Protocol
Процедуры, связанные с животными предметы были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) на Университета Содружества Вирджинии в общем и придерживаться Руководства NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Подготовка инвентаря До хирургии и микроинъекции
- Настройка для подготовки материала:
- Получить 26 г канюли трубку, 33 г запирательную провод, 33 г микроинъекций иглы трубки, microinjector пластиковые трубы (PE20 или эквивалент), два средних вес прямые кровоостанавливающих, лаборатория ленты, линейки, постоянный маркер, 70% этанола (об / об), хранения флаконы (например, 20 мл стекло сцинтилляционных), супер клей, маленькие весят лодки, и ротационный инструмент оснащен без тяжелых отрезным диском.
Примечание: Обеспечение ротационный инструмент в пипетки коробке, используя ремни или ленты является полезным, поскольку он поднимает инструмент. Ношение защиты глаз имеет важное значение для предотвращения травм при использовании роторного инструмента. - Приложите кусокиз лаборатории или в автоклаве ленты на скамейке.
- Получить 26 г канюли трубку, 33 г запирательную провод, 33 г микроинъекций иглы трубки, microinjector пластиковые трубы (PE20 или эквивалент), два средних вес прямые кровоостанавливающих, лаборатория ленты, линейки, постоянный маркер, 70% этанола (об / об), хранения флаконы (например, 20 мл стекло сцинтилляционных), супер клей, маленькие весят лодки, и ротационный инструмент оснащен без тяжелых отрезным диском.
- Подготовка канюли:
Примечание: По крайней мере, два канюли требуется на крысу для двустороннего инъекции. Один дополнительный канюли будет использоваться на более позднем этапе.- Приобретение раздел канюли трубы достаточной длины, чтобы избежать изгиба в процессе маркировки, резки.
- Нарисуйте 15 мм опорной линии на ленте с шага 1.1.2, используя ручку с острым концом. Это будет служить в качестве руководства для маркировки последовательных 15 мм секций на трубки, используя острый постоянный маркер.
- Сенсорный трубки канюли, в отмеченных точках, с медленным спиннинг отрезным диском вращающегося инструмента для того, чтобы засечь трубки. Поверните канюлю 180˚ и засечь противоположную сторону трубки. Не прорезать трубы полностью, потому что это может привести к окклюзии.
- Резко согните трубки для того, чтобы разорвать его в ~ 15 мм секции.
- Удержание каждого среза конец канюли перпендикулярно отсечкидиск между большим и указательным пальцами. Поверните трубку канюли, касаясь кончиком к большому передней поверхности светотеневой диска (т.е., не край). Это создаст притупляются наконечника. Примечание: Не сгибайте катетер, для этого может дать инъекцию пределы участка.
- Реам оба конца канюли с 26 г скошенный иглы (коричневый концентратор), чтобы убедиться, что все заусенцы были удалены, и, что канюля препятствий.
- Передайте образец разреза обтуратор проволоки до ~ 35 мм через разрез канюли, чтобы проверить, что там нет внутренних препятствий.
- Возьмите каждый по отдельности, используя канюли unclamped кровоостанавливающих и измерить каждый заполненный канюли с линейкой для того, чтобы именно 14 мм в длину.
- Подготовка обтураторами:
- Зажмите один канюли примерно половина длины со средней массой, прямых кровоостанавливающих. Положите запертую кровоостанавливающего на скамейке. Канюля должна быть перпендикулярна к скамейке.
Примечание: Эта канюлиНе следует использовать в операции после того, как проводится заблокированных кровоостанавливающих, поскольку вероятно согнуты. - Поток один конец провода в запирательного канюли, пока он не достиг скамейки. Отказов провод в канюлю чтобы гарантировать, что бор не давая ему достичь скамейки;. Т.е. достижении нижней канюли. Правильное длина обтуратор будет предотвратить засорение и дополнительные ткани рубцов.
- Согните провод, зажимая пальцами до тех пор, 30˚ угол ~ не достигается при сохранении контакта между запорной и скамейки. Убедитесь, что угол изгиба такой, что он лежит на одном уровне с головкой, и избыток обращен вперед, что делает его более трудным для крысы, чтобы удалить.
- Снимите провод от канюли и отрезать лишнюю часть на ~ 2,5 мм от изгиба с небольшими диагональными резцов (фрезы) провода.
