Protocol
Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Virginia Commonwealth University og holde sig til NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Fremstilling af Redskaber Før Kirurgi og Mikroinjektion
- Sat op til materiale forberedelse:
- Opnå 26 G kanyle slanger, 33 G obturator wire, 33 G mikroinjektion nål slanger, mikroinjektor plastslange (PE20 eller tilsvarende), to medium vægt lige hemostats, lab tape, lineal, permanent markering, 70% ethanol (v / v), oplagring hætteglas (f.eks 20 ml scintillationsbeholdere), superlim, små veje både og roterende værktøj udstyret med en ikke-tunge cut-off disc.
Bemærk: Sikring af roterende værktøj til en pipettespids kasse ved hjælp af stropper eller tape er nyttigt, da det hæver værktøjet. Iført øjenbeskyttelse er vigtigt for at undgå skader, når du bruger et roterende værktøj. - Vedhæft et stykkeaf lab eller autoklave bånd til bænken.
- Opnå 26 G kanyle slanger, 33 G obturator wire, 33 G mikroinjektion nål slanger, mikroinjektor plastslange (PE20 eller tilsvarende), to medium vægt lige hemostats, lab tape, lineal, permanent markering, 70% ethanol (v / v), oplagring hætteglas (f.eks 20 ml scintillationsbeholdere), superlim, små veje både og roterende værktøj udstyret med en ikke-tunge cut-off disc.
- Fremstilling af kanyler:
Bemærk: Der kræves mindst to kanyler pr rotte til en bilateral injektion. En yderligere kanyle vil blive anvendt i et senere trin.- Erhverve en del af kanyle slangen med tilstrækkelig længde for at undgå bøjning under processen med mærkning og skæring.
- Tegn en 15 mm referencelinje på båndet fra trin 1.1.2 ved hjælp af en spids pen. Dette vil tjene som en guide til mærkning af sekventielle 15 mm sektioner på slangen med en skarp permanent markør.
- Tryk kanylen slange på markerede punkter, den langsomme roterende afskårne skive af den roterende værktøj for at notch slangen. Drej kanylen 180˚ og hak den modsatte side af slangen. Ikke skære gennem slangen helt, fordi det kan føre til okklusion.
- Skarpt bøje slangen med henblik på at bryde det op i ~ 15 mm sektioner.
- Hold hver skåret ende af kanylen vinkelret på cut-offdisk mellem tommel- og pegefinger. Drej kanylen slange, mens røre spidsen til den store forreste overflade af cut-off disk (dvs. ikke kanten). Dette vil generere en afstumpet spids. Bemærk: Du må ikke bøje kanylen, for det kunne give en off-site injektion.
- Ream begge ender af kanylen med en 26 G nål affaset (brun hub) for at sikre, at alle grater er blevet fjernet, og at kanylen er uhindret.
- Bestå en prøve af obturator wire skåret til ~ 35 mm gennem udskæringen kanylen for at kontrollere, at der ikke er nogen indre forhindringer.
- Pick up hver kanyle individuelt ved hjælp fastspændt hemostats og måle hver afsluttet kanyle med en lineal for at sikre, at det er præcis 14 mm i længden.
- Fremstilling af obturatorer:
- Klemme en kanyle ved ca. halv længde med medium vægt, lige hemostats. Læg den låste hæmostat på bænken. Kanylen bør være vinkelret på bænken.
Bemærk: Denne kanylebør ikke anvendes inden for kirurgi efter at være blevet holdt ved låste hemostats, da det er sandsynligt bøjet. - Foder ene ende af obturator wire i kanylen indtil den har nået bænken. Bounce tråden i kanylen for at sikre, at en burre ikke forhindrer det i at nå bænken. Dvs at nå bunden af kanylen. Korrekt obturator længde vil forhindre tilstopning og yderligere væv ardannelse.
- Bøje ledningen ved at knibe med fingrene, indtil en ~ 30˚ vinkel opnås, samtidig med opretholdelse af kontakt mellem obturatoren og bænken. Sikre, at bøjningens vinkel er således, at den indeholder flugter med hovedet hætten, og overskuddet vender fremad, hvilket gør det sværere for rotten for at fjerne.
