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動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

doi: 10.3791/53018 Published: September 16, 2015

Protocol

動物を対象とする手順は、バージニア・コモンウェルス大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドを遵守されています。

手術前とマイクロインジェクションに実装しの調製

  1. 材料の準備のために設定します。
    1. 26 Gカニューレ管、33のG栓子線、33 Gマイクロインジェクション針チューブ、マイクロインジェクターのプラスチックチューブ(PE20または同等)、2培地重量ストレート止血剤、ラボのテープ、定規、恒久的なマーカー、70%エタノール(v / v)で、ストレージを取得小さ ​​なバイアル例えば、20mlのガラスシンチレーション)、スーパーグルーは、ボートの重量を量ると、回転工具は、非ヘビーデューティカットオフディスクを装備。
      注:このツールを上昇として、ストラップやテープを使用してピペットチップボックスに回転工具の確保は、便利です。目の保護具を着用する回転工具を使用する際に負傷を回避するために重要です。
    2. 作品を添付ベンチに研究室やオートクレーブテープの。
  2. カニューレの調製
    注:少なくとも二つのカニューレは、二国間の注入のために、ラットごとに必要とされます。一つの追加のカニューレは、後のステップで使用されます。
    1. マーキングおよび切断プロセスの間に曲げないように十分な長さのカニューレ管の部分を取得します。
    2. 先の細いペンを使用して、ステップ1.1.2からテープ上の15ミリメートルの基準線を描画します。これは、シャープな恒久的なマーカーを使用して、チューブの連続的な15ミリメートルのセクションのマーキングのためのガイドとして機能します。
    3. チューブをノッチするために、回転工具の遅いスピニングカットオフディスクに、マークされた箇所で、カニューレチューブをタッチします。カニューレを回転させ180˚、チューブの反対側ノッチ。それは閉塞につながる可能性があるため、完全にチューブを切断しないでください。
    4. 急激〜15ミリメートルのセクションにそれを壊すためにチューブを曲げます。
    5. カットオフに垂直にカニューレの各カットの端を持ち親指と人​​差し指の間の椎間板。カットオフディスク( すなわち 、ないエッジ)の大規模な前方表面に先端を触れながら、カニューレチューブを回転させます。これは、鈍い先端を生成します。注:それはオフサイトの注入をもたらす可能性があるため、カニューレを曲げないでください。
    6. 連26 Gベベル針(ブラウンハブ)とカニューレの両端には、すべてのバリが削除されていることを確認し、カニューレは障害物がないこと。
    7. 内部障害物がないことを確認するために、切断されたカニューレを通して〜35ミリメートルに栓子ワイヤーカットのサンプルを渡します。
    8. アンクランプ止血剤を使用して、個別に各カニューレをピックアップし、それが正確に長さが14ミリメートルであることを確実にするために定規で完了した各カニューレを測定します。
  3. 栓子の調製
    1. 1カニューレの媒体重量、ストレート止血剤と、約半分の長さを固定します。ベンチにロックされた止血剤を置きます。カニューレはベンチに垂直でなければなりません。
      注:このカニューレそれは可能性が曲がっているように、ロックされた止血剤によって保持された後の手術では使用しないでください。
    2. それはベンチに到達するまで、カニューレに閉鎖ワイヤの一端を養います。バリは、ベンチに到達することを防止されていないことを確実にするために、カニューレワイヤバウンス; すなわち 、カニューレの底部に到達します。適切栓子の長さが目詰まりし、さらなる組織の瘢痕化を防ぐことができます。
    3. 屈曲栓子とベンチとの間の接触を維持しながら〜30˚角度が達成されるまで、指でつまんでワイヤ。曲げの角度は、それがヘッドキャップと面一に産む、過剰は、それが困難ラットが削除できるようにすること、前方に直面しているようなものであることを確認してください。
    4. カニューレからワイヤーを外し、小さな斜めのカッター(ワイヤーカッター)と曲げから〜​​2.5ミリメートルで余分な部分をカット。
      注:各移植カニューレは、栓子を必要とする少なくとも二つの栓子は、二国間の注入のために、ラットごとに必要になります。作成栓子を通じて追加〜35˚屈曲部の中間には、動物による除去を防止するのに役立ちます。 ( 例えば 、20mlのガラスシンチレーション)別々のバイアルにカニューレと栓子の両方を保管し、使用するまで70%エタノール(v / v)で、しかし少なくとも、O / Nを含みます。
