Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali e Usa Comitato Istituzionale.
1. Preparazione del mouse
- Utilizzare i mouse sopra ~ 20 g di peso corporeo o superiori a ~ 6 settimane di età per la chirurgia.
- Prima dell'intervento, dare topi un laboratorio chow e acqua ad libitum e mantenere su un ciclo luce-buio 00:12 h.
- Radere l'area chirurgica con un tagliatore di capelli. Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di 80 mg / kg di ketamina e 12 mg / kg xilazina. Questa dose mette topi nel sonno in pochi minuti e fornisce anestesia sufficienti per le seguenti procedure chirurgiche.
- Confermare anestesia corretta basata sull'assenza di riflesso corneale e l'incolumità fisica retrazione quando la zampa viene pizzicato. Applicare lubrificante pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Sterilizzare pelle con la soluzione betadine.
2. reflusso gastrico Model (Figura 1B)
- Fare un superioreincisione mediana di ~ 2 cm a partire dal xifoide indicando l'ano.
- Aprire la cavità addominale attraverso la linea mediana. Rimuovere la xifoideo per migliorare l'esposizione con un paio di forbici.
- Separare e tagliare il tessuto connettivo tra il fegato e lo stomaco. Legare e tagliare il fascio nave tra la milza e il fondo, al fine di liberare completamente il fondo.
- Ruotare il fondo leggermente a sinistra ed esporre il lato sinistro della giunzione gastroesofageo nel campo. Effettuare una incisione longitudinale 5 mm sul muscolo lungo l'esofago distale usando un paio di forbici affilate per esporre l'epitelio.
- Tagliare aprire l'epitelio lungo la stessa direzione (incisione 1, Figura 1B). Fare tre incisioni sulla il prestomaco (incisione 2, 3 e 4, Figura 1B) per tagliare più del prestomaco con le forbici operativi taglienti. Se lo stomaco non è vuoto, rimuovere con attenzione contenuto gastrico.
- Inserire un Sutu 8-0 prolenere (con un punto conico ago) per il punto A (in esofago) e un punto '(sulla il prestomaco) con una precisione di mucosa mucosa opposizione. Allo stesso modo luogo suture per il punto B e il punto B ', e altre coppie di punti, rispettivamente. Uniformemente spazio queste suture 3-4 mm l'una dall'altra.
- Lavare la cavità addominale con soluzione fisiologica per pulire sangue e contenuto gastrico. Chiudere la parete addominale con suture in seta e la pelle con clip metalliche.
3. Misto reflusso Modello (Figura 1C)
- Seguire i passaggi da 2.1 a 2.4 per esporre la giunzione gastroesofagea.
- Separare delicatamente il lato dorsale dell'esofago dai vasi sanguigni dietro l'esofago. Passare una piccola punta di cotone tra i vasi sanguigni e dell'esofago.
Nota: Il cotone può essere parzialmente rimosso dalla punta per ridurne le dimensioni. Questa punta di cotone due scopi, sollevando l'esofago e proteggere i vasi sanguigni. - Fai inc due 5 millimetri longitudinaleisions ciascuno sulla giunzione gastroesofageo e l'estremità prossimale del duodeno adiacente al piloro con le forbici operativi taglienti. Per l'incisione sul duodeno, evitare i vasi sanguigni e immettere sul confine anti-mesenterica.
- Anastomose le incisioni con mucosa preciso per mucosa opposizione con interrotti 8-0 punti di sutura Prolene. Solitamente posizionare 3-4 sutura sul lato dorsale e 2-3 suture sul lato anteriore.
- Rimuovere la punta di cotone. Lavare la cavità addominale con soluzione salina normale e chiudere la parete addominale e la pelle.
4. duodenale reflusso Modello (Figura 1D)
- Seguire il passaggio da 3.1 a 3.4 per generare reflusso misto.