- Fjern kablet fra kanyler og afbrød overskydende del på ~ 2,5 mm fra bøjningen med små diagonale fræsere (wire fræsere).
Bemærk: Mindst vil blive krævet to obturatorer pr rotte til en bilateral injektion, da hver implanteret kanyle kræver en obturator. Oprettelseyderligere ~ 35˚ bøjning midtvejs gennem obturatoren vil også hjælpe med at forhindre fjernelse af dyret. Opbevar både kanyler og obturatorer i separate hætteglas (f.eks., 20 ml scintillationsbeholdere) indeholdende 70% ethanol (v / v) indtil brug, men i det mindste O / N.
- Klemme en kanyle ved ca. halv længde med medium vægt, lige hemostats. Læg den låste hæmostat på bænken. Kanylen bør være vinkelret på bænken.
- Forberedelse og afprøvning af microinjectors:
- Anskaf et stykke mikroinjektor nål slanger, der er ~ 1 m lang.
- Hold den ene ende af slangen mikroinjektor vinkelret med låst lige hemostats.
- Twist arterieklemmen samtidig holde spændingen på slangen til spole det stramt omkring arterieklemmen mindst én gang.
- Mål 32 mm fra det modsatte, løse ende af mikroinjektor slanger og at forstå dette punkt vinkelret med et andet lige, medium vægt hæmostat og lås dem. Tag fat i mikroinjektor slangen med hemostats på siden af de 32 mm mærket tættest på den løse ende i stedet for på den side nærmest arterieklemmen med såret wire.
- Bend slangen frem og tilbage samtidig med at spændingen på slangen, indtil den går i stykker.
Bemærk: En enkelt, skarp opad og nedad bøjning vil producere en stump pause, hvilket er ønskeligt at sikre, at mikroinjektion sker i ønsket hjerne region. - Undersøg mikroinjektor slangen for at sikre, at begge ender er lige, og at den indvendige diameter er uhindret.
- Erhverve kanylen slange, der skal bruges til at fremstille en mikroinjektor krave.
- Mål og markere sekventielle 5 mm sektioner af kanyle slange ved hjælp af en permanent markør og en 5 mm henvisning linje trukket på bånd (trin 1.1.2).
Bemærk: Hver mikroinjektor kræver en krave. Kraver er simpelthen korte kanyler klæbet til mikroinjektor wire. - Tryk kanylen slange på markerede punkter, den langsomme roterende afskårne skive af roterende værktøj for at notch slangen. Drej kanylen 180˚ og hak den modsatte side af slangen. Skæring helt kan okkludere slangen.
- Skarptbend mikroinjektor krave slange med henblik på at bryde det op i ~ 5 mm sektioner.
- Ream den indvendige diameter af begge ender af kraven med en 26 G nål affaset (brun hub) for at sikre, at de fleste af de grater er blevet fjernet. Nogle små grater vil gribe mikroinjektor tråd og dermed støtte i limning.
- Slide én krave på hver mikroinjektor rør ~ 2 cm fra enden.
- Opret en lille pulje af superlim i hjørnet af en lille vejer båd.
- Brug skrot kanyle slangen skæres til ~ 25 mm for at anvende en lille mængde af superlim til mikroinjektor røret ~ 5 mm fra den ene ende. Dernæst skubbe kraven i denne superlim perle, så det er ~ 1 mm fra enden af røret mikroinjektion. Dække begge ender af krave med lim.
Bemærk: Undgå en stor ophobning superlim på kraven, da det vil forhindre plastrøret i at tætne omkring mikroinjektor. Selv om det er vigtigt at undgå at få superlim på den åbne ende af mikroinjektor slange, da dette vil gøreDen mikroinjektor ubrugelig, er det også vigtigt at skubbe kraven så tæt på slutningen som muligt for at minimere void (ikke-injiceret) volumen. - Læne afsluttet mikroinjektor på ydersiden af en anden lille vejebåd med kraven opad og lad det tørre i 24 timer.
