Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle.
1. Préparation de la souris
- Utilisez la souris sur ~ 20 g de poids corporel ou au-dessus ~ 6 semaines d'âge pour la chirurgie.
- Avant la chirurgie, les souris donner un chow et de l'eau ad libitum de laboratoire et de maintenir sur un cycle lumière-obscurité de 12:12 h.
- Rasez la zone chirurgicale avec une tondeuse à cheveux. Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de 80 mg / kg de kétamine et 12 mg / kg de xylazine. Cette dose met souris dans le sommeil en quelques minutes et fournit l'anesthésie suffisants pour les procédures chirurgicales suivantes.
- Confirmez anesthésie appropriée sur la base de l'absence du réflexe cornéen et des membres de rétraction lorsque le coussinet est pincé. Appliquer pommade ophtalmique lubrifiante sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
- Stériliser la peau avec une solution de bétadine.
2. reflux gastrique modèle (figure 1B)
- Faire une supérieureincision médiane de ~ 2 cm à partir de la pointe du sternum pointant vers l'anus.
- Ouvrez la cavité abdominale à travers la ligne médiane. Retirez la pointe du sternum pour améliorer l'exposition avec une paire de ciseaux.
- Indépendante et couper les tissus conjonctifs entre le foie et l'estomac. Ligaturer et couper le faisceau de navire entre la rate et le fond afin de libérer complètement le fond.
- Tourner le fond légèrement vers la gauche et exposer le côté gauche de la jonction gastro-œsophagienne dans le domaine. Faire une incision longitudinale de 5 mm sur le muscle le long de l'oesophage distal en utilisant une paire de ciseaux tranchants pour exposer l'épithélium.
- Couper l'épithélium ouvrir le long de la même direction (1 incision, figure 1B). Faire trois incisions sur le préestomac (incision 2, 3 et 4, figure 1B) pour couper la plupart du préestomac avec des ciseaux d'exploitation nettes. Si l'estomac est pas vide, retirez soigneusement le contenu gastrique.
- Placer une sutu 8-0 prolènere (avec une pointe effilée de l'aiguille) par le point A (sur l'œsophage) et le point A '(sur le préestomac) avec la muqueuse précise muqueuses opposition. De même endroit sutures par le point B et le point B ', et d'autres paires de points, respectivement. Ces sutures uniformément l'espace de 3 à 4 mm de l'autre.
- Laver la cavité abdominale avec du sérum physiologique pour nettoyer le sang et le contenu gastrique. Fermez la paroi abdominale avec des sutures de soie et de la peau avec des pinces métalliques.
3. Modèle mixte Reflux (figure 1C)
- Suivez les étapes 2.1 à 2.4 pour exposer la jonction gastro-oesophagien.
- Séparez délicatement la face dorsale de l'œsophage à partir des vaisseaux sanguins derrière l'œsophage. Passer une petite pointe de coton entre l'œsophage et les vaisseaux sanguins.
Remarque: Coton peut être partiellement retiré de la pointe pour réduire sa taille. Cette astuce de coton sert à deux fins, soulevant l'œsophage et de protéger les vaisseaux sanguins. - Assurez inc deux 5 mm longitudinalechaque isions sur la jonction gastro-œsophagienne et l'extrémité proximale du duodénum adjacent au pylore avec des ciseaux tranchants de fonctionnement. Pour l'incision sur le duodénum, éviter les vaisseaux sanguins et les placer sur le bord anti-mésentérique.
- Anastomoser les incisions avec la muqueuse précise muqueuses opposition interrompues 8-0 sutures Prolene. Habituellement placer des sutures 3-4 sur la face dorsale et 2-3 sutures sur la face avant.
- Retirer la pointe de coton. Laver la cavité abdominale avec une solution saline normale et fermer la paroi abdominale et la peau.
4. duodénal Reflux modèle (figure 1D)
- Suivez l'étape 3.1 à 3.4 pour générer reflux mixte.