  4. 準備とmicroinjectorsのテスト:
    1. 〜1メートルの長さであるマイクロインジェクターの針管の一部を取得します。
    2. 垂直ロックストレート止血剤とマイクロインジェクターチューブの一方の端を持ってください。
    3. 止血剤を少なくとも1回の周りにしっかりとそれをコイルにチューブにテンションを維持しながら止血剤をねじります。
    4. マイクロインジェクターチューブの反対側の、緩い端から32ミリメートルを測定し、第二の直線、中量の止血剤と垂直にこの点を把握し、それらをロックします。巻線との止血剤に最も近い緩い末端に最も近い32ミリメートルマークの側にではなく側の止血剤とマイクロインジェクターチューブをつかみます。
    5. ベンチューブ上の張力を維持しながらDチューブが前後にそれが破断するまで。
      注意:単一の鋭い上向きと下向きの曲げはマイクロインジェクションが必要な脳の領域で発生することを確実にすることが望ましい鈍いブレー​​クを生成します。
    6. 両端がストレートと内径に障害物がないことであることを保証するために微量注入チューブを点検します。
    7. マイクロインジェクターカラーを製造するために使用されるカニューレチューブを取得します。
    8. 油性マジックテープ(ステップ1.1.2)に描かれた5ミリメートル基準線を使用して、カニューレ管の連続5ミリメートルのセクションを測定し、マークします。
      注:各マイクロインジェクターは、一つ襟が必要です。首輪は、マイクロインジェクターの配線に付着し、単に短いカニューレあります。
    9. チューブをノッチするために、回転工具の遅いスピニングカットオフディスクに、マークされた箇所で、カニューレチューブをタッチします。カニューレを回転させ180˚、チューブの反対側ノッチ。完全にカットすると、チューブを閉塞することができます。
    10. 鋭く〜5ミリメ​​ートルのセクションにそれを壊すために、曲げマイクロインジェクターカラーチューブ。
    11. バリのほとんどが削除されていることを確認するために、26 Gベベル針(ブラウンハブ)とカラーの両端の内径を連。いくつかの小さなバリがマイクロインジェクター線をつかむため、接着に役立ちます。
    12. 端から〜2センチメートル各マイクロインジェクターチューブに1カラーをスライドさせます。
    13. 小さな計量ボートの隅にスーパーグルーの小さなプールを作成します。
    14. マイクロインジェクターチューブにスーパー接着剤の少量を適用するために〜にカットさ25ミリメートルをスクラップカニューレチューブを使用してください〜一端から5mm。それはマイクロインジェクションチューブの端から〜1mmであるように次に、このスーパーグルービーズの上にカラーをスライドさせます。接着剤でカラーの両端をカバー。
      注:それはマイクロインジェクタの周りにシールからプラスチック管を防ぐことができますよう、襟にスーパー接着剤の大規模な蓄積を避けてください。このようになりますように、それは、マイクロインジェクターチューブの開放端部にスーパーグルーを避けるために重要であるがボイド(非注射)量を最小限に抑えることができるように使用できないマイクロインジェクター、それは最後に近いカラーをスライドすることも重要です。
    15. 襟側を上にして別の小さな計量ボートの外側に完成したマイクロインジェクターを傾け、24時間乾燥させます。
    16. マイクロインジェクターのプラスチックチューブ(PE20または同等)、滅菌水で満たした1mlシリンジ、および26 Gベベル針(ブラウンハブ)の~8センチの部分を取得します。
    17. チューブを穿刺しないように確保し、注射器と針の上にカットチューブをスライドさせる26のG(茶色ハブ)の針を取り付けます。
    18. 乾燥した、完全なマイクロインジェクターの襟の端の上にプラスチックチューブをスライドさせます。
    19. 開通性をテストするために水で満たされたシリンジプランジャをつまんで。
      注意:水は非常に遠く、ストレートマイクロインジェクター先端から噴霧する必要があります。ストリームがまっすぐでない場合には、噴射位置が正しくありません。横又は拡散スプレーのソースが悪いブレーク(ステップ1.4.5)です。マイクロインジェクターはずがありませんスプレーは横向きまたはびまん性である場合、Tを使用すること。それはマイクロインジェクターや針を詰まらせるよう生理食塩水は、使用すべきではありません。
    20. マイクロインジェクターから水を除去するために戻ってシリンジを引き出します。 例えば、20mlガラスシンチレーションバイアル、乾燥、密封バイアルに保管してください。
      注意:Microinjectorsは、ほとんどのスーパー接着剤で製造、31の後にオートクレーブ処理することができますが、これは経験的に決定されなければなりません。代替的な滅菌技術は、エチレンオキシド、ガンマ線照射を含みます。