- Sollevare delicatamente lo stomaco per esporre il suo lato posteriore. Un lobo del fegato può essere catturato da tessuto connettivo tra il fegato e la parte posteriore dello stomaco. Asportare accuratamente i tessuti connettivi, adeguatamente proteggere il fegato, ed esporre i vasi sanguigni sul lato dorsale dell 'esofago.
- Legare etagliare i vasi sanguigni. Legare e tagliare l'esofago all'incrocio gastroesofageo.
- Legare duodeno al piloro. Legare e tagliare il mesentere. Rimuovere l'intero stomaco.
- Lavare la cavità addominale con soluzione fisiologica. Chiudere la parete addominale e la pelle.
Il trattamento post-chirurgico 5.
- Dopo l'intervento chirurgico mantenere la temperatura corporea con una piastra elettrica. Solo dopo aver ripreso decubito sternale, posizionare il mouse posteriore con altri animali.
- Dare antibiotici e analgesici per prevenire l'infezione e alleviare il dolore. Iniettare Baytril (10 mg / kg, ip, qd, per 3 giorni) per prevenire l'infezione, e buprenorfina cloridrato (0,05 mg / kg, sc, offerta. Per due giorni) come antidolorifico. Il digiuno non è necessario dopo l'intervento chirurgico.
Una dieta liquida o morbido può essere dato. - Valutare lo stato di salute generale basis.If giornaliere topi mostrano i seguenti segni (drammatica perdita di peso> 15%, la mancanza di appetite, vocalizzazione, scaricare dalla bocca, il naso o gli occhi, gesto curvo, l'inattività, l'attività anormale grooming), l'eutanasia i topi.
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Representative Results
La maggior parte dei topi (> 95%) possono sopravvivere chirurgia. Durante il periodo perioperatorio, le principali cause di morte includono sovradosaggio di anestetici, sanguinamento e motivi sconosciuti.
Quattro settimane dopo l'intervento,> 90% topi con reflusso gastrico o reflusso misto e> 80% topi con reflusso duodeno possono sopravvivere. Durante questo periodo, i topi muoiono principalmente da stenosi esofagea e l'incapacità di mangiare. Questi topi mostrano segni di grave stress (postura ingobbita, inattività, vomito, occhi infossati, vocalizzazione, etc.) e devono essere eutanasia. Il trattamento medico con antibiotici e l'infusione di solito non è possibile salvare questi topi da morire. Topi solito perdono il loro peso corporeo per un paio di grammi dopo l'intervento chirurgico, in particolare quelli con reflusso duodeno. Tuttavia peso corporeo recuperare e aumentare in seguito.
Quaranta settimane dopo l'intervento,> 80% topi con reflusso gastrico e mista e> 70% topi con reflusso duodeno possono sopravvivere. Durzione di questo periodo, alcuni topi possono morire di malnutrizione o di motivi sconosciuti. Abbiamo mantenuto i topi per 80 settimane dopo l'intervento. In generale, sono ancora molto attivi e in buona salute 9.
A quattro settimane dopo l'intervento, l'architettura dell'epitelio esofageo verrà danneggiato più o meno da reflusso. Sotto il microscopio, l'epitelio diventa più spessa e la papilla allunga. Iperproliferazione delle cellule epiteliali e infiltrazione di cellule infiammatorie (ad esempio, neutrofili, eosinofili e mastociti) sono evidenti segni di esofagite (Figura 2). Citochine dell'epitelio esofageo (ad esempio, IL1β, IL6 e IL8) sono elevati soprattutto in presenza di reflusso duodeno 11. Sotto microscopio elettronico a trasmissione, dilatato spazio intercellulare riflette la compromissione della funzione di barriera epiteliale 12. Funzione-saggio, trans-epiteliale resistenza elettrica è drasticamente diminuita, soprattutto in presenza di duodenal reflusso.
Figura 1: (A) Anatomia del tratto digestivo superiore nei topi (vista frontale e laterale); (B) reflusso gastrico (vista laterale); (C) reflusso misto (vista frontale); (D) reflusso duodenale (vista frontale).
