Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Mouse Voorbereiding
- Gebruik muizen meer dan ~ 20 g lichaamsgewicht of hoger ~ 6 weken in leeftijd voor een operatie.
- Voor de operatie, geeft muizen een laboratorium chow en water ad libitum en op een 00:12 uur licht-donker cyclus te handhaven.
- Scheer de chirurgische gebied met een tondeuse. Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van 80 mg / kg ketamine en 12 mg / kg xylazine. Deze dosis zet muizen in slaap in een paar minuten en biedt voldoende verdoving voor de volgende chirurgische procedures.
- Bevestig juiste verdoving op basis van de afwezigheid van de cornea reflex en ledematen intrekken wanneer de voetzool wordt geknepen. Breng smerende oogzalf op de ogen tot droog voorkomen.
- Steriliseren huid met betadine oplossing.
2. maagreflux Model (Figuur 1B)
- Maak een bovenstemiddellijn incisie van ~ 2 cm vanaf de xiphoid wijst naar de anus.
- Openstellen van de buikholte door de middellijn. Verwijder de zwaardvormig blootstelling met een schaar verbeteren.
- Apart en snijd het bindweefsel tussen de lever en de maag. Afbinden en snijd het schip bundel tussen de milt en de fundus om volledig vrij van de fundus.
- Draai de fundus iets naar links en links van de gastro-oesofageale overgang bloot in het veld. Wordt 5 mm longitudinale incisie op de spier langs de distale slokdarm met een scherpe schaar het epitheel bloot.
- Opengesneden de epitheel langs dezelfde richting (incisie 1, Figuur 1B). Maak drie insnijdingen aan de voormaag (insnijding 2, 3 en 4, figuur 1B) om de meeste van de voormaag af met scherpe werkende schaar. Als de maag niet leeg is, voorzichtig maaginhoud te verwijderen.
- Plaats een 8-0 prolene Suture (met een spitse punt naald) door middel van een punt (op de slokdarm) en Point een '(op de voormaag) met accurate mucosale oppositie mucosale. Eveneens plaats hechtingen door het punt B en punt B ', en andere paren van punten, respectievelijk. Gelijkmatig ruimte deze hechtingen 3-4 mm van elkaar.
- Was de buikholte met fysiologische zoutoplossing te ruimen bloed en maaginhoud. Sluit de buikwand met zijden hechtingen en de huid met metalen clips.
3. Mixed Reflux Model (figuur 1C)
- Volg de stappen 2.1 tot 2.4 op de gastro-oesofageale overgang bloot.
- Voorzichtig scheiden de dorsale zijde van de slokdarm van de bloedvaten achter de slokdarm. Passeren een klein wattenstaafje tussen de slokdarm en de bloedvaten.
Opmerking: Katoen kan gedeeltelijk uit de top verwijderd worden om de omvang ervan te verminderen. Dit wattenstaafje dient twee doelen, het optillen van de slokdarm en de bloedvaten beschermen. - Maak twee 5 mm longitudinale incisions elk van de gastro-oesofageale overgang en het proximale uiteinde van duodenum naast de pylorus met scherpe werkende schaar. Voor de insnijding op het duodenum, te voorkomen bloedvaten en op de anti-mesenteriale grens.
- Anastomoseren de insnijdingen met accurate mucosale oppositie met onderbroken 8-0 Prolene hechtingen mucosale. Gewoonlijk plaats 3-4 hechtingen aan de rugzijde en 2-3 hechtingen aan de voorzijde.
- Verwijder het wattenstaafje. Was de buikholte met fysiologische zoutoplossing en sluit de buikwand en de huid.
4. Duodenal Reflux Model (figuur 1D)
- Volg stap 3,1-3,4 voor gemengde reflux genereren.
- Til de maag om zijn achterkant bloot. Een leverkwab kunnen onder bindweefsel tussen de lever en de achterkant van de maag. Snijden voorzichtig het bindweefsel, goed beschermen de lever en de bloedvaten aan de rugzijde van de slokdarm bloot.
- Ligeren ende bloedvaten snijden. Afbinden en snijd de slokdarm aan de gastro-oesofageale overgang.
- Afbinden het duodenum aan de pylorus. Afbinden en snijd de mesenterium. Verwijder het gehele maag.
- Was de buikholte met een normale zoutoplossing. Sluit de buikwand en de huid.
5. Post-chirurgische behandeling
- Na de operatie te handhaven lichaamstemperatuur met een verwarmingselement. Pas na het herwinnen borstligging, plaatst de muizen terug met andere dieren.
- Geef antibiotica en pijnstillende om infectie te voorkomen en verlichten de pijn. Injecteer Baytril (10 mg / kg, ip, qd, gedurende 3 dagen) om infectie te voorkomen en buprenorfine hydrochloride (0,05 mg / kg, sc, bid. Twee dagen) als pijnstiller. Vasten is niet nodig na de operatie.
Een vloeibare of zachte dieet kan worden. - Beoordelen van de algemene gezondheidstoestand van de dagelijkse basis.If de muizen tonen de volgende symptomen (dramatische gewichtsverlies> 15%, het ontbreken van appetite, stemgebruik, ontslag uit de mond, neus of ogen, gebogen gebaar, inactiviteit, abnormale verzorging activiteit), euthanaseren de muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De meeste muizen (> 95%) kan de operatie te overleven. Tijdens de perioperatieve periode, de belangrijkste doodsoorzaken onder overdosis verdovingsmiddelen, bloeden en onbekende redenen.