Примечание: По крайней мере два обтураторы потребуется на крысу для двусторонней инъекции, так как каждый имплантировали канюли требует обтуратор. Созданиедополнительный ~ 35˚ изгиб на полпути через обтюратор также помочь в предотвращении удаление животным. Хранить как канюли и обтураторов в отдельных ампулах (например., 20 мл стекл нный сцинтилл ционный), содержащие 70% этанола (об / об) до использования, но по крайней мере O / N.
- Зажмите один канюли примерно половина длины со средней массой, прямых кровоостанавливающих. Положите запертую кровоостанавливающего на скамейке. Канюля должна быть перпендикулярна к скамейке.
- Подготовка и тестирование микроинъекторы:
- Получить кусок трубы иглы microinjector, что составляет ~ 1 м.
- Держите один конец трубки microinjector перпендикулярно с заблокированных прямых кровоостанавливающих.
- Твист кровоостанавливающего, сохраняя напряжение на трубке, чтобы катушка плотно вокруг кровоостанавливающего, по крайней мере один раз.
- Измерьте 32 мм от противоположной, свободный конец трубки microinjector и понять эту точку перпендикулярно второй раз подряд, средний вес кровоостанавливающего и заблокировать их. Возьмитесь трубки microinjector с кровоостанавливающих на стороне 32 мм отметить ближе к свободному концу, а не на стороне, ближайшей к кровоостанавливающего с раневой проволоки.
- Бенd трубки и обратно, сохраняя напряжение на трубке, пока она не сломается.
Примечание: Один, острый вверх и вниз изгиб будет производить тупой разрыв, что желательно, чтобы гарантировать, что микроинъекции происходит в требуемой области головного мозга. - Осмотрите microinjector трубки для того, чтобы оба конца прямой и что внутренний диаметр препятствий.
- Приобретать канюли трубку, которая будет использоваться для производства microinjector воротник.
- Измерьте и отметьте последовательные 5 мм секции канюли трубки с помощью перманентным маркером и 5 мм справочную линию, проведенную на ленту (шаг 1.1.2).
Примечание: Каждый microinjector требуется один воротник. Ошейники просто короткая канюли придерживался microinjector проволоки. - Нажмите канюли трубку, в отмеченных точках, с медленным спиннинг светотеневой диска вращающегося инструмента для того, чтобы засечь трубки. Поверните канюлю 180˚ и засечь противоположную сторону трубки. Резка полностью закрывают может трубку.
- Резкоизгиб microinjector воротник трубки для того, чтобы разорвать его в ~ 5 мм секции.
- Ream внутренний диаметр обоих концах воротника с 26 г скошенный иглы (коричневый концентратор), чтобы гарантировать, что большинство из заусенцев были удалены. Некоторые небольшие заусенцы захватить microinjector провод и, таким образом, помочь в склейке.
- Слайд один воротник на каждый microinjector трубки ~ 2 см от конца.
- Создать небольшой бассейн супер клей в углу небольшой взвешивании лодки.
- Использование лома канюли трубы резать до ~ 25 мм, чтобы применить небольшое количество клея высшего к microinjector трубки ~ 5 мм от одного конца. Далее, вставьте воротник над этой супер клея по так, чтобы она ~ 1 мм от конца трубы микроинъекции. Обложка оба конца воротника с клеем.
Примечание: Избегайте большое скопление супер клей на воротнике, как это будет препятствовать пластиковые трубы из уплотнения вокруг microinjector. Хотя важно, чтобы избежать супер клей на открытом конце трубки microinjector, как это сделаетmicroinjector непригодным, важно также, чтобы скользить воротник как можно ближе к концу, чтобы минимизировать пустот (не вводили) объем. - Lean заполненную microinjector на внешней другом небольшом взвешивании лодки со стороной воротника вверх и дать высохнуть в течение 24 часов.
- Получить ~ 8 см кусок microinjector пластиковой трубки (PE20 или эквивалент), 1 мл шприц, наполненный стерильной водой, и 26 г скошенный иглы (коричневый концентратор).
- Прикрепите 26 G (коричневый) ступица иглы шприца и сдвиньте вырезать трубки на иглу, обеспечивая не проколоть трубу.
- Слайд пластиковые трубы над воротником конце высушенной, полной microinjector.
- Сожмите заполненный водой шприца, чтобы проверить на проходимость.