Figura 2: Istologia di topo dell'epitelio esofageo senza reflusso (A), o con reflusso gastrico (B), reflusso misto (C), reflusso duodeno (D). Barra di scala = 50 micron.
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Discussion
Vari modelli chirurgici sono stati stabiliti per imitare gastrica, duodenale e reflusso misto nei roditori. Queste tre procedure descritte sono adatte per esperimenti a lungo termine con tassi ragionevoli di sopravvivenza postoperatoria. Un ricercatore con esperienza chirurgica dovrebbe essere in grado di cogliere la tecnica, dopo un breve periodo di pratica.
Il sanguinamento può derivare da iniezione intraperitoneale di anestetici prima dell'intervento chirurgico, la lacerazione del fegato durante la separazione del tessuto connettivo tra il fegato e lo stomaco, e il danno accidentale dei vasi sanguigni. Questo dovrebbe essere evitato il più possibile. A batteria mini-cauterizzazione può essere utilizzato per fermare le emorragie, se del caso. Eccessivo allungamento deve essere evitato il più possibile quando organi e tessuti sono manipolati. Le punte delle pinzette possono essere confezionate con il cotone, o punte di cotone possono essere usati come le bacchette per sostituire le pinzette. L'esofago del mouse ha due strati o due & #8220; tubi ", rossastro esterno" tubo muscolare "e interiore biancastro" tubo epitelio ". Quando un'incisione è fatta sulla esofago, entrambi gli strati devono essere tagliate aperto. Le suture devono essere equamente distanziati con mucosa esatto mucosa opposizione. Perdita può derivare da un'ampia distanza tra i punti di sutura, mentre stenosi può sviluppare a causa di una distanza tra i punti di sutura stretto. Tuttavia, stenosi può bloccare il passaggio del cibo e causare la morte postoperatoria, mentre una leggera perdita può essere fissato di adesione locale e reazione fibrotica e quindi di solito non è pericolosa per la vita.
Ci sono diversi principi generali da seguire criticamente all'interno del protocollo. La durata della chirurgia dovrebbe essere ridotto se possibile (circa 20-30 minuti in laboratorio). Il digiuno, prima e dopo l'intervento chirurgico non è necessario. In realtà, digiuno prolungato (> 1 giorno) può essere dannoso. La chirurgia è meglio eseguita da un chirurgo. Un assistente può aiutare anestetizzare i topi e fornire surgmateriali iCal. Un microscopio non è necessaria a meno che il chirurgo sia stato correttamente addestrato in microchirurgia. Altrimenti la durata dell'intervento chirurgico tende ad essere più lungo di sopravvivenza necessario e quindi postoperatoria può essere potenzialmente peggiore.
Queste procedure sono state utilizzate in pubblicazioni precedenti e hanno prodotto risultati soddisfacenti. Utilizzando wild-type e topi geneticamente modificati, abbiamo dimostrato che NFκB e Nrf2 percorsi regolati la funzione di barriera della epitelio esofageo durante reflusso gastroesofageo 11,12. Tuttavia, non siamo stati in grado di produrre l'esofago di Barrett in piena regola o adenocarcinoma in questi topi, invece, dispersi cellule mucinosi e carcinoma a cellule squamose sono stati indotti 9. Differenze istologiche tra il mouse e l'esofago esofago umano possono essere i limiti intrinseci di questi modelli chirurgici nella ricerca sulle adenocarcinoma esofageo esofago e di Barrett.
Crediamo che questi sumodelli rgical sono utili per gli studi sulla malattia da reflusso gastroesofageo. Funzioni di geni e pathway molecolari possono essere chiarite per comprendere i meccanismi molecolari di GERD e sviluppare una terapia meccanismo basato. Quando viene utilizzato per la produzione di adenocarcinoma dell'esofago e dell'esofago di Barrett, saranno necessarie modifiche genetiche in combinazione con la chirurgia reflusso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
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