Protocol
Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional.
1. Preparación del ratón
- Utilice ratones durante ~ 20 g en el peso corporal o por encima de ~ 6 semanas de edad para la cirugía.
- Antes de la cirugía, los ratones dar un laboratorio chow y agua ad libitum y mantener en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.
- Afeitarse el área quirúrgica con una cortadora de cabello. Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de 80 mg / kg de ketamina y 12 mg / kg de xilazina. Esta dosis pone ratones en el sueño en unos pocos minutos y proporciona anestesia suficiente para los siguientes procedimientos quirúrgicos.
- Confirme anestesia adecuada en base a la ausencia de reflejo corneal y la retracción del miembro cuando se pellizca la almohadilla plantar. Aplicar lubricante pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad.
- Esterilizar la piel con una solución de betadine.
2. Reflujo gástrico Modelo (Figura 1B)
- Hacer una superiorincisión en la línea media de ~ 2 cm a partir de la xifoides señalando el ano.
- Abre la cavidad abdominal a través de la línea media. Retire el xifoides para mejorar la exposición con un par de tijeras.
- Separar y cortar los tejidos conectivos entre el hígado y el estómago. Ligar y cortar el haz buque entre el bazo y el fondo de ojo con el fin de liberar completamente el fondo de ojo.
- Girar el fundus ligeramente a la izquierda y exponer el lado izquierdo de la unión gastroesofágica en el campo. Haga una incisión longitudinal 5 mm en el músculo lo largo del esófago distal usando un par de tijeras afiladas para exponer el epitelio.
- Cortar abrir el epitelio a lo largo de la misma dirección (incisión 1, Figura 1B). Hacer tres incisiones en la forestomach (incisión 2, 3 y 4, la Figura 1B) para cortar la mayor parte del forestomach con unas tijeras afiladas de funcionamiento. Si el estómago no está vacío, retire con cuidado el contenido gástrico.
- Coloque una sutu 8-0 prolenere (con un punto de la forma cónica de la aguja) por el punto A (en el esófago) y el punto A '(en la panza) con una precisión de la mucosa de la mucosa de la oposición. Igualmente lugar suturas por el punto B y el punto B ', y otros pares de puntos, respectivamente. Espaciar uniformemente estas suturas 3-4 mm uno del otro.
- Lavar la cavidad abdominal con solución salina normal para limpiar la sangre y el contenido gástrico. Cierre de la pared abdominal con suturas de seda y la piel con grapas metálicas.
3. Mixta Modelo reflujo (Figura 1C)
- Siga los pasos 2.1 a 2.4 para exponer la unión gastroesofágica.
- Separar suavemente la cara dorsal del esófago de los vasos sanguíneos detrás del esófago. Pasar una pequeña punta de algodón entre el esófago y los vasos sanguíneos.
Nota: El algodón puede ser eliminado parcialmente de la punta para reducir su tamaño. Esta punta de algodón tiene dos propósitos, levantando el esófago y la protección de los vasos sanguíneos. - Hacer inc dos 5 mm longitudinalisions cada uno en la unión gastroesofágica y el extremo proximal del duodeno adyacente al píloro con unas tijeras afiladas de funcionamiento. Para la incisión en el duodeno, evitar los vasos sanguíneos y el lugar en la frontera anti-mesentérica.
- Anastomosan las incisiones con una precisión de la mucosa de la mucosa oposición interrumpidas 8-0 suturas Prolene. Por lo general, colocar 3-4 suturas en la cara dorsal y 2-3 suturas en la parte frontal.
- Retire la punta de algodón. Lavar la cavidad abdominal con solución salina normal y cerrar la pared abdominal y la piel.
4. duodenal Reflujo Modelo (Figura 1D)
- Siga paso 3.1 a 3.4 para generar reflujo mixto.
- Levante con cuidado el estómago para exponer su cara posterior. Un lóbulo del hígado puede ser atrapado por los tejidos conectivos entre el hígado y la parte posterior del estómago. Corte cuidadosamente los tejidos conectivos, adecuadamente proteger el hígado, y exponer los vasos sanguíneos en la cara dorsal del esófago.
- Ligar ycortar los vasos sanguíneos. Ligar y cortar el esófago en la unión gastroesofágica.
- Ligar el duodeno en el píloro. Ligar y cortar el mesenterio. Retire todo el estómago.
- Lavar la cavidad abdominal con solución salina normal. Cierre la pared abdominal y la piel.
Tratamiento 5. Post-quirúrgica
- Después de la cirugía mantener la temperatura corporal con una almohadilla térmica. Sólo después de recuperar decúbito esternal, coloque el ratón hacia atrás con otros animales.
- Dar antibióticos y analgésicos para prevenir la infección y aliviar el dolor. Inyectar Baytril (10 mg / kg, ip, una vez al día, durante 3 días) para prevenir la infección, y clorhidrato de buprenorfina como analgésico (0,05 mg / kg, sc, apuesta por dos días.). El ayuno no es necesario después de la cirugía.
Una dieta líquida o blanda se puede dar. - Evaluar el estado de salud general sobre basis.If diarias los ratones muestran los siguientes signos (dramática pérdida de peso> 15%, la falta de aplicaciónetite, vocalización, la descarga de la boca, la nariz o los ojos, gesto encorvada, la inactividad, la actividad anormal de aseo), la eutanasia a los ratones.
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Representative Results
La mayoría de los ratones (> 95%) pueden sobrevivir a la cirugía. Durante el período perioperatorio, las principales causas de muerte son la sobredosis de anestésicos, sangrado y razones desconocidas.