Примечание: Вода должна распылять очень далеко и прямо из кончика microinjector. Если поток не прямо, место инъекции не будет правильным. Источник боковом или диффузного спрей является плохим брейк (шаг 1.4.5). Microinjector должны нет быть использованы, если спрей боком или диффузным. Солевой не должны использоваться, так как это может засорить microinjector или иглу. - Потяните шприц обратно для того, чтобы удалить воду из microinjector. Хранить в сухом, закрытом сосуде, например: 20 мл сцинтилляционный флакон из стекла.
Примечание: микроинъекторы может быть в автоклаве после изготовления с большинством клеев супер, 31, но это должно быть определено эмпирически. Альтернативные методы стерилизации включают этиленоксид и гамма-облучение.
2. Подготовка и Выполнение Микроинъекции
- Получение заполненные микроинъекторы, microinjector пластиковые трубы (PE20 или эквивалент), микроинъекции насос, два небольших вес лодки, стерильную воду, 70% этанол (объем / объем), ацетон, два газонепроницаемые 1 мкл стеклянные шприцы с помощью тупой иглы (25 г), хлопок наконечником аппликаторы деревянные, запасные обтураторов, 1 мл шприц, 26 г (коричневый хаб) игла, маленькие изогнутые щипцы (стиль # 7 рекомендуется), и лаборатория жIPES.
- Подготовка микроинъекторы для инъекций:
- Согните завершена microinjector 15 мм от конца напротив воротник так, что угол между ними составляет ~ 95˚.
Примечание: Точная изгиб расположение необходимо для точного местоположения инъекции. Использование # 7 щипцы (или аналогичный), чтобы захватить microinjector и изгиб вверх полезно. Всегда повторно измерить длину перед выполнением микроинъекций. - Разрежьте пластиковую трубку (PE20) до ~ 70 см и слайд над microinjector воротником.
Примечание: Добавление ленты вкладки в одной пластиковой трубки около как microinjector и свободный конец полезно при заполнении инъекции, особенно при введении два различных решения. Вкладки не рекомендуется для обеих трубках, как они становятся громоздкими во время инъекции.
- Согните завершена microinjector 15 мм от конца напротив воротник так, что угол между ними составляет ~ 95˚.
- Подготовка насос для микроинъекций:
- Включение насоса.
- Установите диаметр иглы микроинъекции, требуемую скорость инфузии, и цель объем впрыска.
Примечание: настой крысуе и объем инъекции зависит от экспериментальных требований. Это подробно рассматриваются в дискуссии. Некоторые насосы имеют шприцев таблицы предварительно загружены. Если нет, то таблица шприц можно найти на веб-сайте (ы) производство. - Установите режим насоса на «Том», так что точный объем поставляется автоматически. Если режим «Насос» выбран вместо этого, экспериментатор должен вручную остановить насос.
- Отрегулируйте обратного хода насоса, чтобы шприц, чтобы заполнить объему впрыска плюс еще 0,2 мкл.
- Подготовка микроинъекции шприц и microinjector для инъекций:
- Блокировка каждый герметичное микроинъекции шприц в стойке микроинъекции насоса.
- Поместите кончик шприца герметично в стерильной воде, содержащейся в небольшой вес лодки и осторожно флаттера поршень смазывать внутреннюю проволоку. Равномерно потянуть поршень обратного хода на насосе для заполнения водой.
- Слайд трубы PE20, который совместноnnected к microinjector (на этапе 2.2) на 26 G (коричневый) ступицы иглы, прикрепленной к 1 мл шприца, который заполнен стерильной водой. Спрей стерильную воду через microinjector и проверить распыла и расстояние.
Примечание: Вода должна распылять очень далеко и прямо из кончика microinjector. Если поток не прямо, место инъекции не будет правильным. - Поместите стерилизовать microinjector на стерильной области.
- Слайд трубы от иглы, держа трубку microinjector вертикальном положении для предотвращения воды из капает, а также резки трубки ниже области поврежденной иглы.
- Нажмите микроинъекции шприца немного вперед, чтобы создать капли на конце иглы и слайд PE20 трубок заполненный водой (который подключен к microinjector) на иглу.
Примечание: Это создаст соединение жидкость-жидкость, которая позволит соответствующее противодавление, что может выбить помеху, которая может сформировать наверхушка microinjector. - Надавите на поршень полностью вперед, чтобы подготовиться к нагружения образца и убедиться, что никаких следов этанола остается в microinjector.