2.準備およびマイクロインジェクションを実行します

  1. 完成microinjectors、マイクロインジェクターのプラスチックチューブ(PE20または同等)、マイクロインジェクションポンプ、小2が船の重さを取得し、滅菌水、70%エタノール(v / v)を、アセトン、鈍針(25 G)を持つ2つの気密1μlのガラスシリンジ、綿は、木製のアプリケーター、予備の栓子、1ml注射器をひっくり返し、26 G(茶色ハブ)針、小さな湾曲した鉗子(スタイル#7を推奨)、およびラボワットIPE。
  2. 注射用microinjectorsの準備:
    1. 2の間の角度が〜95˚となるように、ベンドを15mmカラーと反対側の端部から微量注入を完了しました。
      注:正確な曲げ位置が正確な噴射位置のために不可欠です。 #7鉗子を使用して(または類似の)マイクロインジェクターをつかむために上向きに曲げておくと便利です。常に微量注入を実行する前に長さを再測定します。
    2. マイクロインジェクターカラーの上にプラスチックチューブ(PE20)に~70センチ、スライドをカットします。
      注意:二つの異なるソリューションを注入する場合は特に、注射を完了したときにマイクロインジェクターと緩い両端付近に1プラスチックチューブにテープのタブを追加すると便利です。彼らは注入時に面倒になると、タブは両方の管には推奨されていません。
  3. マイクロインジェクションのためのポンプの準備:
    1. ポンプの電源をオンにします。
    2. マイクロインジェクション針の直径を設定し、所望の注入速度、および注入量を標的とします。
      注:注入ラットe及び注入量は、実験的な要求に依存します。これは議論に上詳述されています。一部のポンプは、シリンジテーブルが事前にロードされています。そうでない場合、シリンジ台は、製造サイト(複数可)に見出すことができます。
    3. 正確なボリュームが自動的に配信されるように、「ボリューム」にポンプモードを設定します。 「ポンプ」モードではなく選択された場合、実験者が手動でポンプを停止する必要があります。
    4. シリンジが注入量に加え、追加の0.2μlに埋めることができるようにポンプバックストップを調整します。
  4. 注射用マイクロインジェクション注射器とマイクロインジェクターの準備:
    1. マイクロインジェクションポンプのラックにそれぞれ気密マイクロインジェクション注射器をロックします。
    2. 小さな計量ボートに含まれる滅菌水に気密注射器の先端を置き、静かに内部配線を潤滑するプランジャーを舞います。均等に水を満たすためにポンプのバックストップにプランジャーを引き出します。
    3. 共同でPE20チューブをスライドさせ滅菌水で満たされている1mlシリンジに取り付けた26 G(茶色ハブ)針に(ステップ2.2)に微量注入にnnected。マイクロインジェクターを通して滅菌水をスプレーし、スプレーパターンとの距離を検査します。
      注意:水は非常に遠く、ストレートマイクロインジェクター先端から噴霧する必要があります。ストリームがまっすぐでない場合には、噴射位置が正しくありません。
    4. 滅菌野に滅菌マイクロインジェクターを置きます。
    5. また、針によって損傷領域の下の管を切断しながら、アウト滴るから水を防ぐため直立マイクロインジェクターチューブを保持しながら、針のオフにチューブをスライドさせます。
    6. 針の上に(それはマイクロインジェクターに接続されている)、針の先端に液滴を作成し、水で満たされたPE20チューブをスライドさせ、わずかに前方にマイクロインジェクションシリンジプランジャーを押してください。
      注:これはで形成することができる詰まりを取り除くことができ、適切な背圧を可能にする液体 - 液体の接続を作成します。マイクロインジェクターの先端。
    7. サンプル負荷のために準備し、痕跡のエタノールをマイクロインジェクタに残っていないことを確認するために、完全に前方にプランジャーを押してください。
    8. 複数回ワイプクリーンラボへのマイクロインジェクターの先端に形成された水滴をタッチすることで漏れのセットアップを確認してください。
  5. 注意:ラボにタッチすると、ワイプ、唯一の湿ったスポットが形成すべきです。より多くの液滴が存在する場合、システムに漏れがあります。
  6. スーパーグルーアプリケーション(ステップ1.4.14)を制御することにより、鋭いハサミやカミソリの刃でPE20チュービングは、任意の接続から削除されていることを任意の時間をPE20チューブをトリミングすることによってリークを避けてください。さらに、繰り返しリークを解決するために2.4.8を介して2.4.3を繰り返します。
  7. バック0.2μLをシリンジプランジャを引いて、 PE20チューブ/マイクロインジェクター及び噴射される溶液中の滅菌水と泡を作ります。
  8. 注:このバブルは、注入液の希釈、水の汚染を防止し、可能に注入プロセスのモニタリングのためには、注入中に移動するからです。シングル、固体泡が生成されるべきです。それが壊れている場合には、リークが存在するか、またはマイクロインジェクターの先端が閉塞され、ステップ2.4​​.8(および添付の注記)が繰り返されるべきであることを示します。
  9. 試薬に微量注入が注入される置き、ゆっくりとバックストップにシリンジプランジャを引きます。
  10. 注射のために動物を準備します:
  11. 実験者の胸に対するラットの胸を押したままにします。 70%エタノールに浸した綿棒を用いてカニューレの周囲をきれいに(v / v)です。
  12. 注:適切な取り扱いにより、マウスを穏やかにカップ状手に抑制することができます。それ以外の場合は、scruffingが必要な場合があります。
  13. 70%エタノールで計量ボートに小さな鉗子と場所を使用して、閉塞具を取り外します(v / v)でした。
  14. 注射の実行:
  15. カニューレ内に充填マイクロインジェクター(ステップ2.4​​.10)を配置します。押して、マイクロインジェクションポンプの起動と気泡の動きを監視します。
  16. 注:ミリアンペアyはmicroinjectorsが持ち上げていないことを確実にするために光の圧力を適用する必要があります。バブル(ステップ2.4​​.9で形成された)が均一に進出し、マイクロインジェクターに入る完全にする必要があります。
  17. カニューレからmicroinjectorsを取り外し、注入が完了すると、注射後の拡散期間が経過した後に、栓子を交換してください。
  18. 注:典型的なポスト噴射の拡散時間は2である - 薬理学的試薬を4分、2 - ウイルスの10分。注入後の期間中に微量注入のままにしておくと、カニューレをバックアップ還流するのではなく組織に拡散するの注入物を防ぐことができます。エタノールで満たされた計量ボートの側の上に置いて栓子は、エタノールがカニューレに再挿入する前に排出できるようにします。

