוטוקול. משך הניתוח צריך להתקצר אם אפשר (כ 20-30 דקות במעבדה). צום לפני ואחרי הניתוח הוא מיותר. למעשה, צום ממושך (> יום 1) עשוי להיות מזיק. ניתוח מבוצע על ידי מנתח הטוב ביותר אחד. עוזר עשוי לעזור להרדים את העכברים ולספק Surgחומרי iCal. מיקרוסקופ אין צורך אלא אם המנתח הוכשר כראוי במייקרו. אחרת משך הניתוח נוטה להיות ארוך יותר מהישרדות הכרחית ובכך שלאחר ניתוח עשויה להיות גרועה יותר פוטנציאל.
נהלים אלה היו בשימוש בפרסומים קודמים ויצרו תוצאות משביעות רצון. שימוש בפרא-סוג ועכברים מהונדסים גנטי, שהוכחנו כי מסלולי NFκB וNrf2 מוסדרים תפקוד המחסום של אפיתל הוושט במהלך רפלוקס גסטרו 11,12. עם זאת, לא היינו מסוגלים לייצר והשט בארט במלוא מובן המילה או אדנוקרצינומה בעכברים אלה, במקום, פזורים תאים ריריים וקרצינומה של תאי קשקש היו מושרה 9. הבדלים בין היסטולוגית וושט עכבר והוושט אדם עשויים להיות המגבלות המובנות של דגמים ניתוחיים אלה במחקר על אדנוקרצינומה הוושט והוושט של בארט.
אנו מאמינים su אלההמודלים rgical שימושיים למחקרים על GERD. פונקציות של גנים ומסלולים מולקולריים אפשר לבאר להבין את המנגנונים המולקולריים של GERD ולפתח טיפול המבוסס על מנגנון. כאשר נעשה שימוש לייצור אדנוקרצינומה הוושט והוושט של בארט, שינויים גנטיים יהיו צורך בשילוב עם ניתוח ריפלוקס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