- Opnå en ~ 8 cm stykke mikroinjektor plastslange (PE20 eller tilsvarende), 1 ml sprøjte fyldt med sterilt vand, og 26 g affaset nål (brun hub).
- Vedhæft en 26 G (brun hub) nål til at sprøjte og skub snittet slange på nålen, sikrer ikke at punktere røret.
- Skub plastrør over kraven ende af det tørrede, komplet mikroinjektor.
- Klem vandet fyldt injektionssprøjte stemplet for at teste for åbenheden.
Bemærk: Vand bør sprøjte meget langt og lige ud af mikroinjektor spids. Hvis strømmen ikke er lige, vil injektionen placering ikke være korrekt. Kilden til en sidelæns eller diffus spray er en dårlig pause (trin 1.4.5). En mikroinjektor bør ikket anvendes, hvis spray er sidelæns eller diffus. Saltvand bør ikke anvendes, da det kan tilstoppe mikroinjektor eller nål. - Træk sprøjten tilbage for at fjerne vand fra mikroinjektor. Opbevares på et tørt, forseglet hætteglas, fx en 20 ml glasscintillationshætteglas.
Bemærk: Microinjectors kan autoklaveres efter fremstillingen med de fleste super lim, 31, men det skal bestemmes empirisk. Alternative sterilisering teknikker indbefatter ethylenoxid og gammabestråling.
2. Forberedelse til og Performing Mikroinjektioner
- Opnå afsluttede microinjectors, mikroinjektor plastslange (PE20 eller tilsvarende), mikroinjektion pumpe, to små veje både, sterilt vand, 70% ethanol (v / v), acetone, to gastæt 1 pi glassprøjter med en stump kanyle (25 g), bomuld tippes træ applikatorer, reservedele obturatorer, 1 ml sprøjte, 26 G (brun hub) nål, små buede pincet (stil # 7 anbefales), og lab wEIC.
- Forberedelse microinjectors til injektion:
- Bend afsluttet mikroinjektor 15 mm fra enden modsat kraven, således at vinklen mellem de to er ~ 95˚.
Bemærk: En præcis bend placering er bydende nødvendigt for præcis placering injektion. Brug # 7 pincet (eller lignende) for at få fat i mikroinjektor og bøjning opad er nyttig. Altid igen måle længden, før du udfører mikroinjektioner. - Skær plastslange (PE20) til ~ 70 cm og glide over mikroinjektor krave.
Bemærk: Tilføjelse tapeflige til én plastrør nær både mikroinjektor og løse ende er nyttig, når færdiggøre injektioner, især når indsprøjtning to forskellige løsninger. Faner anbefales ikke til begge rør som de bliver besværlige under injektionen.
- Bend afsluttet mikroinjektor 15 mm fra enden modsat kraven, således at vinklen mellem de to er ~ 95˚.
- Forberedelse pumpe til mikroinjektioner:
- Tænd pumpen.
- Sæt diameter mikroinjektion nål, ønskede infusionshastighed, og målrette injektion volumen.
Bemærk: infusion rottee og injektionsvolumen er afhængig af eksperimentelle krav. Dette er uddybet i diskussionen. Nogle pumper har sprøjte tabeller præinstalleret. Hvis ikke, kan en sprøjte tabel findes på fremstilling website (s). - Indstil pumpe mode til "Volume", således at en præcis volumen leveres automatisk. Hvis der er valgt "Pumpe" tilstand i stedet, skal forsøgslederen manuelt stoppe pumpen.
- Juster pumpen bagstopper at lade sprøjten til at fylde til injektionsvolumenet plus en ekstra 0,2 pi.
- Forberedelse mikroinjektion sprøjte og mikroinjektor til injektion:
- Lås hver gastæt mikroinjektion sprøjte ind i racket af mikroinjektion pumpe.
- Placer spidsen af gastæt sprøjte i sterilt vand indeholdt i en lille vejebåd og forsigtigt vibration stemplet for at smøre det indre ledning. Jævnt trække stemplet til bagstopper på pumpen til at fylde med vand.