3.注射後のクリーンアップ

  1. 滅菌水、70%エタノール、アセトン:小さなそれぞれのバイアルを取得します。
  2. マイクロインジェクターおよびマイクロインジェクション注射器を清掃:
    1. ガラスシリンジを取り外しガラスシリンジからポンプシリンジラックおよびマイクロインジェクションチューブからの。
    2. ガラスシリンジから外しマイクロインジェクターチューブと26 G針(ブラウンハブ)を介してマイクロインジェクターチューブに滅菌水で満たされた1mlシリンジを取り付けます。 〜0.3ミリリットルを追放するために前方1mlシリンジプランジャーを押してください。次に、ラボ・ワイプとバックマイクロインジェクターを通る空気を引っ張ってマイクロインジェクターの先端に触れます。
      注意:マイクロインジェクターとチューブは、同様の実験のために再利用することができる慎重な対応が必要な場合。
    3. 滅菌水の中にガラスの注射針を置き、完全にバックプランジャーを引きます。次に、フラッシュに完全に前方にプランジャーを押してください。研究室にガラスシリンジの先端をタッチ液体が残っていないことを確実にするために拭いてください。
    4. 次の順序で、滅菌水、空気、70%エタノール、およびアセトンで繰り返しステップ3.2.3:滅菌水、滅菌水、空気、空気、70%エタノール、70%エタノール、空気、空気、アセトン、アセトン、空気、空気。これらの洗浄工程の全てを実行すると、マイクロインジェクションシリンジを保持するのに役立ちます。
    5. パッケージにマイクロインジェクターの注射器(複数可)を配置し、0.05μlに戻ってプランジャーを引きます。
      注:それはプランジャが任意の塩の堆積物は、貯蔵後に形成すべきで発生する可能性が立ち往生プランジャーを除去するために押し引きすることができますので、これは、重要です。

