Protocol
全ての動物実験は、施設内動物管理使用委員会により承認されています。
1.マウスの準備
- 体重や手術の時代に〜6週間以上〜20グラムの上にマウスを使用してください。
- 手術前に、マウスを実験用固形飼料および水を自由に与え、12時12分時間の明暗サイクルで維持しています。
- バリカンで手術領域を剃ります。 80ミリグラム/ kgのケタミンおよび12 mgの/ kgのキシラジンの腹腔内注射によりマウスを麻酔。この用量は、数分で眠りにマウスを置くと、次の外科的処置のための十分な麻酔を提供します。
- フットパッドが挟まれたときに角膜反射と四肢後退の欠如に基づいて、適切な麻酔を確認してください。乾燥を防ぐために、目に眼軟膏を潤滑に適用します。
- ベタジン溶液で皮膚を滅菌します。
2.胃逆流モデル（図1B）
- アッパーを作ります肛門を指して剣状突起から始まる1〜2センチ正中切開。
- 正中線を通って腹腔を開きます。ハサミで露出を高めるために、剣状突起を外します。
- セパレート、肝臓と胃の間の結合組織をカット。眼底まで完全に解放するために脾臓および眼底間の維管束を連結し、カット。
- 少し左に眼底を回し、フィールドに胃食道接合部の左側を公開します。上皮を公開するために、鋭いハサミを使用して遠位食道に沿って筋肉の5ミリメートル縦切開を行います。
- 同じ方向（切開1、 図1B）に沿って上皮を開いてカットします。シャープな操作ハサミで胃のほとんどを遮断するために胃（切開2、図3、図4、 図1B）の3つの切開を行います。胃が空でない場合は、慎重に胃内容物を除去します。
- 8-0プロレンスツ語を配置再正確な粘膜とポイントを介して（胃の）（食道上）と点A '（テーパ点針で）反対粘膜します。同様に、それぞれ、点Bと点B 'を介して縫合糸を配置し、ポイントの他のペア。均等にスペースこれらの縫合糸互いに3〜4ミリメートル。
- 血液や胃内容物をクリーンアップするために生理食塩水で腹腔を洗浄します。絹縫合糸で腹壁と金属製のクリップで皮膚を閉じます。
3.混合還流モデル（図1C）
- フォローは胃食道接合部を露出させるために2.4から2.1を繰り返します。
- ゆっくり食道の後ろの血管から食道の背側を分離します。食道と血管との間の小さな綿棒を渡します。
注：コットンは、部分的にそのサイズを減少させるためにチップから除去することができます。これは綿の先端が食道を持ち上げ、血管を保護し、2つの目的があります。 - 2 5ミリメートル縦株式会社を作ります胃食道接合部とシャープな操作ハサミで幽門に隣接する十二指腸の近位端にisionsそれぞれ。十二指腸の切開は、血管を避け、抗腸間膜の国境に配置します。
- 中断8-0プロレン縫合糸で反対粘膜ために正確な粘膜に切開を吻合。通常前面に背側の3-4縫合糸および2-3縫合糸を配置します。
- 綿棒を削除します。通常の生理食塩水で腹腔を洗浄し、腹壁と皮膚を閉じます。
4.十二指腸還流モデル（図1D）
- 混合逆流を生成するために、3.4から3.1のステップに従ってください。
- 慎重にその裏面を露出させるために胃を持ち上げます。肝臓の葉は、肝臓と胃の背面との間に結合組織によって捕捉することができます。慎重に結合組織をカットし、適切に肝臓を保護し、食道の背側の血管を露出させます。
- で連結され、血管を切りました。胃食道接合部で食道を連結し、カット。
- 幽門で十二指腸を結紮。腸間膜を連結し、カット。胃全体を削除します。
- 通常の生理食塩水で腹腔を洗浄します。腹壁および皮膚を閉じます。
5.後の外科的治療
- 手術後に加熱パッドで体温を維持。のみ胸骨横臥位を取り戻した後、他の動物とバックマウスを置きます。
- 感染を予防し、痛みを緩和するための抗生物質や鎮痛剤を与えます。鎮痛剤としての感染を予防するバイトリル（3日間の10mg / kg、腹腔内、QD）、及びブプレノルフィン塩酸塩（0.05ミリグラム/ kg、皮下、入札 。2日間）を注入します。断食は、手術後の必要はありません。
液体またはソフト食事を与えられてもよいです。 - 毎日basis.Ifの一般的な健康状態を評価するマウスは、以下の兆候（劇的な体重減少> 15％、アプリの欠如を示しますetite、発声、口、鼻や目からの排出、猫背ジェスチャー、非アクティブ、異常なグルーミング活性）、マウスを安楽死させます。
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Representative Results
ほとんどのマウス（> 95％）が手術に耐えることができます。周術期の期間中、死亡の主要な原因は、麻酔薬の過剰摂取、出血および未知の理由があります。
手術後4週間は、>十二指腸逆流と胃逆流または混合逆流および> 80％のマウスを用いた90％のマウスが生存することができます。この期間中、マウスは主に食道狭窄と食べることができないことで死にます。これらのマウスは、重度のストレス（猫背の姿勢、非アクティブ、嘔吐、くぼんだ目、発声など ）の兆候を示し、安楽死させる必要があります。通常、抗生物質や点滴での医療処置が死んでから、これらのマウスを保存することはできません。マウスは通常、手術後グラムのカップルが十二指腸逆流と特にを自分の体重を失います。それにも関わらず体重が回復すると、後に増加します。