- Skub PE20 rør, der er connected til mikroinjektor (i trin 2.2) på en 26 G (brun hub) nål fastgjort til en 1 ml sprøjte, der er fyldt med sterilt vand. Spray sterilt vand gennem mikroinjektor, og inspicere spray mønster og distance.
Bemærk: Vand bør sprøjte meget langt og lige ud af mikroinjektor spids. Hvis strømmen ikke er lige, vil injektionen placering ikke være korrekt. - Placer steriliseret mikroinjektor på et sterilt område.
- Skub slangen ud af nålen, holder mikroinjektor slangen oprejst for at forebygge drypper vand fra samtidig slangen under det område beskadiget af nålen skæring.
- Skub mikroinjektion sprøjtestemplet lidt fremad for at skabe en dråbe på enden af nålen, og skub det vandfyldte rør PE20 (der er forbundet til mikroinjektor) på nålen.
Bemærk: Dette vil oprette en væske-til-væske-forbindelse, der vil tillade passende modtryk, der kunne løsne en træsko, der kunne danne påspidsen af mikroinjektor. - Skub stemplet helt frem til at forberede sig til prøven lastning og sikre, at ingen spor ethanol forbliver i mikroinjektor.
- Kontroller opsætningen for utætheder ved at trykke vanddråben der er dannet ved spidsen af mikroinjektor til en ren lab tørre flere gange.
- Bemærk: Når du trykker til laboratoriet tørre bør kun én våd plet dannes. Hvis der er flere dråber, der er en utæthed i systemet.
- Undgå lækager ved at styre superlim ansøgning (trin 1.4.14), og ved at trimme den PE20 rør med skarpe saks eller et barberblad enhver tid at PE20 slangen er fjernet fra enhver forbindelse. Derudover skal du gentage trin 2.4.3 gennem 2.4.8 at afhjælpe lækagen.
- Træk sprøjtens stempel tilbage 0,2 pi; skabe en boble mellem det sterile vand i PE20 slange / mikroinjektor og opløsningen, der skal injiceres.
- Bemærk: Denne boble forhindrer fortynding af injektat, forurening af vand og tilladertil overvågning af injektionsprocessen, da den vil bevæge sig under injektionen. En enkelt, fast boble skal produceres. Hvis det er brudt, en lækage er til stede, eller mikroinjektor tip er okkluderet; hvilket indikerer, at trin 2.4.8 (og den ledsagende note) skal gentages.
- Placer mikroinjektor i reagenset, der skal injiceres og træk langsomt sprøjtens stempel til bagstopper.
- Forberedelse dyr til injektion:
- Hold rottens brystet mod eksperimentatorens brystet. Rengør området omkring kanyler med en bomuldsapplikator dyppet i 70% ethanol (v / v).
- Bemærk: Med korrekt håndtering, kan mus forsigtigt fastholdt i en cupped hånd. Ellers kan det være nødvendigt scruffing.
- Fjern obturatorer med små pincet og sted ind vejer båd med 70% ethanol (v / v).
- Performing injektioner:
- Placer fyldt mikroinjektor (trin 2.4.10) ind kanyle. Tryk start på mikroinjektion pumpe og skærm boble bevægelse.
- Bemærk: Det may være nødvendigt at anvende et let tryk for at sikre, at microinjectors ikke løfter. Boblen (dannet i trin 2.4.9) bør ensartet fremme og træde helt ind i mikroinjektor.
- Fjern microinjectors fra kanylen og erstatte obturatorer, når injektionen er færdig, og efter injektion diffusion er udløbet.
- Bemærk: Typisk efter injektion diffusionstider er 2-4 min for farmakologiske reagenser, og 2. - 10 min for virus. Forlader mikroinjektor i under den post infusionsperioden forhindrer injektatet fra tilbagesvaling tilbage op kanylerne i stedet at diffundere ind i vævet. Sted obturatorer på siden af ethanol fyldt vejebåd at tillade ethanol løbe, før genindførte i kanylen.
3. Post-Injection Clean Up
- Få en lille hætteglas af hver: sterilt vand, 70% EtOH, og acetone.
