Protocol
Tüm hayvan deneyleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Fare Hazırlık
- Üzerinde fareler kullanın ~ vücut ağırlığı 20 g veya ameliyat yaşı 6 ~ yukarıdaki hafta.
- Ameliyattan önce, fareler laboratuvar yemi ve su ad libitum beslendi ve 00:12 saat ışık-karanlık çevrimi ile korumak.
- Saç kesme makinesi ile cerrahi alan tıraş. 80 mg / kg ketamin ve 12 mg / kg ksilazin intraperitonal enjeksiyonu ile fareler anestezi. Bu doz birkaç dakika içinde uykuya fareler koyar ve aşağıdaki cerrahi işlemler için yeterli anestezi sağlar.
- Ayak tabanı sıkışmak zaman kornea refleksi ve uzuv retraksiyon yokluğunda dayalı doğru anesthetization onaylayın. Kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik merhem yağlama uygulayın.
- Betadine solüsyonu ile cilt sterilize edin.
2. Mide cezir modeli (Şekil 1B)
- Bir üst yapanüs işaret kılıç şeklinde başlayarak ~ 2 cm orta hat insizyonu.
- Orta hat boyunca karın boşluğu açın. Bir makas ile poz geliştirmek için kılıç şeklinde çıkarın.
- Ayrı ve karaciğer ve mide arasında bağ dokuları kesmek. Bağlanır ve sipariş fundus kadar tamamen ücretsiz olarak dalak ve fundus arasındaki damar demeti kesti.
- Sola hafifçe fundus çevirin ve bu alandaki gastroözofageal bileşke sol tarafını ortaya çıkarmak. Epitel maruz keskin bir makas kullanarak uzak yemek borusunda boyunca kas üzerinde 5 mm boyuna kesi yapmak.
- Aynı yönde (kesi 1, Şekil 1B) boyunca epitel açın kesin. (Kesi 2, 3 ve 4, Şekil 1B) keskin bir işletim makas ile mide çoğu kesmek için mide üç kesiler olun. Mide boş değilse, dikkatli gastrik içeriğini kaldırmak.
- Bir 8-0 prolen sutu koyunYeniden doğru mukozal ile Noktası üzerinden (mide üzerine) (yemek borusu üzerine) ve Point '(konik noktası iğne ile) muhalefet mukozal. Sırasıyla Nokta b ve b Nokta ', ve Points diğer çiftleri aracılığıyla Aynı şekilde yer dikişler. Eşit olarak, bu dikişler alanı birbirinden 3-4 mm.
- Kan ve mide içeriğini temizlemek için serum fizyolojik ile karın boşluğuna yıkayın. Ipek dikişlerle karın duvarı ve metal klipleri ile cilt kapatın.
3. Karışık Reflü Modeli (Şekil 1C)
- Takip gastroözofageal kavşak açığa 2.4 2.1 adımları tekrarlayın.
- Yavaşça yemek borusu arkasındaki kan damarlarından özofagus dorsal yüzü ayırın. Özofagus ve kan damarları arasında küçük bir pamuk ucu geçirin.
Not: Pamuk kısmen boyutunu azaltmak için ucundan çıkarılabilir. Bu pamuk uçlu yemek borusu yukarı kaldırarak ve kan damarlarını korur iki amaca hizmet eder. - İki 5 mm boyuna inc olungastroözofageal bileşke ve keskin işletim makas ile pilor komşu duodenum yakın ucunda isions her. Duodenum üzerinde kesi için, kan damarları önlemek ve anti-mezenterik sınırında yer.
- Kesintiye 8-0 Prolen sütür ile muhalefeti mukozal doğru mukozal ile kesiler anastomoz. Genellikle sırt tarafında 3-4 sütür ve ön yüzünde 2-3 sütür koyun.
- Pamuk ucunu sökün. Serum fizyolojik ile karın boşluğuna yıkayın ve karın duvarı ve cilt kapatın.
4. Duodenal Reflü Modeli (Şekil 1D)
- Karışık reflüyü üretmek için 3.4 3.1 adım izleyin.