- Проверьте настройку на герметичность путем прикосновения капли воды, образовавшуюся на кончике microinjector на чистую лаборатории стереть несколько раз.
- Примечание: При нажатии в лабораторию протрите, только один мокрое пятно должно сформироваться. Если есть еще капли, есть утечка в системе.
- Избегайте утечек путем контроля супер клей приложение (этап 1.4.14) и обрезки труб PE20 с острыми ножницами или лезвием бритвы любое время, что труба PE20 удаляется из какой-либо связи. Кроме того, повторите шаги 2.4.3 через 2.4.8, чтобы исправить утечки.
- Потяните поршень шприца назад 0,2 мкл; создание пузырь между стерильной воде в PE20 трубок / microinjector и раствор для инъекций.
- Примечание: Этот пузырь предотвращает разбавление инжекционной, загрязнение воды, и позволяетдля мониторинга процесса впрыска, так как она будет двигаться во время инъекции. Один твердый пузырь должен быть произведен. Если это работает, утечка присутствует или наконечник microinjector окклюзии; указывая, что шаг 2.4.8 (и прилагаемого к сведению) следует повторить.
- Поместите microinjector в реагент, который будет введен и медленно потяните поршень шприца на блокиратором обратного хода.
- Подготовка животного для инъекций:
- Держите грудь крысы в грудь экспериментатора. Очистка области вокруг канюли с помощью ватного аппликатора, пропитанной в 70% этаноле (об / об).
- Примечание: При правильном обращении, мыши могут быть аккуратно сдержан в Чашевидный стороны. В противном случае, scruffing может потребоваться.
- Удалить обтураторов используя небольшие щипцы и место в весовой лодке с 70% этанола (об / об).
- Выполнение инъекции:
- Поместите наполненный microinjector (шаг 2.4.10) в канюли. Пресс-старт на микроинъекции насоса и движения монитора пузыря.
- Примечание: мау необходимо применить легкое давление к тому, чтобы микроинъекторы не поднять. Пузырь (полученный на стадии 2.4.9) следует равномерно продвигать и полностью ввести в microinjector.
- Удалить из микроинъекторы канюли и заменить обтураторов, когда инъекция завершена, и после инъекции период диффузии прошло.
- Примечание: Типичное время диффузии после инъекции являются 2 - 4 мин для фармакологических реагентов, и 2 - 10 мин на наличие вирусов. Оставив microinjector в течение периода после инфузии предотвращает инжекционной из кип вверх по канюли, а не диффузии в ткани. Место обтураторы на стороне этанола заполненный вес лодки, чтобы позволить стечь этанола, затем вставьте в канюлю.
3. После инъекций Clean Up
- Получить один маленький пузырек каждого: стерильную воду, 70% этанола, и ацетона.
- Очистка microinjector и микроинъекции шприц:
- Удалить стеклянный шприцс от шприца насос стойки и микроинъекции трубки из стекла шприца.
- Отключите трубки microinjector из стекла шприц и присоединить шприц 1 мл, наполненный стерильной водой с трубкой microinjector через 26 G иглы (коричневый хаб). Нажмите 1 мл шприца вперед, чтобы изгнать ~ 0,3 мл. Далее, коснуться кончиком microinjector в лабораторию протрите и потяните воздух обратно через microinjector.
Примечание: microinjector и трубки могут быть повторно использованы для подобных экспериментов, если считать разумным. - Поместите стеклянную иглу шприца в стерильной воде и сделать поршень полностью назад. Далее, толкать поршень до упора вперед, чтобы смыть. Сенсорный кончике шприца стекла в лабораторию протрите чтобы гарантировать, что жидкость не остается.
- Повторите шаг 3.2.3 стерильной воды, воздуха, 70% этанола, и ацетона в следующем порядке: стерильной воды, стерильной воды, воздуха, воздух, 70% этанола, 70% этанола, воздуха, воздух, ацетон, ацетон, воздуха, воздух. Выполнение всех этих шагов очистки поможет сохранить микроинъекции шприц.
- Поместите microinjector шприц (ы) в упаковке и потяните поршень назад до 0,05 мкл.
Примечание: Это важно, так как позволяет поршень для толкают или тянут, чтобы выбить застрявший поршень, который может произойти должно либо солевые отложения образуют после хранения.
4. Программирование мотивации анализе
- Вход в графический государства с правами администратора.
- Выберите или создайте соответствующую базу данных.