モチベーションアッセイの4プログラミング

  1. 管理者の資格情報を使用して、グラフィックの状態にログインします。
  2. 関連するデータベースを選択するか作成します。
  3. プログレッシブ比率強化スケジュールの作成:
    1. リスト>データベースレベルのリスト>イベントトランジションパラメータリストを選択します。
    2. 選択して「追加」。適切なリスト番号(L番号)と説明を入力します。
    3. 「イベントの追加」を選択します。
    4. 第1の補強スケジュール値を入力し、「追加」を選択します。繰り返します。
      注:値は、プログレッシブ比スケジュール= 5E(J×(補強獲得+ 1))の式を用いて決定することができる-5 7。適切仮説をテストするためにこの式を調整するために、値jは、経験的に決定されなければならないか、または文献から得られます。
    5. 「選択順序」ボックス内の「オーダーで」を選択します。
    6. 「完成した」ボックス内: '____へ=値を保持」を選択します。遠く応答期待超えるテキストボックスに強化スケジュールの値を入力します。これは、リストが使い尽くされた後、以降のすべてのエントリのために必要な努力になります。
  4. 実験プロトコルの作成:
    注意:グラフィック状態が終了したいずれかの時間や性能基準に基づいている一連の状態を経て被写体が移動します。適切に検査中の仮説を検証するために '$'として以下に表示されているすべての離散や文脈手がかりとパラメータを設定します。
    1. 実験プロトコールの作成]> [ファイル]を選択します。
    2. 適切なテキストボックスに目的のプロトコル番号と説明を入力します。 「ステートの作成」を選択します。
    3. ' - レディ状態RDY」と「FIN - 完成状態」の両方のすべての刺激を設定します。
    4. 「新しい国家」を選択し、S2 'という名前を付けます - PRが応答。
    5. 「新しい国家」を選択し、名前を付けS3 ' - 。PR補強およびキュー」
    6. 「新しい国家」を選択し、「S4 - タイムアウト」という名前を付けます。
    7. ハイライト「S1」と名前をS1 ' - 。慣れ」
      1. 追加]を選択し「時間移動]を。」
      2. 、。 例えば 、適切な時間($)と単位($)を入力分、Sにドロップダウンボックスから「S2」を選択します。時間単位「ユニットのデータベースが最初に作成されたときを決定しました。
        注:作成された時間の推移が[$分後にはS2に、= 100%P GO]に似てお読みください。図1は、一度作成されたこのイベントの例です。
    8. </ OL>

    図1
    図1.代表的なプログラミング例#1。この例では状態を区切り時刻を現在の状態が2(S2)を述べることを終了する必要がありますときに数分でここに示されている$、ユーザ定義の値を示しているに示されています。

    1. ハイライトS2 ' - PRが応答。
      1. [追加]を選択します 'イベントどこへ行きますか。」
      2. L $(例えば、L1)として最初のテキストボックスにステップ4.3で作成されたプログレッシブ比スケジュールを含むリスト名を入力し、適切なoperandumを選択します( 例えば 、レバーや鼻突く)最初からは、「ドロップダウンボックス、および選択SにからS3は、「ドロップダウンボックス。
        注意:[L $ 1の場合 - アクティブGO P = 100%を、S3に]作成したイベントは次のように読むことができます。識別子1 - アクティブは、データベースの作成時に指定されました。ここでは、1 - アクティブスイッチ1に接続されてoperandumを参照しています。
      3. 「時間移動]を追加します]を選択します。
      4. 'R'ボックスをチェックし、適切な時間と単位($)を入力し、Sにドロップダウンボックスから「FIN」を選択します。
        注意:[$分FINするには、P = 100%に行けばR(チェック)]作成したタイムイベントは次のように読むことができます。これは、設定された閾値の後、そのoperandumにアクティビティがない場合は、セッションが終了することが保証されます;動物は一定期間のための補強剤、対になっoperandumで応答保留した後、すなわち 、セッションがタイムアウトします。
      5. [追加]を選択します 'イベントどこへ行きますか。」
      6. 、 'R'ボックスをチェックし、最初のテキストボックスに1を入力し、最初のドロップダウンボックスから適切なoperandumのリリースを選択し、Sドロップダウンボックスにから「S2」を選択します。
        注意:作成したイベントは、[S2に[1]アクティブGO P = 100%、$の後R(チェック)]に類似読むことができます。このステップは、そのoperandumのリリース時に確実に状態は、このようにセッションタイムアウトしきい値(4.4.9.4)をリセット、再入力されていること、(上記括弧で示されています)。リストに含まれているプログレッシブ比が完了したときに、この時点で、状態は(ステップ4.4.9.2)またはセッションがタイムアウト(ステップ4.4.9.4)を終了します。したがって、operandumが活性化されるたびに、それは進歩的な比率に向かってカウントされます。そして、operandumが不活性化されるたびに、 例えば 、レバーが解放されるか、鼻突くが終了し、セッションタイムアウトしきい値(ステップ4.4.9.4)がリセットされ、図2は、S2 'のためにプログラムされたすべての遷移を表し- PRが応答を。。。 「