Cuatro semanas después de la cirugía,> 90% ratones con reflujo gástrico o reflujo mixta y> 80% los ratones con el reflujo duodenal pueden sobrevivir. Durante este período, los ratones mueren principalmente de estenosis esofágica y la incapacidad para comer. Estos ratones muestran signos de estrés severo (postura encorvada, la inactividad, vómitos, ojos hundidos, la vocalización, etc.) y tienen que ser sacrificados. El tratamiento médico con antibióticos y la infusión generalmente no puede salvar a estos ratones de la muerte. Los ratones generalmente pierden su peso corporal por un par de gramos después de la cirugía, especialmente aquellos con reflujo duodenal. No obstante el peso corporal se recuperará y aumentará en el futuro.
Cuarenta semanas después de la cirugía,> 80% en ratones con gástrica y el reflujo mixta y> 70% los ratones con el reflujo duodenal pueden sobrevivir. During este período, algunos ratones pueden morir por desnutrición o causas desconocidas. Hemos mantenido los ratones durante 80 semanas después de la cirugía. En general, siguen siendo bastante activo y saludable 9.
A las cuatro semanas después de la cirugía, la arquitectura del epitelio esofágico se dañará más o menos por el reflujo. Bajo el microscopio, el epitelio se vuelve más grueso y la papila se alarga. Hiperproliferación de las células epiteliales y la infiltración de células inflamatorias (por ejemplo, neutrófilos, mastocitos y eosinófilos) son signos evidentes de esofagitis (Figura 2). Las citoquinas en el epitelio de esófago (por ejemplo, IL1β, IL6 y IL8) son elevados en particular en la presencia de reflujo duodenal 11. Bajo el microscopio electrónico de transmisión, el espacio intercelular dilatada refleja el deterioro de la función de barrera del epitelio 12. Función-sabia, resistencia eléctrica transepitelial se redujo drásticamente, especialmente en la presencia de duodenal reflujo.
Figura 1: (A) Anatomía del tracto digestivo superior en ratones (vista frontal y lateral); (B) El reflujo gástrico (vista lateral); (C) de reflujo mixto (vista frontal); (D) de reflujo duodenal (vista frontal).
Figura 2: Histología de ratón epitelio esofágico sin reflujo (A), o con reflujo gástrico (B), reflujo mixto (C), el reflujo duodenal (D). La barra de escala = 50 micras.
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Discussion
Varios modelos quirúrgicos se han establecido para imitar gástrica, duodenal y reflujo mixto en roedores. Estos tres procedimientos descritos aquí son adecuados para los experimentos a largo plazo con tasas razonables de supervivencia postoperatoria. Un investigador con experiencia quirúrgica debe ser capaz de captar la técnica después de un corto período de práctica.
El sangrado puede ser el resultado de la inyección intraperitoneal de anestésicos antes de la cirugía, laceración del hígado durante la separación de los tejidos conectivos entre el hígado y el estómago, y el daño accidental de los vasos sanguíneos. Esto se debe evitar tanto como sea posible. Mini-cauterio de pilas puede ser utilizado para detener el sangrado si es apropiado. El exceso de estiramiento se debe evitar tanto como sea posible cuando se manipulan los órganos y tejidos. Las puntas de las pinzas pueden ser envueltos con algodón, o puntas de algodón se pueden usar como palillos para reemplazar pinzas. El esófago ratón tiene dos capas o de dos & #8220; tubos ", rojizo exterior" tubo muscular "y interior blanquecino" tubo epitelio ". Cuando se hace una incisión en el esófago, ambas capas necesitan ser cortados abierta. Las suturas deben ser espaciados de manera uniforme con una precisión de la mucosa de la mucosa oposición. La fuga puede resultar de una amplia distancia entre las suturas, mientras que la estenosis puede desarrollarse debido a una distancia estrecho entre las suturas. Sin embargo, la estenosis puede bloquear el paso de alimentos y causar la muerte postoperatoria, mientras que una pequeña fuga se puede fijar por adhesión local y reacción fibrótica y por lo tanto por lo general no es potencialmente mortal.
Hay varios principios críticamente generales a seguir dentro del protocolo. La duración de la cirugía debería acortarse si es posible (aproximadamente 20-30 min en el laboratorio). El ayuno antes y después de la cirugía no es necesaria. De hecho, el ayuno prolongado (> 1 día) puede ser perjudicial. La cirugía se realiza mejor por un cirujano. Un asistente puede ayudar a anestesiar a los ratones y suministrar surgmateriales iCal. Un microscopio no es necesario a menos que el cirujano ha sido debidamente capacitado en microcirugía. De lo contrario, la duración de la cirugía tiende a ser más largo que la supervivencia postoperatoria necesario y por lo tanto puede ser potencialmente peor.
Estos procedimientos han sido utilizados en publicaciones anteriores y han generado resultados satisfactorios. El uso de tipo salvaje y ratones modificados genéticamente, hemos demostrado que NFkB y Nrf2 vías reguladas la función de barrera del epitelio esofágico durante reflujo gastroesofágico 11,12. Sin embargo, no fuimos capaces de producir esófago o adenocarcinoma en toda regla de Barrett en estos ratones, en cambio, esparcidos células mucinoso y carcinoma de células escamosas fueron inducidos 9. Diferencias histológicas entre el esófago y el esófago de ratón humano pueden ser las limitaciones inherentes de estos modelos quirúrgicos en la investigación sobre el adenocarcinoma de esófago y esófago de Barrett.
Creemos que estos Domodelos rgical son útiles para los estudios sobre la ERGE. Funciones de los genes y las vías moleculares pueden ser dilucidado a comprender los mecanismos moleculares de la ERGE y desarrollar una terapia basada en el mecanismo. Cuando se utiliza para la producción de adenocarcinoma de esófago y de esófago de Barrett, se necesitarán modificaciones genéticas en combinación con la cirugía de reflujo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
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