- Rengøring mikroinjektor og mikroinjektion sprøjte:
- Fjern glassprøjtes fra pumpen sprøjten rack og mikroinjektion slangen fra glassprøjte.
- Afbryd mikroinjektor slangen fra glassprøjte og vedlægge en 1 ml sprøjte fyldt med sterilt vand til mikroinjektor slange via en 26 G nål (brun hub). Skub 1 ml sprøjte stempel frem til at udvise ~ 0,3 ml. Dernæst røre spidsen af mikroinjektor til et laboratorium-tørre og træk luft tilbage gennem mikroinjektor.
Bemærk: mikroinjektor og slanger kan genanvendes til lignende forsøg, hvis det skønnes forsigtig. - Placer glas kanyle i sterilt vand og trække stemplet helt tilbage. Dernæst skubbe stemplet helt frem til at skylle. Tryk på glasset sprøjtens spids til et laboratorium tørre for at sikre, at ingen væske tilbage.
- Gentag trin 3.2.3 med sterilt vand, luft, 70% EtOH, og acetone i følgende rækkefølge: sterilt vand, sterilt vand, luft, luft, 70% EtOH, 70% EtOH, luft, luft, acetone, acetone, luft, luft. Udførelse alle disse rensningsetaper vil bidrage til at bevare mikroinjektion sprøjten.
- Placer mikroinjektor sprøjten (er) i emballage og træk stemplet tilbage til 0,05 pi.
Bemærk: Dette er vigtigt, da det giver stemplet til at blive skubbet eller trukket for at løsne en fast stempel, der kan opstå bør enhver saltaflejringer dannes efter opbevaring.
4. Programmering af Motivation Assay
- Log ind på Grafisk stat med administratorrettigheder.
- Vælg eller oprette relevante database.
- Oprettelse progressiv forhold forstærkning tidsplan:
- Vælg Lister> Database Level Lister> event Transition Parameter lister.
- Vælg 'Tilføj'. Indtast passende liste nummer (L #) og beskrivelse.
- Vælg 'Tilføj Begivenheder «.
- Indtast den første forstærkning tidsplan værdi og vælg 'Tilføj'. Gentag.
BEMÆRK: Værdier kan bestemmes ved hjælp af en formel, hvor den gradvise forhold tidsplanen = 5e (j * (forstærker tjent + 1)) -5 7.For at skræddersy denne ligning til korrekt teste hypotesen, skal den værdi, j bestemmes empirisk eller indhentet fra litteraturen. - Vælg 'For «i» Valg Order' boksen.
- Vælg 'Hold Værdi = til: ____ «i» Når Færdig' boksen. Indtast armeringen tidsplan værdi i tekstfeltet, der langt overstiger forventes at reagere. Dette vil være den nødvendige indsats for alle efterfølgende poster, når listen er opbrugt.
- Oprettelse af en forsøgsprotokol:
Bemærk: Graphic, flytter emnet gennem en række stater, der forlades baseret på enten tid eller præstationskriterier. Indstil alle diskrete og kontekstuelle stikord og parametre markeret nedenfor som '$' på passende teste hypotesen, der undersøges.- Vælg Filer> Opret Experiment-protokollen.
- Indtast den ønskede protokol nummer og beskrivelse i passende tekstfelt. Vælg 'State Creation «.
- Indstil alle stimuli for både 'RDY - Klar stat "og" FIN - Færdig stat «.
- Vælg 'Ny stat «og navngive det S2 - PR Reaktion.
- Vælg 'Ny stat «og navngive det S3 -. PR Reinforcer og Cue'
- Vælg 'Ny stat «og navngive det S4 - Timeout".
- Fremhæv "S1" og navngive den "S1 -. Tilvænning '
- Vælg Tilføj 'Time Go To. «
- Indtast passende tid ($) og enheder ($), f.eks., Minutter og vælg 'S2' fra TO S drop down boks. De tidsenhed »enheder« blev bestemt, da databasen blev oprindeligt oprettet.
