Protocol
Todas as experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional.
1. Preparação do rato
- Use camundongos mais ~ 20 g no peso corporal ou superiores a 6 semanas de idade para a cirurgia.
- Antes da cirurgia, dar camundongos um laboratório de comida e água ad libitum e manter em um ciclo claro-escuro de 00:12 h.
- Raspar a área cirúrgica com uma máquina de cortar cabelo. Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de 80 mg / kg de cetamina e 12 mg / kg de xilazina. Esta dose coloca ratos no sono em poucos minutos e fornece anestesia suficiente para os seguintes procedimentos cirúrgicos.
- Confirme anesthetization adequada com base na ausência do reflexo corneal e retração membro quando a pata é comprimido. Aplicar lubrificante pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento.
- Esterilizar a pele com solução de betadine.
2. Modelo refluxo gástrico (Figura 1B)
- Realizar uma superiorincisão na linha média de ~ 2 cm a partir da xifóide apontando para o ânus.
- Abra-se a cavidade abdominal através da linha média. Remova o xifóide para aumentar a exposição com um par de tesouras.
- Separa-se e cortar os tecidos conjuntivos entre o fígado e o estômago. Ligadura e cortar o feixe vascular entre o baço e do fundo, a fim de completamente livre até o fundo.
- Ligue o fundo ligeiramente para a esquerda e expor o lado esquerdo da junção gastro-esofágico no campo. Adicione uma incisão longitudinal de 5 mm no músculo distai ao longo do esófago utilizando um par de tesouras para expor o epitélio.
- Corte aberto do epitélio ao longo da mesma direcção (incisão 1, Figura 1B). Adicione três incisões na pança de incisão (2, 3 e 4, Figura 1B) para eliminar a maioria da pança com uma tesoura afiada operacionais. Se o estômago não está vazio, remova cuidadosamente o conteúdo gástrico.
- Coloque um Sutu prolene 8-0re (com um ponto de afunilamento agulha) através de um ponto (no esôfago) e ponto A '(na pança) com uma precisão de mucosa da mucosa oposição. De igual modo lugar suturas através do ponto b e Ponto b ', e outros pares de pontos, respectivamente. Uniformemente espaço estas suturas 3-4 mm uns dos outros.
- Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal para limpar o sangue e o conteúdo gástrico. Feche a parede abdominal com fio de seda e pele com grampos metálicos.
3. Modelo de Refluxo mistos (Figura 1C)
- Siga os passos 2.1 a 2.4 para expor a junção gastroesofágico.
- Suavemente separar o lado dorsal do esófago a partir dos vasos sanguíneos por trás do esófago. Passe uma ponta de algodão pequena entre os vasos sanguíneos e esôfago.
Nota: O algodão pode ser parcialmente removida a partir da ponta para reduzir o seu tamanho. Esta dica de algodão serve a dois propósitos, levantando o esôfago e proteger os vasos sanguíneos. - Faça inc dois cinco milímetros longitudinalisions cada na junção gastro-esofágico e a extremidade proximal do duodeno adjacente ao piloro com uma tesoura afiada operacionais. Para a incisão no duodeno, evitar vasos sanguíneos e coloque na fronteira anti-mesentérica.
- Anastomosar as incisões com mucosa com precisão de mucosas oposição interrompidas 8-0 suturas de Prolene. Normalmente coloque 3-4 suturas na face dorsal e 2-3 suturas na parte da frente.
- Retire a ponta de algodão. Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal e fechar a parede abdominal e a pele.
4. Modelo Duodenal refluxo (Figura 1D)
- Siga o passo 3.1 a 3.4 para gerar misto de refluxo.
- Com cuidado, levante o estômago para expor a sua parte de trás. Um lobo do fígado podem ser abrangidos pelo tecido conjuntivo entre o fígado e parte de trás do estômago. Corte cuidadosamente os tecidos conjuntivos, corretamente proteger o fígado, e expor os vasos sanguíneos no lado dorsal do esôfago.
- Ligadura ecortar os vasos sanguíneos. Ligadura e cortado o esófago na junção gastroesofágico.
- Ligar o duodeno no piloro. Ligadura e cortar o mesentério. Remover todo o estômago.
- Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal. Fechar a parede abdominal e a pele.
5. O tratamento pós-cirúrgico
- Após a cirurgia manter a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento. Só depois de recuperar decúbito esternal, coloque os ratos de volta com outros animais.
- Dar antibióticos e analgésicos para prevenir a infecção e aliviar a dor. Injectar Baytril (10 mg / kg, ip, qd, durante 3 dias) para prevenir a infecção, e cloridrato de buprenorfina (0,05 mg / kg, sc, bid. Dois dias) como analgésico. O jejum não é necessário após a cirurgia.
A dieta líquida ou mole pode ser dada. - Avaliar o estado de saúde geral sobre basis.If diários os ratos mostram os seguintes sinais (dramática perda de peso> 15%, a falta de appetite, vocalização, descarregar a partir da boca, nariz ou olhos, gesto curvado, inatividade, atividade aliciamento anormal), sacrificar os ratos.
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Representative Results
A maioria dos ratinhos (> 95%) pode sobreviver à cirurgia. Durante o período perioperatório, as principais causas de morte incluem overdose de anestésicos, sangramento e razões desconhecidas.