- Создание прогрессивного график армирования:
- Выберите Списки Списки> на уровне базы данных> Прочие Списки Переход параметра.
- Выберите "Добавить". Введите соответствующий номер в списке (L #) и описание.
- Выберите "Добавить События".
- Введите первое значение подкрепления и выберите "Добавить". Повторите.
Примечание: Значения могут быть определены с помощью формулы, где прогрессивная графика отношение = 5e (J * (подкрепление заработанные + 1)) -5 7.Для того, чтобы адаптировать это уравнение правильно проверить гипотезу, значение J должны быть определены эмпирически или полученные из литературы. - Выберите "В Порядке в окне" порядок выбора '.
- Выберите "Держите значение = к: ____" в поле ", когда закончите». Введите значение подкрепления в текстовое поле, что далеко превышает ожидаемого реагирования. Это будет необходимо усилие для всех последующих записей, как только список был исчерпан.
- Создание экспериментального протокола:
Примечание: Графический государство движется предмет через ряд состояний, которые вышли на основе времени или критериев эффективности. Установите все дискретные сигналы и контекстные и параметры, отмеченные ниже как '$' надлежащим проверить гипотезу под следствием.- Выберите Файл> Создать эксперимент протокол.
- Введите нужный номер протокола и описание в соответствующем текстовом поле. Выберите "Государственная Создание '.
- Установите все стимулы как для 'RDY - Готов государства' и 'FIN - готовая государства ».
- Выберите "Новый государство" и назовите его "S2 - PR Отвечая.
- Выберите "Новый государство" и назовите его "S3 - PR подкрепления и Cue.
- Выберите "Новый государство" и назовите его "S4 - Тайм-аут".
- Выделите 'S1' и имя его "S1 - Привыкание.
- Выберите Добавить 'Time To Go ".
- Введите соответствующее время ($) и единицы ($), например., Минут и выберите 'S2' с К S выпадающего списка. Была определена единица времени "единиц", когда база данных была первоначально создана.
Примечание: Созданный время перехода должны читать аналогична [После $ мин GO P = 100%, до S2] На фиг.1 показан пример этого события После создания.
</ OL>
Рисунок 1. Представитель Пример программирования # 1. В этом случае время, разделенных состояние показано на котором определенный пользователем значение $, показано здесь в минутах, указывает, когда текущее состояние должно выйти в состояние 2 (S2).
- Выделите 'S2 - PR Отвечая.
- Выберите Добавить "Событие Перейти."
- Введите имя списка, содержащий прогрессивный график соотношения, который был создан в шаге 4.3 в первом текстовом поле, как L $ (например, L1), выберите соответствующий operandum (например., Рычаг или нос совать) от первого выпадающего списка, и выберите пункт " S3 »от S К выпадающем списке.
Примечание: событие создается можете прочитать похож на [Если L $ 1 - активный GO P = 100%, до S3]. Идентификатор 1 - Активный был назначен во время создания базы данных. Здесь 1 - Активныйимеет в виду operandum подключен к коммутатору одного. - Выберите "Добавить Time To Go".
- Флажок 'R', введите соответствующее время и единицы измерения ($), и выберите пункт "FIN" из К S выпадающем списке.
Примечание: событие создается раз можно прочитать похож на [R (проверено), если $ минутах GO Р = 100%, К FIN]. Это будет гарантировать, что сессия закончится, если нет активности в этом operandum после установленного порога; т. Е, заседание будет таймаут после животное удерживает отвечать на подкрепление-парные operandum для заданного периода времени. - Выберите Добавить "Событие Перейти."
- Установите флажок 'R', введите 1 в первом текстовом поле, выберите выпуск соответствующей operandum с первых выпадающем списке, и выберите "S2" с К S выпадающего списка.