    図2
    図2.代表的なプログラミング例#2は、ここでは、状態は、二つの基準のいずれかの時に終了します。 L $ステップ4.3で作成したプログレッシブ比スケジュールです。スケジュールのcomplet時イオン、状態3(S3)への状態が終了します。この基準はスケジュールがこの状態に各再突入時に再び開始するのではなく、前進することを可能にするRを、持っていないことに注意してください。状態も '$'分後に出口がFINを状態にすることができます。これは何の応答は、このウィンドウ内で発生しなければ、セッションが終了するまでの所定のタイムアウトしきい値です。これは議論にさらに説明されます。最後に、セッションタイムアウトしきい値は、すべてのoperandumリリース時にリセットされます。したがって、 '[1]' operandumのリリースを示している '1'。

    1. ハイライト「S3 - PR補強とキュー」。
      1. 選択して「追加時間[移動]
      2. 補強材($)を提供するために適切な時間と単位を入力し、SドロップダウンボックスTOから「S4」を選択します。
        注意:[$秒は、P = 100%にGOした後S4に、]作成されたタイムイベントは次のように読むことができます。
    2. ハイライト「S4 - タイムアウト」。 「時間移動するには」を追加]を選択します
    3. 非アクティブ状態($)は、次の補強配信に残る、とSのドロップダウンボックスTOから「S2」を選択するために、適切な時間と単位を入力します。
      注意:[$秒は、P = 100%にGO後S2に、]作成されたタイムイベントは次のように読むことができます。国家「S4 - タイムアウト」は、すべてのデザインのために必要とされない場合があります。
  5. 解決状態を選択します。
    注:このプロトコルを実行する準備が整いました。

Representative Results

ここでは、上記の手順で得られる結果の例を示します。示す第一は、ウイルスベクター( 図3)によってトランスフェクトされた典型的な領域です。一般的に、約1 から 3mmのトランスフェクトされた体積は、線条体組織で得られます。トランスフェクトされた領域の体積は、カバリエリのメソッドを使用して、連続切片全体で定量することができる32重要なのは、トランスフェクトされたボリュームは、このようなトランスフェクトされる組織の種類など、多くの要因に依存します。ウイルス血清型;プロモーター;速度と容量注入。注入された粒子の数;注入液のpHは、およびマンニトールなど高浸透圧性試薬、かどうか、使用された。33,34は一般的に、我々は10分かけて10 12粒子/ ml、1μL/側を顕微注入すると、閉塞具を交換する7追加分前に許可します。また、注入液は、pHが8次の周りに一般的ですが、私たちはモチベーションがいずれかの導入遺伝子発現によって操作することができることを示している( 図4)または薬理学的試薬マイクロインジェクション( 図5)。

図4では 、我々は排他的デザイナー薬(DREADDs)によって活性化デザイナー受容体を発現しました。 DREADD受容体コード領域は、内部リボソーム侵入部位とmCitrineカセットが続きました。 mCitrineは、トランスフェクトされた細胞の便利な可視化を可能にします。 DREADDは、ヘテロ三量体Gタンパク質Gαqに結合させました。アストロサイト、28,35とDREADD自体を刺激することができるGαq結合DREADDの活性化は、クロザピン-N-オキシド(CNO、3ミリグラム/ kg、腹腔内)の全身投与により活性化することができる。14,22,36ラットはに訓練されましたレバーは、3レバー押しが60個の連続日間、毎日1時間のセッション中に飲む1のチャンスを得たエタノールの強化のために応答します。次に、ラットを禁欲を余儀なくされ、Gαq結合DREADDsは、コアアストロサイトの側坐核で発現させました。 3週間の禁欲後、自己ADMIに意欲 nisterエタノールがブレークポイントで測定した。核の21,27-30活性化は、コアアストロサイトを側坐核、全身CNOの投与を介して、車両に比べて禁欲後エタノール自己投与を再開するために、ラットのモチベーションを低下させました。重要なことは、CNOは、代わりにDREADDの緑色蛍光タンパク質を発現していた同じように訓練されたコホートでは効果がなかったです。

図3
マイクロインジェクション、ウイルスによってトランスフェクト図3.代表腹側線条体の領域が。この画像は、核の領域が上記の方法に従うことにより、トランスフェクションしたアストロサイトを側坐核示しています。データは、著作権者の許可を得てブルら13から転載されています。詳細は、出版物および付随する補足資料に記載されています。「ブランク>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
自己投与エタノールが核内で過剰発現された導入遺伝子を活性化することにより、減少したのラットの図4.動機は、コアアストロサイトを側坐核。ウイルスを表現するために、ウイルスのために1週間後にマイクロインジェクション可能とモチベーションがブレークポイントを経由して測定しました。導入遺伝子は、排他的デザイナー薬(DREADDs)によってデザイナー受容体活性化された表現しました。一方向ANOVA(F(2,30)= 3.29、P = 0.04)シェッフェ事後によって明らかに続いているクロザピン-N-オキシドの全身投与によるDREADDの活性化(CNO、3ミリグラム/ kg、腹腔内)大幅CNOはなく、DRの緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現しても同様に訓練を受けたコホートでは効果がなかった車両に比べて禁欲後に自己投与エタノールにラットのモチベーションを低下させましたEADD。データは、著作権者の許可を得てブルら13から転載されています。詳細は、出版物および付随する補足資料に記載されています。