- Soulevez délicatement l'estomac pour exposer sa face arrière. Un lobe du foie peut être capturé par les tissus conjonctifs entre le foie et l'arrière de l'estomac. Découpez soigneusement les tissus conjonctifs, bien protéger le foie, et d'exposer les vaisseaux sanguins sur la face dorsale de l'œsophage.
- Ligaturer etcouper les vaisseaux sanguins. Ligaturer et couper l'œsophage à la jonction gastro-oesophagien.
- Ligaturer le duodénum au pylore. Ligaturer et couper le mésentère. Retirer l'ensemble estomac.
- Laver la cavité abdominale avec du sérum physiologique. Fermez la paroi abdominale et la peau.
5. Le traitement post-opératoire
- Après la chirurgie maintenir la température corporelle d'un coussin chauffant. Seulement après avoir repris décubitus sternal, placez la souris de retour avec d'autres animaux.
- Donner des antibiotiques et des analgésiques pour prévenir l'infection et de soulager la douleur. Injecter Baytril (10 mg / kg, ip, qd, pendant 3 jours) pour prévenir l'infection, et la buprénorphine chlorhydrate (0,05 mg / kg, sc, offre. Pour deux jours) comme analgésique. Le jeûne est pas nécessaire après la chirurgie.
Une alimentation liquide ou molle peut être donné. - Évaluer l'état de santé général sur basis.If quotidiennes les souris montrent des signes suivants (de la perte dramatique de poids> 15%, le manque d'applicationetite, la vocalisation, décharger de la bouche, le nez ou les yeux, le geste voûté, l'inactivité, l'activité de toilettage anormale), euthanasier les souris.
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Representative Results
La plupart des souris (> 95%) peuvent survivre à la chirurgie. Au cours de la période périopératoire, les principales causes de décès comprennent surdose d'anesthésiques, des saignements et des raisons inconnues.
Quatre semaines après la chirurgie,> 90% des souris souffrant de reflux gastrique ou de reflux mixte et> 80% des souris avec le reflux duodénal peuvent survivre. Pendant cette période, les souris meurent de sténose de l'œsophage et de l'incapacité de manger principalement. Ces souris montrent des signes de stress sévère (posture voûtée, l'inactivité, des vomissements, des yeux enfoncés, la vocalisation, etc.) et doivent être euthanasiés. Le traitement médical avec des antibiotiques et perfusion ne peut généralement pas sauver ces souris de mourir. Les souris perdent habituellement leur poids corporel par quelques grammes après la chirurgie, en particulier ceux avec reflux duodénal. Néanmoins poids corporel va récupérer et augmenter par la suite.
Quarante semaines après la chirurgie,> 80% de souris avec le reflux gastrique et mixte et> 70% des souris avec le reflux duodénal peuvent survivre. During cette période, certaines souris peuvent mourir de malnutrition ou des raisons inconnues. Nous avons gardé les souris pendant 80 semaines après la chirurgie. En général, ils sont encore très active et saine 9.
À quatre semaines après l'intervention, l'architecture d'épithélium d'oesophage sera plus ou moins endommagé par reflux. Sous microscope, l'épithélium devient plus épaisse et la papille allonge. Hyperprolifération des cellules épithéliales et infiltration de cellules inflammatoires (par exemple, les neutrophiles, les mastocytes et les éosinophiles) sont des signes évidents de l'oesophagite (figure 2). Cytokines dans épithélium oesophagien (par exemple, IL1β, IL6 et IL8) sont élevés en particulier en présence d'un reflux duodénal 11. Sous microscope électronique à transmission, espace intercellulaire dilaté reflète l'altération de la fonction de barrière épithéliale 12. Fonction à goutte, la résistance électrique trans-épithéliale est considérablement diminué, surtout en présence de duodenreflux al.
Figure 1: (A) Anatomie du tractus digestif supérieur chez les souris (vue de face et vue de côté); (B) le reflux gastrique (vue de côté); (C) de reflux mixte (vue de face); (D) de reflux duodénal (vue de face).