Примечание: событие создается можете прочитать похож на [R (проверено) за $ [1] Активный ГО Р = 100%, до S2]. Этот шаг гарантирует, что при освобождении operandum(указывается скобках выше), что государство вернулся, таким образом, сброс порог тайм-аута сессии (4.4.9.4). В этот момент, государство будет выходить, когда прогрессивное отношение содержится в списке завершается (шаг 4.4.9.2) или раз сессии OUT (Шаг 4.4.9.4). Таким образом, каждый раз, когда operandum активирована, она рассчитывает к прогрессивной соотношении. . И каждый раз, когда operandum инактивируется; например, рычаг освобождается и нос совать выходе, порог тайм-аута сеанса (этап 4.4.9.4) сбрасывается Рисунок 2 представляет все переходы, запрограммированные для 'S2 - PR отвечает.. "
Рисунок 2. Представитель Пример программирования # 2. Здесь государство вышла на одно из двух критериев. L $ является прогрессивным график соотношения, созданный на шаге 4.3. По расписанию Completион, государство выходит в состояние 3 (S3). Обратите внимание, что этот критерий не имеет R, что позволяет график, чтобы перейти, а не начала снова при каждом входе в атмосферу в этом состоянии. Государство может также выйти после '$' минут заявить FIN. Это заданное пороговое истечении которого сеанс не завершится, если не отвечает происходит в течение этого окна. Это объясняется далее в дискуссии. Наконец, порог тайм-аута Сессия сбрасывается на каждом выпуске operandum. Таким образом, "[1]" указывает, выпуск operandum "1".
- Выделите "S3 - PR подкрепления и Cue.
- Выберите "Добавить время выйти на"
- Введите соответствующее время и единицы для доставки подкрепления ($), и выберите "S4" с К S выпадающего списка.
Примечание: событие создается раз можно прочитать в [похожа После $ секунд GO P = 100%, до S4].
- Выделите 'S4 - Тайм-аут ".
- Введите соответствующее время и единицы оставаться в неактивном состоянии ($) после родов подкрепления, и выберите 'S2' с К S выпадающего списка.
Примечание: событие создается раз можно прочитать в [похожа После $ секунд GO P = 100%, до S2]. Государство "S4 - Тайм-аут" не может быть обязательным для всех конструкций.
Примечание: Этот протокол готов к запуску.
Representative Results
Здесь мы иллюстрируют примеры результатов, которые можно получить с описанной выше процедуре. На первых типичный область, которая трансфецируют вирусных векторов (Рисунок 3). В общем, трансфицировали объем ~ 1 мм 3 получают в полосатой ткани. Объем трансфицированных области может быть определена количественно между серийных срезов с использованием метода Кавальери 32 Важно отметить, что объем трансфицировали зависит от многих факторов, таких как тип ткани быть трансфицированных. вирусная серотипа; промоутер; Скорость и объем вводят; число частиц инжектированных; инжекционной рН; и является ли гиперосмолярные реагентов, таких как маннит, были использованы. 33,34 Обычно мы microinject 10 12 частиц / мл, 1 мкл / боковые течение 10 мин, и позволяют 7 дополнительное минут до замены обтураторов. Кроме того, инжекционной как правило, около рН 8. Далее, мы показываем, что мотивация может манипулировать либо экспрессии трансгена (рис 4)или фармакологической микроинъекции реагента (фиг.5).
На рисунке 4, мы выразили Designer рецептор исключительно активированных синтетических наркотиков (DREADDs). Рецептор-кодирующей области DREADD последовало вхождения рибосом сайта и кассеты mCitrine. MCitrine обеспечивает удобный визуализации трансфицированных клеток. DREADD был соединен с гетеротримерного G-белком Gαq. Активация Gαq-сочетании DREADD может стимулировать астроциты, 28,35 и сам DREADD может быть активирован при системном введении клозапина-N-оксида (CNO, 3 мг / кг, внутрибрюшинно). 14,22,36 Крысы были обучены Рычаг реагировать на этанол арматуры, где 3 рычага прессы уступил 1 шанс пить во время ежедневных сессий 1 ч за 60 дней непрерывных. Далее, крысы были вынуждены в воздержании, и были выражены Gαq-сочетании DREADDs в прилежащем ядре основные астроциты. Через 3 недели воздержания, мотивация к самостоятельной Admi Нистер этанола измеряли останова. 21,27-30 Активация прилежащем ядре основные астроциты, с помощью системного введения СМО, снижение мотивации у крыс возобновить этанола самоуправления после воздержания по сравнению с транспортного средства. Важно отметить, что CNO не имели никакого эффекта в столь квалифицированного контингента, который был, выражающей зеленый флуоресцентный белок вместо DREADD.