フォーティ週間手術後、十二指腸逆流と胃と混合逆流および> 70％のマウスと> 80％のマウスが生存することができます。長調この期間をる、いくつかのマウスは、栄養不良または未知の理由で死ぬことがあります。私たちは、手術後80週間のマウスを保持しています。一般的に、彼らはまだ非常にアクティブで、9健康です。
手術後4週目に、食道上皮のアーキテクチャを還流することにより、多かれ少なかれを損傷します。顕微鏡下で、上皮が厚くなり、乳頭が長くなります。上皮細胞および炎症性細胞（例えば、好中球、マスト細胞および好酸球）の浸潤の過剰増殖は、（ 図2）食道炎の明らかな兆候です。食道上皮（例えば、IL1β、IL6およびIL8）でのサイトカインは、特に十二指腸逆流11の存在下で上昇しています。透過型電子顕微鏡の下で、拡張間隙は、上皮バリア機能12の障害を反映しています。機能面では、経上皮電気抵抗は特にduodenの存在下で、劇的に減少しますアル逆流。
図1：（A）マウス（正面図と側面図）で、上部消化管の解剖学; （B）胃逆流（側面図）。 （C）混合逆流（正面図）。 （D）十二指腸逆流（正面図）。
図2：還流なしマウス食道上皮の組織学（A）、又は胃逆流（B）、混合還流（C）、十二指腸の逆流（D）を有します。 =50μmのスケールバー。
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Discussion
様々な外科モデルは、げっ歯類で胃、十二指腸および混合逆流を模倣するために設立されました。ここに述べた3つの手順は、術後生存のリーズナブルな料金との長期的な実験に適しています。手術経験を持つ研究者は練習の短い期間の後に技術を把握することができるはずです。
出血は、手術前に麻酔薬の腹腔内注射から肝臓、胃、および血管の偶発的な損害との間に結合組織の分離の間、肝臓の裂傷を生じる可能性があります。これは可能な限り避けるべきです。バッテリ駆動のミニ焼灼は、適切な場合に出血を止めるために使用されてもよいです。器官および組織が操作されたときに過度の延伸は可能な限り避けるべきです。ピンセットの先端が綿で包まれてもよく、または綿のヒントは、ピンセットを交換するために箸のように使用することができます。マウスの食道は、2層または2＆＃を持っています8220;チューブ」、外側の赤みを帯びた「筋肉チューブ」と内側白っぽい「上皮チューブ」。切開が食道に行われると、両方の層を切開する必要があります。縫合糸は均等に反対粘膜ために正確な粘膜に間隔を置いて配置する必要があります。狭窄は、縫合糸の間の狭い距離に起因し開発することができるのに対し、漏れは、縫合糸の間に大きな距離から生じ得ます。しかし、狭窄は、食物の通過を阻止することができ、わずかな漏れが地元密着性および線維形成反応により固定することができるのに対し、術後死を引き起こし、したがって、通常は生命を脅かすではありません。
プロトコル内従うべきいくつかの批判一般的な原則があります。 （実験室で約20〜30分）、可能であれば手術の所要時間を短縮する必要があります。手術前と後の断食は不要です。実際には、長期の断食（> 1日）は、有害である可能性があります。手術は最良の外科医によって行われています。アシスタントは、マウスを麻酔し、外科を供給助けることができますiCalの材料。外科医が適切にマイクロサージェリーに訓練されていない限り、顕微鏡は必要ありません。そうでなければ手術の持続時間が必要以上に長くなる傾向があり、従って、術後の生存を潜在的に悪化することがあります。
これらの手順は、以前の刊行物に使用されており、良好な結果を生成しました。野生型および遺伝子改変マウスを用いて、NFκBとのNrf2経路は胃食道逆流11,12の間に食道上皮のバリア機能を調節していることを実証しました。しかし、我々はその代わりに、散在粘液細胞と扁平上皮癌が9誘導された、これらのマウスにおける本格バレット食道または腺癌を生成することができませんでした。マウスの食道と人間の食道の間に組織学的な違いは、バレット食道と食道腺癌の研究で、これらの外科手術用のモデルの固有の制限であってもよいです。
我々は、これらのsuを信じてrgicalモデルは逆流性食道炎の研究に有用です。遺伝子および分子経路の機能は、GERDの分子機構を理解し、機構に基づく治療を開発するために明らかにすることができます。バレット食道および食道腺癌を製造するために使用される場合、遺伝子改変は、逆流手術と組み合わせて必要とされます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
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