- Dikkatle arka tarafını ortaya çıkarmak için mide yukarı kaldırın. Karaciğerin bir lob karaciğer ve mide arkası arasında bağ dokuları tarafından yakalandı olabilir. Dikkatle bağ dokuları kesmek düzgün karaciğeri korumak ve yemek borusu sırt tarafında kan damarları açığa.
- Bağlanır vekan damarlarının kesti. Bağlanır ve gastroözofageal bileşkede özofagus kesti.
- Pilor de duodenum Arter. Bağlanır ve Mezenterium kesti. Bütün mide çıkarın.
- Normal tuzlu su ile karın boşluğuna yıkayın. Karın duvarı ve cilt kapatın.
5. Post-cerrahi tedavi
- Ameliyat sonrasında, bir ısıtma yastığı ile vücut ısısını korumak. Sadece sternal yatma kavuştuktan sonra, geri diğer hayvanlar ile fareler yerleştirin.
- Enfeksiyonu önlemek ve ağrıyı hafifletmek için antibiyotik ve analjezik verin. Baytril enjekte (10 mg / kg, ip, qd, 3 gün boyunca) enfeksiyonu önlemek ve Buprenorfin hidroklorür için (0.05 mg / kg, sc, teklif. Iki gündür) ağrı kesici olarak. Açlık ameliyat sonrası gerekli değildir.
Sıvı veya yumuşak bir diyet verilebilir. - Fareler aşağıdaki belirtileri göstermeye günlük BAZDA genel sağlık durumunu (dramatik kilo kaybı>% 15, app eksikliği değerlendirinetite, seslendirme, fareler euthanize, ağız, burun veya gözler, kambur jest, hareketsizlik, anormal tımar aktivitesi) dan boşaltın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çoğu fareler (>% 95) ameliyat yaşayabilir. Perioperatif dönemde, önde gelen ölüm nedenleri anestezik dozda, kanama ve bilinmeyen nedenler sayılabilir.
Ameliyattan sonra dört hafta,> duodenal reflü mide reflü ya da karışık reflü ve>% 80 farelerin% 90 fareler yaşayabilir. Bu dönemde, fareler başta özofagus darlığı ve yemek için yetersizlik ölmektedir. Bu fareler ağır stres (kambur duruş, hareketsizlik, kusma, batık gözler, seslendirme, vs.) belirtileri göstermeye ve ötenazi gerekir. Genellikle antibiyotik ve infüzyon ile tıbbi tedavi ölüyor bu fareler kaydedemezsiniz. Fareler genellikle ameliyat sonrası gram bir çift tarafından duodenal reflü ile özellikle vücut kilo. Yine de vücut ağırlığı iyileşir ve daha sonra artar.
Kırk hafta ameliyat sonrası, duodenal reflü mide ve karışık reflü ve>% 70 fare ile>% 80 fareler yaşayabilir. DurBu dönemi ing, bazı fareler yetersiz beslenme ya da bilinmeyen nedenlerle ölebilir. Biz ameliyattan sonra 80 hafta süreyle fareler tutmuş. Genel olarak, hala oldukça aktif ve 9 sağlıklıdır.
Ameliyattan sonra dört haftada, özofagus epiteli mimarisi reflü daha az ya da zarar görür. Mikroskop altında, epitel kalın olur ve papilla uzatır. Epitel hücrelerde ve iltihaplı hücrelerde (örneğin, nötrofil, eozinofil, mast hücreleri ve) infiltrasyonunun hiperproliferasyon (Şekil 2) özofajit belirgin işaretler. Özofagus epiteli (örn IL1β, IL6 ve IL8) 'de Sitokinler, özellikle duodenum reflü 11 varlığında yükselir. Transmisyon elektron mikroskobu altında, dilate hücrelerarası boşluk epitel bariyer fonksiyonunun 12 bozukluğunu yansıtır. İşlev-bazlı, trans-epitelial elektrik direnci, özellikle duoden varlığında azalmış olan büyük ölçüdeal geri akış.
Şekil 1: (A), farelerde (önden ve yandan görünüm) üst sindirim sistemi anatomisi; (B) Gastrik reflü (yandan görünüm); (C) Karışık reflü (önden görünüm); (D) Duodenal reflü (önden görünüm).
