Protocol
Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Maus Vorbereitung
- Verwenden Sie Mäusen über ~ 20 g Körpergewicht oder darüber ~ 6 Wochen alt für die Chirurgie.
- Vor der Operation geben Mäuse eine Laborfutter und Wasser ad libitum und pflegen auf einem 12:12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus.
- Rasieren Sie die OP-Bereich mit einer Haarschneidemaschine. Betäuben Mäusen durch intraperitoneale Injektion von 80 mg / kg Ketamin und 12 mg / kg Xylazin. Diese Dosis legt Mäusen in den Schlaf in wenigen Minuten und eine ausreichende Anästhesie für folgende chirurgische Eingriffe.
- Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung basierend auf der Abwesenheit von Kornealreflex Leib und Zurückziehen, wenn die Pfotenballen eingeklemmt. Bewerben Schmieraugensalbe auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern.
- Sterilisieren Sie die Haut mit Betadin-Lösung.
2. Magenreflux Model (1B)
- Stellen Sie eine obereMittellinienschnitt von ~ 2 cm ausgehend von dem Schwertfortsatz, die auf den Anus.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle durch die Mittellinie. Entfernen Sie den Schwertfortsatz, um die Exposition mit einer Schere zu verbessern.
- Separate und schneiden das Bindegewebe zwischen Leber und den Magen. Ligieren und schneiden Sie das Gefäß Bündel zwischen der Milz und des Augenhintergrundes, um völlig frei bis der Fundus.
- Drehen Sie den Fundus etwas nach links und setzen die linke Seite des gastroösophagealen Übergang in das Feld ein. Machen Sie eine 5 mm Längsschnitt auf den Muskel entlang des distalen Ösophagus mit einer scharfen Schere, um das Epithel aussetzen.
- Schneiden Sie das Epithel entlang der gleichen Richtung (Inzision 1, 1B). Machen Sie drei Einschnitte an der Vormagen (Inzision 2, 3 und 4, 1B), um mit scharfen Betriebs Schere abgeschnitten meisten der Vormagen. Wenn der Magen nicht leer ist, sorgfältig Mageninhalt zu entfernen.
- Legen Sie eine 8-0 Prolene Suture (mit einer Verjüngung Punktnadel) durch den Punkt A (auf der Speiseröhre) und Punkt A '(auf dem Vormagen) mit genauen Schleimhaut Opposition Schleimhaut. Ebenso Ort Nähte durch Punkt B und Punkt b 'und andere Paare von Punkten auf. Gleichmäßig Raum diese Nähte 3-4 mm voneinander.
- Waschen Sie die Bauchhöhle mit physiologischer Kochsalzlösung zu reinigen Blut und Mageninhalt. Schließen Sie die Bauchdecke mit Seidenfäden und die Haut mit Metallklammern.
3. Mixed Reflux Modell (Abbildung 1c)
- Führen Sie die Schritte 2.1 bis 2.4, die gastro-Kreuzung aussetzen.
- Trennen Sie vorsichtig die Rückenseite der Speiseröhre aus den Blutgefäßen hinter der Speiseröhre. Übergeben Sie einen kleinen Baumwollspitze zwischen der Speiseröhre und Blutgefäße.
Hinweis: Baumwolle kann teilweise von der Spitze entfernt werden, um seine Größe zu reduzieren. Diese Baumwollspitze dient zwei Zwecken, hob die Speiseröhre und den Schutz der Blutgefäße. - Machen Sie zwei 5 mm Längs incisions jeweils auf der gastro-Kreuzung und dem proximalen Ende des Zwölffingerdarms neben den Pylorus mit scharfen Betriebs Schere. Für den Schnitt auf den Zwölffingerdarm, Blutgefäße zu vermeiden und auf den Anti-mesenterischen Grenze.
- Anastomosieren die Einschnitte mit genauen Schleimhaut der Opposition mit unterbrochener 8-0 Prolene Nahtmaterial Schleimhaut. Regel 3-4 Nähte auf der Rückenseite und 2-3 Nähte auf der Vorderseite.
- Entfernen Sie die Wattestäbchen. Waschen Sie die Bauchhöhle mit physiologischer Kochsalzlösung und schließen Sie die Bauchwand und die Haut.
4. Duodenal Reflux-Modell (Abbildung 1D)
- Folgen Sie Schritt 3.1 bis 3.4 auf gemischte Rückfluss zu erzeugen.