Рисунок 3. Представитель вентральной полосатой область трансфецируют микроинъекции вирус. Это изображение иллюстрирует область прилежащего ядра астроциты, которые были трансфицированных следуя выше метод. Данные перепечатана из Bull и др. 13 с разрешения владельца авторских прав. Подробности можно найти в этой публикации и сопутствующего дополнительного материала.пустым "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Мотивация крыс самовведению этанола уменьшить, включив трансген, который был сверхэкспрессируется в прилежащем ядре основные астроциты. Вирус был микроинъекции и мотивация измеряется с помощью точки останова после учета одной недели вирус выразить. Трансген выразил был дизайнер рецепторов исключительно Активированный дизайнер наркотикам (DREADDs). Односторонний ANOVA (F (2,30) = 3,29, р = 0,04), а затем Scheffe ретроспективном показали, что активация DREADD при системном введении клозапина-N-оксид (CNO, 3 мг / кг, внутрибрюшинно ) значительно снижается мотивация крыс самовведению этанола после воздержания по сравнению с носителем CNO не имели никакого эффекта в столь квалифицированного контингента, который был, выражающей зеленый флуоресцентный белок (GFP) вместо DREADD. Данные перепечатана из Bull и др. 13 с разрешения владельца авторских прав. Подробности можно найти в этой публикации и сопутствующего дополнительного материала.
Рисунок 5. Микроинъекция щелевых блокаторов увеличили мотивацию крыс самовведению этанола после воздержания Два блокаторы щелевых оценивали по их влиянию на мотивацию (измеряется с помощью точки останова) крыс самовведению этанол:. Мефлокин и 18- альфа-кислоты (глицирретиновая 18-а). Двусторонний ANOVA показал, что микроинъекции разрыв спая блокаторов в прилежащем ядре ядро увеличило мотивацию крыс самовведению этанола после воздержания (F (3,40) = 5,56, р = 0,003). Данные перепечатана из Bull и др. 13 с разрешения владельца авторских прав. Подробности можно найти в этой публикации исопровождающий дополнительный материал.
Discussion
Процедура, представленная здесь является эффективным средством для производства микроинъекции канюли и микроинъекторы, которые помогут в выяснении молекулярных субстратов мотивированного поведения. Этот метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, производство собственных имплантатов и микроинъекторы, новые экспериментальные параметры могут быть быстро оптимизированы, то есть, никто не нужно ждать на заказ компонентов, чтобы прибыть. Во-вторых, из-за малого диаметра канюли, более канюли могут быть одновременно имплантированные. Это сокращает требуемое время хирургического, что может улучшить выживаемость, а также позволяет использовать несколько имплантатов на одно животное. В-третьих, программное обеспечение, используемое для управления рабочих камерах легко вмещает прогрессивные графики соотношение так фиксированное соотношение парадигма может быть быстро превращается в прогрессивный соотношение парадигмы простым применением список событий перехода параметр, который содержит нужную подкрепления.
Бытьшироко полезным, общий порядок микроинъекции был представлен, который должен быть широко применимы для микроинъекции почти любой реагента в настоящее время. Следовательно, мы ожидаем, что эта техника будет по-прежнему подобного высокой полезности в будущем с небольшой модификацией. Изменяя только несколько переменных, этот подход может быть применен к широкому ряду реагентов. Параметры, которые наиболее часто манипулировать включают длину, что microinjector выступает из канюли, объем инъекции, и скорость инъекции. Например, может быть желательным инжектор, чтобы выступать дальше от наконечником канюли, чтобы избежать глиальных шрам, который, как правило, формируется вокруг хронических имплантатов. Кроме того, можно пожелать, чтобы придать больший объем. Для полосатого тела вируса микроинъекций, объем 1 мкл обычно используется и этот объем обычно впрыскивают в течение более длительного периода времени (часто 7 - 10 мин, плюс 3 - 10 мин дополнительного времени диффузии) по сравнению с использованиемд фармакологических реагентов (обычно 0,3 - 0,5 мкл в течение 2 - 3 мин плюс 1 - 3 мин время дополнительного диффузионного). Пользователь должен проконсультироваться литературу и / или эмпирически определить параметры лучше всего подходят для удовлетворения их потребностей. Несмотря на это, успех этой процедуры является критически зависит от 4 переменных: 1) длины канюли, 2) длины microinjector, 3) качество рисунка microinjector распыления и 4) целостность системы перед инъекцией. Потому что микроинъекции расположение зависит от глубины, что microinjector выступает из канюли, крайне важно, чтобы обе канюли (Шаг 1.2.8) и длина microinjector (после изгиба, шаг 2.2.1) оба точно известно и равномерное между всеми субъектами , Это может быть легко управляется легко отвергая любые осуществить это не требуемая длина на заключительном повторного измерения. Кроме того, место впрыска может быть предсказано, только если оно происходит непосредственно под направляющей канюли. Таким образом, любой microinjector, что ланьы не распыляйте длинный, тонкий поток на тестирование (Шаги 2.4.6) должны быть отклонены. Инъекция качество также связано с целостности системы перед инъекцией. Если после выдачи всю воду из форсунки (перед заполнением с реагентом) множество точек наблюдаются на лабораторном стереть, а затем утечка должна быть устранена (Примечание на Шаге 2.4.8). Кроме того, если пузырь (Шаг 2.4.9), который отделяет препарат из воды в трубке PE20 не один, один пузырь (после заполнения microinjector с реагентом), а затем инжектор Частично забит. Это может засорить либо предотвратить, либо отвлечь инъекции. Это тоже может быть легко исправлено (Обратите внимание на этапе 2.4.8).