Şekil 2: Fare yemek borusu epitelindeki Histoloji geri akış (A) olmadan ya da gastrik geri akış (B), karışık geri akış (C), duodenal geri akış (D). Ölçek çubuğu 50 mikron =.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli cerrahi modeller kemiricilerde mide, duodenum ve karışık reflüyü taklit etmek kurulmuştur. Burada tarif edilen bu üç prosedür sonrası hayatta kalma makul fiyatlar ile uzun süreli deneyler için de uygundur. Cerrahi deneyime sahip bir araştırmacı uygulama kısa bir süre sonra teknik kavramak gerekir.
Kanama cerrahi, karaciğer, mide, ve kan damarlarının yanlışlıkla zarar arasında bağ dokularının ayrılması sırasında karaciğer laserasyon önce anestezik intraperitoneal enjeksiyonu ile sonuçlanabilir. Bu mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. Pilli mini koter uygunsa kanamayı durdurmak için kullanılabilir. Organları ve dokuları manipüle edildiğinde aşırı mümkün olduğunca kaçınılmalıdır germe. Cımbız uçları pamuk ile sarılabilir, ya da pamuk uçları cımbız yerine çubuklarını gibi kullanılabilmektedir. Fare özofagus iki kat ya da iki & # sahiptir8220; tüpleri ", dış kırmızımsı" kas tüp "ve iç beyazımsı" epitel tüp ". Bir kesik yemek borusu ile ilgili yapıldığında, her iki tabakanın, açık kesilmesi gerekmektedir. Dikişler eşit muhalefeti mukozal doğru mukozal ile aralıklı olmalıdır. Striktür dikiş arasındaki dar mesafe nedeniyle gelişebilir ise sızıntı, dikişler arasında geniş bir mesafe ile sonuçlanabilir. Ancak, darlık gıda geçişini engelleyebilir ve hafif sızıntı yerel yapışması ve fibrotik reaksiyonu ile sabit olabilir, oysa, postoperatif ölüme neden ve böylece genellikle hayatı tehdit değildir.
Protokole içinde takip etmek birkaç kritik genel ilkeler vardır. (Laboratuarında yaklaşık 20-30 dk) mümkünse ameliyat süresi kısaltılmalıdır. Ameliyat öncesi ve sonrası açlık gereksizdir. Aslında, uzun süreli açlık (> 1 gün) zararlı olabilir. Cerrahi en iyisini cerrah tarafından yapılır. Bir asistan fareler uyutmak ve Surg kaynağı yardımcı olabilirnik malzemeler. Cerrah düzgün mikrocerrahi eğitimi sürece bir mikroskop gerekli değildir. Aksi takdirde Cerrahi süresi daha uzun ve bu yüzden, gerekli sonrası hayatta kalma potansiyel olarak daha kötü olabilir daha olma eğilimindedir.
Bu prosedürler, önceki yayınlarda kullanılmıştır ve tatmin edici sonuçlar yarattı. Vahşi tip ve genetik olarak tadil edilmiş fareler kullanılarak, NFKB ve Nrf2 yollar gastroözofageal reflü 11,12 boyunca yemek borusu epitelindeki bariyer fonksiyonunu regüle olduğunu göstermiştir. Ancak, biz bunun yerine, bu farelerde tam gelişmiş Barrett yemek borusu ya da adenokarsinomu üretmek mümkün değildi müsinöz hücreleri ve skuamöz hücreli karsinom 9 uyarılmış edildi dağınık. Fare yemek borusu ve insan yemek borusu arasındaki histolojik farklılıklar Barrett özofagus ve özofagus adenokarsinomu üzerine araştırma bu cerrahi modellerin doğal sınırlamalar olabilir.
Biz bu SU inanıyorumrgical modeller GERD ilgili çalışmaları için de faydalıdır. Genlerin ve moleküler yolların fonksiyonları GÖRH moleküler mekanizmalarını anlamak ve mekanizma bazlı tedavi geliştirmek için açıklığa edilebilir. Barrett özofagus ve özofagus adenokarsinomu üretmek için kullanıldığında, genetik değişiklikler reflü cerrahisi ile birlikte ihtiyaç duyulacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