- Heben Sie den Magen zu seiner Rückseite freizulegen. Eine Leberlappens kann durch das Bindegewebe zwischen der Leber und der Rückseite des Magens gefangen werden. Schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe, richtig schützen die Leber, und setzen die Blutgefäße auf der Rückenseite der Speiseröhre.
- Ligat undschneiden die Blutgefäße. Ligieren und schneiden die Speiseröhre am gastroösophagealen Übergang.
- Ligieren den Zwölffingerdarm am Pylorus. Ligieren und schneiden das Mesenterium. Entfernen Sie den ganzen Magen.
- Mit normaler Kochsalzlösung waschen Sie die Bauchhöhle. Schließen Sie die Bauchwand und die Haut.
5. Post-operative Behandlung
- Nach der Operation halten die Körpertemperatur mit einem Heizkissen. Erst nach Wiedererlangung der Brustlage, legen Sie die Mäuse wieder mit anderen Tieren.
- Geben Antibiotika und schmerzstillende, um eine Infektion zu verhindern und Schmerzen zu lindern. Injizieren Baytril (10 mg / kg, ip, qd, für 3 Tage), um eine Infektion zu verhindern, und Buprenorphin-Hydrochlorid (0,05 mg / kg, sc, Gebot. Für zwei Tage) als Schmerzmittel. Fasten ist nicht nach der Operation notwendig.
Eine flüssige oder weiche Nahrung gegeben werden. - Beurteilen Sie die allgemeinen Gesundheitszustand auf das tägliche basis.If die Mäuse zeigten die folgenden Zeichen (dramatischen Gewichtsverlust> 15%, fehlende Appetite, Stimmgebung, entladen aus dem Mund, Nase oder Augen, beugte Geste, Inaktivität, abnorme Körperpflege-Aktivität), einschläfern die Mäuse.
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Representative Results
Die meisten Mäuse (> 95%) kann die Operation zu überleben. Während der perioperativen Phase, die häufigsten Todesursachen zählen Überdosis Narkosemittel, Blutungen und aus unbekannten Gründen.
Vier Wochen nach der Operation,> 90% Mäuse mit Magen-Reflux oder gemischten Reflux und> 80% Mäusen mit Ulcus Rückfluß überleben können. Während dieser Zeit, vor allem Mäuse sterben an Ösophagusstriktur und die Unfähigkeit, zu essen. Diese Mäuse zeigen Anzeichen von starken Stress (gekrümmte Haltung, Inaktivität, Erbrechen, eingesunkenen Augen, Stimmgebung, etc.) und müssen eingeschläfert werden. Medizinische Behandlung mit Antibiotika und Infusions der Regel können diese Mäuse vor dem Tod nicht retten. Mäuse in der Regel verlieren ihre Körpergewicht von ein paar Gramm nach der Operation, vor allem diejenigen mit Zwölffingerdarm-Reflux. Dennoch Körpergewicht wird sich erholen und erhöhen Sie später.
Vierzig Wochen nach der Operation, können> 80% Mäusen, die mit Magen-und gemischten Reflux und> 70% Mäusen mit Zwölffingerdarm-Reflux überleben. Durdieser Periode können einige Mäuse an Unterernährung oder unbekannten Gründen sterben. Wir haben Mäuse 80 Wochen nach der Operation gehalten. Im allgemeinen sind sie noch sehr aktiv und gesund 9.
Vier Wochen nach der Operation, wird die Architektur des ösophagealem Epithel mehr oder weniger vom Rückfluss beschädigt werden. Unter dem Mikroskop, wird das Epithel dicker und die Papille verlängert. Hyperproliferation von Epithelzellen und Infiltration von Entzündungszellen (zB Neutrophile, Mastzellen und Eosinophilen) sind offensichtliche Anzeichen von Ösophagitis (Abbildung 2). Zytokine in Ösophagusepithel (zB IL1β, IL6 und IL8) besonders in Gegenwart von Zwölffingerdarm-Reflux-11 erhöht. Unter Transmissionselektronenmikroskop, spiegelt dilatative Interzellularraum die Beeinträchtigung der epithelialen Barrierefunktion 12. Funktion angeht, transepitheliale elektrische Widerstand drastisch verringert, insbesondere in Gegenwart von duodenal Reflux.
Abbildung 1: (A) Anatomie des oberen Verdauungstraktes bei Mäusen (Vorderansicht und Seitenansicht); (B) Magenrückfluß (Seitenansicht); (C) Mixed Reflux (Vorderansicht); (D) Duodenal Reflux (Vorderansicht).