図5
図5.ギャップ結合ブロッカーのマイクロインジェクションは、禁欲後に自己投与エタノールにラットの意欲を増加させた二つのギャップ結合ブロッカーは、自己投与エタノールへのラットの(ブレークポイントを介して測定)モチベーションに及ぼす影響について評価したメフロキンと18- α-グリチルレチン酸(18-α)。二元配置ANOVAは、核内へのギャップ接合ブロッカーのマイクロインジェクションは、コアが禁欲(F(3,40)= 5.56、P = 0.003)の後に自己投与エタノールにラットのモチベーションを増加側坐核ことを明らかにしました。データは、著作権者の許可を得てブルら13から転載されています。詳細は同公報に記載されていますし、添付補足資料。

Discussion

ここで紹介する手順は、マイクロインジェクションカニューレと動機付け行動の分子基質の解明に役立ちますmicroinjectorsを製造するための効率的な手段です。この方法は、いくつかの利点を提供しています。まず、自分のインプラントおよびmicroinjectorsを製造することにより、新たな実験パラメータは、急速に最適化することができ、 すなわち、1つは、コンポーネントが到着するカスタムメイドのを待つ必要はありません。第二に、カニューレの小径のため、多くのカニューレを同時に注入することができます。これは、生存率を向上させることができ、必要な外科手術時間が、短縮し、また、動物ごとに複数のインプラントを可能にします。固定比パラダイムを迅速に簡単に所望の強化スケジュールを含むイベント遷移パラメータリストを適用することにより、プログレッシブ比パラダイムに変換することができるので、第三に、オペラントチャンバーを制御するために使用されるソフトウェアは、容易に、プログレッシブ比スケジュールを収容します。

であるために広く便利な、汎用のマイクロインジェクションの手順は、現在利用可能なほぼすべての試薬のマイクロインジェクションのために広く適用されるべきであることを提示しました。そのため、私たちは、この技術はマイナーな修正を加えて、将来的に同様の高い有用性であり続けることを期待しています。唯一のいくつかの変数を変化させることにより、この方法は、試薬の広い数に適用することができます。最も一般的に操作することになるパラメータは、マイクロインジェクターがカニューレ、注射の量、注入速度から突出長さがあります。例えば、1は、インジェクタは、通常、慢性移植片の周りに形成グリア性瘢痕を避けるために、カニューレ先端からさらに突出することができます。さらに、一つはより大きな体積を注入することを望むかもしれません。線条体ウイルスマイクロインジェクションのために、1μLの量は、一般的に使用され、このボリュームは、一般的に、より長い時間かけて注入される使用と比較して(頻繁に7から10分の追加の拡散時間 - 10分プラス3)薬理学的試薬用のD(通常は0.3から3分プラス1 - - 2オーバー0.5μL3分の追加の拡散時間)。ユーザーは文献を参照してくださいおよび/または経験的に自分のニーズに最適なパラメータを決定する必要があります。 1)カニューレの長さ、2)マイクロインジェクターの長さ、3)マイクロインジェクターの噴霧パターンの品質、及び4)注射前に、システムの整合性:いずれにしても、この手順の成功は、4つの変数に決定的に依存しています。マイクロインジェクションの場所はマイクロインジェクタがカニューレから突出した深さに依存しているため、それは両方のカニューレ(ステップ1.2.8)と、マイクロインジェクターの長さ(ポスト曲げ、ステップ2.2.1)の両方を正確既知およびすべての被験者の間で均一であることが肝要です。これは、簡単に簡単に任意のはそれが最後の再測定に必要な長さではありません実現拒否することによって制御することができます。これはガイドカニューレの直下に発生した場合、また、注入位置は、予測することができます。 DOEこのように、任意のマイクロインジェクターテストの際に長い、細い流れ(ステップ2.4​​.6)が拒否されるべき噴霧しませんよ。質の注入はまた、注入前に、システムの完全性に関連しています。インジェクタからすべての水を分配した後(前の試薬で充填する)は、複数のスポットをラボワイプ上で観測されている場合、リークは(ステップ2.4​​.8に注意してください)​​是正する必要があります。さらに、(試薬とマイクロインジェクターを充填した後)PE20チューブ内の水からの薬物が一つではない分離バブル(ステップ2.4​​.9)、単一のバブル場合、インジェクタは、部分的に詰まっています。この詰まりは防止または注射をそらすことができどちらか。これも(ステップ2.4​​.8に注意)は、容易に改善することができます。