Figure 2: Histologie des souris sans reflux épithélium oesophagien (A), ou avec le reflux gastrique (B), le reflux mixte (C), reflux duodénal (D). La barre d'échelle = 50 um.
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Discussion
Différents modèles chirurgicales ont été créés pour imiter gastrique, duodénal et le reflux mixte chez les rongeurs. Ces trois procédures décrites ici sont appropriés pour des expériences à long terme avec des taux raisonnables de survie postopératoire. Un chercheur ayant une expérience chirurgicale devrait être en mesure de saisir la technique après une courte période de pratique.
Le saignement peut résulter de l'injection intraperitoneale d'anesthésiques avant une intervention chirurgicale, une lacération du foie au cours de la séparation des tissus conjonctifs entre le foie et l'estomac, et des dommages par inadvertance des vaisseaux sanguins. Cela devrait être évité autant que possible. Fonctionnant sur batterie mini-cautérisation peut être utilisé pour arrêter le saignement, le cas échéant. Excessifs doivent être évités étirement autant que possible lorsque les organes et les tissus sont manipulés. Les conseils de la pince à épiler peuvent être enveloppés avec du coton, ou des conseils de coton peuvent être utilisés comme des baguettes de remplacer des pincettes. L'oesophage de souris a deux couches ou deux & #8220; tubes ", rougeâtre externe" tube musculaire »et intérieure blanchâtre" tubes de l'épithélium ". Lorsque l'incision est faite sur l'oesophage, les deux couches doivent être coupées ouvert. Sutures doivent être espacés uniformément avec la muqueuse précise muqueuses opposition. Fuite peut résulter d'une large distance entre les points de suture, alors que sténose peut se développer en raison d'une distance étroite entre les sutures. Cependant, une sténose peut bloquer le passage de nourriture et de causer la mort postopératoire, alors que légère fuite peut être fixé par adhérence locale et réaction fibrotique et est donc généralement pas la vie en danger.
Il ya plusieurs principes généraux critique à suivre dans le protocole. La durée de la chirurgie devrait être raccourcie si possible (environ 20-30 min dans le laboratoire). Le jeûne avant et après la chirurgie est nécessaire. En fait, le jeûne prolongé (> 1 jour) peut être nocif. La chirurgie est mieux réalisée par un chirurgien. Un assistant peut aider à anesthésier les souris et fournir Surgmatériaux iCal. Un microscope est pas nécessaire à moins que le chirurgien a été correctement formés en microchirurgie. Sinon, la durée de l'intervention a tendance à être plus longue que nécessaire et donc la survie postopératoire peut être potentiellement pire.
Ces procédures ont été utilisées dans des publications antérieures et ont donné des résultats satisfaisants. Utilisation de type sauvage et des souris génétiquement modifiées, nous avons démontré que NFkB et Nrf2 voies réglementés la fonction barrière de l'épithélium de l'oesophage au cours reflux gastro-oesophagien 11,12. Cependant, nous ne sommes pas en mesure de produire de l'œsophage ou de l'adénocarcinome à part entière de Barrett chez ces souris, à la place, dispersés cellules mucineuses et le carcinome spinocellulaire ont été induites 9. Différences histologiques entre l'œsophage de la souris et de l'oesophage humaine peuvent être les limites inhérentes à ces modèles chirurgicales dans la recherche sur l'adénocarcinome de l'œsophage et de l'oesophage de Barrett.
Nous croyons que ces surgical modèles sont utiles pour les études sur le RGO. Fonctions de gènes et les voies moléculaires peuvent être élucidés à comprendre les mécanismes moléculaires de RGO et de développer la thérapie basée sur le mécanisme. Lorsqu'il est utilisé pour la production d'un adénocarcinome de l'œsophage et de l'oesophage de Barrett, les modifications génétiques seront nécessaires en combinaison avec la chirurgie de reflux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
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