Figur 2: Histologie der Maus ösophagealem Epithel ohne Rücklauf (A) oder mit Magen-Reflux (B), Misch Rückfluß (C) duodeni Reflux (D). Maßstabsbalken = 50 & mgr; m.
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Discussion
Verschiedene chirurgische Modelle wurden eingerichtet, um Magen, Zwölffingerdarm-und gemischten Reflux bei Nagetieren zu imitieren. Diese drei hier beschriebenen Verfahren eignen sich für Langzeitexperimente mit günstigen Preisen für postoperative Überleben. Ein Forscher mit chirurgischen Erfahrungen sollten in der Lage, die Technik nach einer kurzen Periode der Praxis erfassen.
Blutungen können von intraperitonealer Injektion von Anästhetika vor Operationen, Verletzungen der Leber während der Abtrennung des Bindegewebes zwischen der Leber und dem Magen, und eine unbeabsichtigte Schädigung der Blutgefäße führen. Dies sollte so weit wie möglich vermieden werden. Batteriebetriebene Mini-Kauter kann verwendet werden, gegebenenfalls Blutungen zu stoppen. Übermäßige Dehnung sollte so weit wie möglich vermieden werden, wenn Organe und Gewebe manipuliert werden. Die Spitzen der Pinzette kann mit Baumwolle umwickelt werden, oder Baumwollspitzen können, wie Stäbchen verwendet werden, um einer Pinzette zu ersetzen. Die Maus Speiseröhre hat zwei Schichten oder zwei & #8220; Rohre ", äußeren rötlich" Muskelrohr "und inneren weißliche" Epithel Rohr ". Wenn ein Einschnitt an der Speiseröhre gemacht, müssen beide Schichten aufgeschnitten werden. Nähte sollten gleichmäßig mit genauen Schleimhaut beabstandet sein, um Opposition Schleimhaut. Leckage kann aus einem weiten Abstand zwischen den Nähten führen, während Stenose kann durch einen engen Abstand zwischen den Nähten zu entwickeln. Jedoch kann Stenose die Passage der Nahrung zu blockieren und dazu führen postoperative Tod, während geringe Leckage unter Umständen durch örtliche Haftung und fibrotische Reaktion befestigt werden und ist somit in der Regel nicht lebensbedrohlich.
Es gibt mehrere kritisch allgemeinen Grundsätze innerhalb des Protokoll folgen. Die Dauer der Operation sollte, wenn möglich (ca. 20-30 min im Labor) verkürzt werden. Fasten vor und nach der Operation nicht notwendig ist. In der Tat kann längeres Fasten (> 1 Tag) schädlich sein. Chirurgie wird am besten von einem Chirurgen durchgeführt. Ein Assistent kann helfen, zu betäuben die Mäuse und liefern surgschen Materialien. Ein Mikroskop ist nicht notwendig, es sei denn, der Arzt hat richtig in der Mikrochirurgie geschult. Ansonsten die Dauer der Operation dazu neigt, länger als notwendig und somit die postoperative Überlebens potenziell schlimmer sein.
Diese Verfahren sind in früheren Veröffentlichungen verwendet und haben zufriedenstellende Ergebnisse erzeugt. Verwenden von Wildtyp und gentechnisch veränderten Mäusen, zeigten wir, dass NFkB und Nrf2 Wege reguliert die Barrierefunktion der Ösophagusepithel während gastroösophagealen Reflux 11,12. Allerdings waren wir nicht in der Lage, ausgewachsene Barrett-Ösophagus oder Adenokarzinom in diesen Mäusen zu produzieren, sondern verstreut muzinöse Zellen und Plattenepithel-Karzinom induziert wurden 9. Die histologische Unterschiede zwischen Maus und der menschlichen Speiseröhre Speiseröhre können die inhärenten Einschränkungen dieser chirurgischen Modellen in der Forschung über Barrett-Ösophagus und Adenokarzinom des Ösophagus zu sein.
Wir glauben, dass diese surgical Modelle sind nützlich für Studien zu GERD. Funktionen von Genen und molekularen Signalwege aufgeklärt, um die molekularen Mechanismen der GERD zu verstehen und zu entwickeln Mechanismus-basierte Therapie werden. Wenn für die Herstellung von Barrett-Ösophagus und Speiseröhrenkrebs Adenokarzinom verwendet werden genetische Veränderungen in Verbindung mit Reflux-Operation erforderlich sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
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