Vier weken na de operatie,> 90% muizen met maagreflux of gemengde reflux en> 80% muizen met duodenale reflux overleven. Tijdens deze periode, voornamelijk muizen sterven oesofageale vernauwing en het onvermogen om te eten. Deze muizen vertonen tekenen van ernstige stress (gebogen houding, inactiviteit, braken, ingevallen ogen, stemgebruik, enz.) En moeten worden gedood. Medische behandeling met antibiotica en infuus meestal niet deze muizen redden van het sterven. Muizen meestal hun lichaamsgewicht verliezen door enkele grammen na de operatie, vooral die met duodenale reflux. Toch zal het lichaamsgewicht te herstellen en te verhogen later.
Veertig weken na de operatie, kan> 80% muizen met maag- en gemengde reflux en> 70% muizen met duodenale reflux overleven. During deze periode kunnen sommige muizen sterven aan ondervoeding of onbekende redenen. We hebben muizen gedurende 80 weken na de operatie gehouden. In het algemeen zijn ze nog steeds vrij actief en gezond 9.
Bij vier weken na de operatie, de architectuur van esophagus epithelium min of meer bij reflux beschadigd. Onder de microscoop, het epitheel dikker en de papil verlengt. Hyperproliferatie van epitheelcellen en infiltratie van ontstekingscellen (bijvoorbeeld neutrofielen, mestcellen en eosinofielen) zijn duidelijke tekenen van oesofagitis (figuur 2). Cytokines in esophagus epithelium (bijv IL1β, IL6 en IL8) worden verhoogd bijzonder in aanwezigheid van ulcus reflux 11. Onder transmissie-elektronenmicroscoop, verwijde intercellulaire ruimte weerspiegelt de bijzondere waardevermindering van epitheliale barrièrefunctie 12. Function-wise, trans-epitheliale elektrische weerstand drastisch verminderd, vooral bij aanwezigheid van duodenal reflux.
Figuur 1: (A) Anatomie van het bovenste maagdarmkanaal bij muizen (vooraanzicht en zijaanzicht); (B) Gastric reflux (zijaanzicht); (C) gemengd reflux (vooraanzicht); (D) duodenale reflux (vooraanzicht).
Figuur 2: Histologie van muis esophagus epithelium zonder reflux (A), of maagreflux (B), gemengde reflux (C), duodenale reflux (D). Schaal bar = 50 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diverse chirurgische modellen zijn opgericht om maag, twaalfvingerige darm en gemengde reflux bij knaagdieren na te bootsen. Deze drie hier beschreven geschikt voor langdurige experimenten met redelijke prijzen postoperatieve overleving. Een onderzoeker met chirurgische ervaring moet in staat zijn de techniek begrijpen na een korte periode van gebruik.
Bloeden kan voortvloeien uit intraperitoneale injectie van anesthesie voor de operatie, scheuring van de lever tijdens scheiding van het bindweefsel tussen de lever en de maag en onbedoelde beschadiging van de bloedvaten. Dit moet zoveel mogelijk worden vermeden. Batterijgevoede mini-cauterisatie kunnen worden gebruikt om het bloeden te stoppen indien nodig. Overmatige stretching moet zoveel mogelijk worden vermeden wanneer organen en weefsels worden gemanipuleerd. De uiteinden van de pincet worden omwikkeld met watten of wattenstaafjes kunnen worden gebruikt als stokjes pincet vervangen. De muis slokdarm twee lagen of twee & #8220; buizen ", buitenste roodachtig" muscle tube "en innerlijke witachtige" epitheel tube ". Wanneer een incisie gemaakt aan de slokdarm, beide lagen worden opengesneden. Hechtingen wordt gelijkmatig verdeeld met accurate mucosale oppositie mucosale. Lekkage kan uit een grote afstand tussen de hechtingen, terwijl strictuur kan ontstaan door een smalle afstand tussen de hechtingen. Echter, kan de vernauwing doorgang van voedsel blokkeren en leiden tot postoperatieve dood, terwijl geringe lekkage door lokale adhesie en fibrotische reactie kan worden vastgesteld en derhalve gewoonlijk niet levensbedreigend.
Er zijn verschillende kritisch algemene principes te volgen binnen het protocol. De duur van de operatie moet indien mogelijk (ongeveer 20-30 min in het laboratorium) worden verkort. Vasten vóór en na de operatie overbodig. In feite, langdurig vasten (> 1 dag) kan schadelijk zijn. Chirurgie wordt het best uitgevoerd door een chirurg. Een assistent kan helpen verdoven de muizen en leveren surgiCal materialen. Een microscoop is niet nodig, tenzij de chirurg goed is opgeleid in microchirurgie. Anders de operatieduur meestal langer dan noodzakelijk en dus postoperatieve overleving potentieel erger kan zijn.
Deze procedures zijn gebruikt in eerdere publicaties en hebben bevredigende resultaten gegenereerd. Met behulp van wild-type en genetisch gemodificeerde muizen, hebben we aangetoond dat NFKB en Nrf2 paden gereguleerd de barrièrefunctie van esophagus epithelium bij gastro-oesofageale reflux 11,12. Echter, we waren niet in staat om full-blown slokdarm of adenocarcinoom Barrett's te produceren in deze muizen, in plaats daarvan, verspreid mucineus cellen en plaveiselcelcarcinoom werden geïnduceerd 9. Histologische verschillen tussen muizen slokdarm en menselijke slokdarm kan de inherente beperkingen van deze chirurgische modellen onderzoek slokdarm en slokdarmkanker adenocarcinoom Barrett's.
Wij geloven dat deze surgical modellen zijn nuttig voor onderzoek naar GERD. Functies van genen en moleculaire mechanismen kan worden toegelicht aan de moleculaire mechanismen van GERD te begrijpen en te ontwikkelen mechanisme gebaseerde therapie. Bij gebruik voor het produceren slokdarm en slokdarmkanker adenocarcinoom Barrett, zal genetische modificaties nodig in combinatie met reflux chirurgie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