Если один желает microinject в то время как животное в стереотаксической рамы имеются три альтернативы. Во-первых, можно было бы увеличить длину microinjector воротника таким образом, что он может быть прочно удерживается стереотаксической манипулятора, а также продлить достаточно далеко, чтобы позволить соединение с PE20 трубок. Во-вторых, нае могли временно внедрить канюлю и использовать стандартный microinjector представленные здесь. В-третьих, можно использовать обращается и полированные стеклянные пипетки. 16,17
Существенным недостатком процедуры, представленной здесь является то, что лучше всего проводить в хорошо обработанных крыс, которые знакомы с процедурой. Крысы, используемые для данных, описанных в разделе результатов не требуется никаких специальных процедур обработки, потому что тот же следователь обрабатываются крыс ежедневно в течение 2 месяцев. Это включало ежедневное наблюдение и манипуляции с хирургической имплантации в течение по меньшей мере 2 недель. Тем не менее, крысы, могут быть быстро привыкли рядом методов, которые используются для до предварительно импульса анализа ингибирования, которая может зависеть от напряжения. Эти специальные методы привыкания были хорошо описаны ранее. 43 В дополнение к этим процедурам, желательно, чтобы крысы привыкли быть в порядке микроинъекции, где укороченные микроинъекторы используются дукольцо "фиктивных" инъекции. Во время этих фиктивных инъекций, важно, что microinjector не выступают в ткани для того, чтобы ограничить повреждение тканей. В не Иными словами, microinjector должны быть согнуты не более 14 мм. Таким образом, тщательное привыкание требуется для оптимальной реализации этого метода можно рассматривать как ограничение.
В то время как несколько поведенческих парадигм существуют, чтобы измерить мотивацию, прогрессивный коэффициент обычно используется для количественной оценки усилий, что субъект готов оказать получить подкрепления. Прогрессивная отношение парадигма производит измерение, известное как точки останова, которая часто определяется как максимальное количество рычагов прессов в последний завершенный отношение;., Т. Е, максимальная отвечать, что породил подкрепления 21 Прогрессивная отношение чувствительны к подкрепления величину. Например, выше, кокаин (или сахарозы) дозы вызывают более высокий останова и нижнюю кокаин (или сахарозы) дозы дают более низкую breakpoint. 21,22 Таким образом, точка останова является регулярно использовать прокси-сервер для мотивации и / или армирующего эффективности. 21,23-26 Поскольку намерение останова, чтобы определить, когда животное перестает отвечать на запросы, важным параметром прогрессивным отношением парадигмы Длина сессия. Конечные длины сессия может поставить ложный крышку останова значений, и это может быть усилено предварительной обработки, что аномально уменьшить скорость самоуправления или иного увеличение после армирования паузы. Это тупик можно преодолеть любое количество подходов;.. Например, сессий, что прекратить, когда животное удерживается отвечать некоторым кратного среднего интервала между инфузии 44 Более широко применяется вариант этого подхода заключается в прекращении сессий раз отвечая имеет был удержан некоторой эмпирически определенной величины, которая проводится постоянная по предметам. Мы предоставили метод применять этот подход в шаге 4.4.9.11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
References
- Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
- Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
- Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
- Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
- Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
- Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
- Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
- Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
- Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
- McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
- Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
- Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
- Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
- Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
- Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
- Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
- Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
- Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
- Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
- Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
- Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
- Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
- Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
- Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
- Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
- Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
- Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
- Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
- Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
- Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).