Quatro semanas após a cirurgia,> 90% de ratinhos com refluxo gástrico ou misto de refluxo e> 80% de ratinhos com refluxo duodenal podem sobreviver. Durante este período, os ratos morrem principalmente de estenose esofágica e incapacidade para comer. Estes ratos mostram sinais de estresse grave (postura arqueada, a inatividade, vômitos, olhos encovados, vocalização, etc.) e precisam ser sacrificados. O tratamento médico com antibióticos e infusão geralmente não pode salvar estes ratos de morrer. Ratos geralmente perdem seu peso corporal por um par de gramas após a cirurgia, especialmente aqueles com refluxo duodenal. Não obstante o peso corporal vai se recuperar e aumentar mais tarde.
Quarenta dias após a cirurgia,> 80% de ratinhos com refluxo gástrico e misturado e> 70% de ratinhos com refluxo duodenal podem sobreviver. During este período, alguns ratos podem morrer de desnutrição ou razões desconhecidas. Mantivemos ratos durante 80 semanas após a cirurgia. Em geral, eles ainda são muito ativos e saudáveis 9.
Às quatro semanas após a cirurgia, a arquitetura do epitélio esofágico será danificado mais ou menos por refluxo. Sob o microscópio, o epitélio torna-se mais espessa e a papila alonga. Hiperproliferação das células epiteliais e infiltração de células inflamatórias (por exemplo, neutrófilos, eosinófilos e mastócitos) são sinais óbvios de esofagite (Figura 2). As citocinas em epitélio esofágico (por exemplo, IL1β, IL6 e IL8) são particularmente elevados, na presença de refluxo duodenal 11. Sob microscopia eletrônica de transmissão, espaço intercelular dilatado reflete o comprometimento da função barreira epitelial 12. Função-sábio, resistência eléctrica trans-epitelial é drasticamente diminuída, especialmente na presença de duodenrefluxo ai.
Figura 1: (A) Anatomia do trato digestivo superior em ratinhos (vista frontal e lateral); (B) refluxo gástrico (vista lateral); (C) refluxo Misto (vista frontal); (D) refluxo Duodenal (vista de frente).
Figura 2: Histologia de rato sem epitélio esofágica de refluxo (A), ou com refluxo gástrico (B), misto de refluxo (C), refluxo duodeno (D). Barra de escala = 50 mm.
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Discussion
Vários modelos cirúrgicos foram criados para imitar gástrica, duodenal e misto de refluxo em roedores. Estes três procedimentos aqui descritos são adequados para experimentos de longo prazo com taxas razoáveis de sobrevivência pós-operatória. Um pesquisador com experiência cirúrgica deve ser capaz de compreender a técnica, após um curto período de prática.
A hemorragia pode resultar de injecção intraperitoneal de anestésicos antes da cirurgia, laceração do fígado durante a separação dos tecidos conjuntivos entre o fígado e do estômago, e danos inadvertidos dos vasos sanguíneos. Isso deve ser evitado tanto quanto possível. Operado por bateria mini-cautério pode ser utilizado para parar o sangramento, se apropriado. Alongamento excessivo deve ser evitado, tanto quanto possível quando os órgãos e tecidos são manipulados. As pontas das pinças pode ser envolto com algodão, ou pontas de algodão podem ser utilizados para substituir pauzinhos como pinças. O esôfago do rato tem duas camadas ou duas & #8220; tubos ", avermelhado exterior" tubo muscular "e esbranquiçada interior" tubo epitélio ". Quando é feita uma incisão no esófago, ambas as camadas devem ser cortado e aberto. Suturas devem ser uniformemente espaçados com precisão de mucosa da mucosa oposição. O vazamento pode resultar de uma ampla distância entre as suturas, enquanto estenose pode desenvolver-se devido a uma distância estreita entre as suturas. No entanto, a crítica pode bloquear a passagem dos alimentos e causar a morte de pós-operatório, ao passo que um pequeno derrame pode ser fixado por adesão local e reação fibrótica e, portanto, geralmente não é fatal.
Existem vários princípios criticamente gerais a serem seguidas no âmbito do protocolo. A duração da cirurgia deve ser encurtado se possível (cerca de 20-30 minutos no laboratório). Jejum antes e após a cirurgia é desnecessária. Na verdade, jejum prolongado (> 1 dia) pode ser prejudicial. A cirurgia é melhor executada por um único cirurgião. Um assistente pode ajudar a anestesiar os ratos e fornecer surgmateriais iCal. Um microscópio não é necessário a menos que o cirurgião tenha sido devidamente treinado em microcirurgia. Caso contrário, a duração da cirurgia tende a ser maior do que o necessário e, portanto, a sobrevivência pós-operatória pode ser potencialmente pior.
Estes procedimentos foram utilizados em publicações anteriores e geraram resultados satisfatórios. Usando de tipo selvagem e camundongos geneticamente modificados, demonstramos que NFkB e Nrf2 vias regulada a função de barreira do epitélio do esôfago durante o refluxo gastro-esofágico 11,12. No entanto, não foram capazes de produzir esôfago ou adenocarcinoma full-blown de Barrett nesses camundongos, em vez disso, as células espalhadas mucinoso e carcinoma de células escamosas foram induzidos 9. Diferenças histológicas entre esôfago do rato e do esôfago humano podem ser as limitações inerentes a esses modelos cirúrgicos na pesquisa sobre adenocarcinoma de esôfago e esôfago de Barrett.
Nós acreditamos que estes surgical modelos são úteis para estudos sobre DRGE. Funções de genes e vias moleculares pode ser elucidada para compreender os mecanismos moleculares de RGE e desenvolver a terapia baseada em mecanismo. Quando usado para a produção de adenocarcinoma do esófago de Barrett e esofágica, serão necessárias modificações genéticas em combinação com a cirurgia de refluxo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
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