1は3つの選択肢がある動物が定位フレームにある間に顕微注入することを望むべきです。第1に、それは定位マニピュレータによってしっかりと保持し、また、PE20チューブとの接続を可能にするために十分遠くまで延長することができるように、マイクロインジェクターの襟の長さを増加させることができます。第二に、上eは、時間的にカニューレを移植し、ここで紹介する標準マイクロインジェクターを使用することができます。第三に、人は描かれ、研磨されたガラスピペットを使用することができます。16,17

ここで紹介する手順の重要な制限は、それが最善の手順を熟知しているだけでなく、扱いラットで実施されていることです。同じ研究者が2ヶ月以上毎日ラットを取り扱うため、結果のセクションで説明したデータに使用したラットは、特別な取り扱い手順を必要としません。これは、少なくとも2週間、外科用インプラントの毎日の観察および操作が含まれていました。しかし、ラットは急速に応力が作用することができるプレパルス阻害アッセイの前に使用されている多数の技術により馴化され得ます。これらの特別な馴化技術がうまく以前に詳述されている。43これらの手順に加えて、ラットが短くmicroinjectorsはデュ使用されているマイクロインジェクションの手順に慣らしすることをお勧めしますリング「偽」噴射。これらの偽注射中に、マイクロインジェクターは、組織損傷を制限するために組織内に突出しないことが重要です。つまり、マイクロインジェクターは、もはや14ミリメートル以上曲げてはなりません。したがって、この手法の最適な実施のために必要な完全な慣れは、限定と見なすことができます。

いくつかの行動パラダイムは動機を測定するために存在するが、進行性の比率は、一般的に、被験者が強化子を得るために発揮していく所存です努力を定量化するために使用されます。プログレッシブ比パラダイムは、多くの場合、最後に完了した比率のレバー押しの最大数として定義されたブレークポイントとして知られている指標を生成;。。 すなわち 、最大のものは強化子を生成応答21プログレッシブ比は大きさを補強するために敏感です。例えば、より高いコカイン(またはスクロース)の用量は、より高いブレークポイントと低いコカイン(またはスクロース)を生成低いbreakpをもたらす用量OINT。21,22により、ブレークポイントがモチベーションおよび/ ​​または有効性を補強するための日常的に使用するプロキシです。21,23-26ブレークポイントの意図は、動物が応答を停止したときを決定することであるため、プログレッシブ比パラダイムの重要なパラメータでありますセッションの長さ。有限セッションの長さは、ブレークポイントの値に偽のキャップを置くことができ、これは異常に自己投与またはその増加後の補強休止の速度を減少させる前処理によって悪化することができます。この交絡は、アプローチの任意の数によって克服することができる;例えば、動物は平均間の注入間隔の倍数によって応答する源泉徴収したときに終了するセッションは、このアプローチの44より一般的に適用される変異体は、セッションが一度した応答終了することです。被験者全体で一定に保持されているいくつかの実験的に決定された値によって源泉徴収されて。私たちは、ステップ4.4.9.11にこの手法を適用する方法を提供しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cannula Tubing Amazon Supply/ Small Parts HTXX-26T-60 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA
Obturator Amazon Supply/ Small Parts GWXX-0080-30-05 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN
Microinjector Wire MicroGroup 33RW 304 33 gauge
Super Glue Loctite 3924AC Liquid, Non-gel, can be autoclaved
Microinjector Plastic Tubing Becton Dickson 427406 PE20
Medium Weight Hemostats World Precision Instruments 501241-G
Ruler Fisher 09-016 150 mm
#7 Forceps Stoelting 52100-77 Dumont, Dumostar
Rotary Tool Dremmel 285 Two-speeds
Cut-off Disc McMaster Carr 3602 15/16" x 0.025"
Microinjection Pump Harvard Apparatus PhD 2000
1 ul Glass Syringe Hamilton 7001KH Needle Style: 25s/2.75"/3
Cotton Tipped Applicator Fisher 23-400-101
Lab Wipes Kimwipes 34133
Operant Software Coulbourn Graphic State
Operant Chambers Coulborun Habitest

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動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション
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Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018, doi:10.3791/53018 (2015).More

Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018, doi:10.3791/53018 (2015).

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