Bemærk: Den oprettede tid overgang bør læse ligner [Efter $ minutter GO P = 100%, FOR S2] Figur 1 er et eksempel på denne begivenhed engang oprettet.
</ ol>
Figur 1. Repræsentant programmering eksempel # 1. I dette tilfælde en tid, afgrænset tilstand er illustreret, hvor en brugerdefineret værdi af $, her vist i minutter, indikerer, når den nuværende tilstand bør forlade at angive 2 (S2).
- Fremhæv 'S2 - PR Reaktion.
- Vælge Tilføj 'Begivenhed Go To. «
- Indtast liste navn, hvori den progressive forholdet tidsplan, der blev oprettet i trin 4.3 i det første tekstfelt som L $ (fx L1), vælge den relevante operandum (f.eks., Løftestang eller næse sækken) fra første drop down boks, og vælg ' S3 'fra TO S drop down boks.
Bemærk: Den oprettede begivenhed kan læse ligner [IF L $ 1 - Aktiv GO P = 100%, FOR S3]. Identifikationen 1 - Aktiv blev udpeget under database skabelse. Her, 1 - Aktivhentyder til den operandum tilsluttet omskifter én. - Vælg 'Tilføj Time Go To. «
- Kontroller R du indtaste passende tid og enheder ($), og vælg 'FIN' fra TO S drop down boks.
Bemærk: Den oprettede tid begivenhed kan læse ligner [R (markeret) HVIS $ minutters GO P = 100%, FOR FIN]. Dette vil sikre, at sessionen vil ende, hvis der ikke er aktivitet på denne operandum efter den indstillede tærskel,. Dvs, vil sessionen timeout efter at dyret tilbageholder reagere på forstærker-parrede operandum i den indstillede tid. - Vælge Tilføj 'Begivenhed Go To. «
- Kontroller R du indtaste 1 i det første tekstfelt, skal du vælge frigivelse af passende operandum fra første drop down boks, og vælg 'S2' fra TO S drop down boks.
Bemærk: Den oprettede begivenhed kan læse ligner [R (markeret) Efter $ [1] Aktiv GO P = 100%, FOR S2]. Dette trin sikrer, at ved frigivelse af operandum(angivet med parentes ovenfor), at staten er reentered dermed nulstille tærsklen Session timeout (4.4.9.4). På dette tidspunkt vil staten gå ud, når den progressive forhold, der er indeholdt i listen er afsluttet (trin 4.4.9.2) eller session timeout (trin 4.4.9.4). Således hver gang at operandum er aktiveret, tæller den progressive forhold. . Og hver gang at operandum inaktiveres; fx er armen frigivet eller næsen sækken forlades, tærsklen Session timeout (trin 4.4.9.4) nulstilles Figur 2 repræsenterer alle overgange programmeret til "S2 - PR Reaktion.. '
Figur 2. Repræsentativ programmering eksempel # 2. Her er tilstanden forlades af enten af to kriterier. L $ er den progressive forholdet tidsplan oprettet i trin 4.3. Efter tidsplanen completion, staten kommer ud til stat 3 (S3). Bemærk, at dette kriterium ikke har en R, som gør det muligt for tidsplanen for at gå videre i stedet begynder igen på hver genindtræden i denne tilstand. Staten kan også afkørsel efter '$' minutter at angive FIN. Dette er den forudbestemte timeout tærskel, hvorefter sessionen ophører, hvis der ikke reagerer sker inden dette vindue. Dette forklares yderligere i diskussionen. Endelig er Session timeout tærskel nulstilles på hver operandum udgivelse. Således "[1] 'angiver frigivelse af operandum' 1 '.
- Fremhæv 'S3 - PR Reinforcer og Cue. «
- Vælg 'Tilføj Time Go To'
- Indtast passende tid og enheder til at levere den forstærker ($), og vælg 'S4 «fra TO S dropdown boksen.
Bemærk: Den oprettede tid begivenhed kan læse ligner [Efter $ sekunder GO P = 100%, til S4].
- Fremhæv 'S4 - timeout. "
- Indtast passende tid og enheder til at forblive i en inaktiv tilstand ($) efter forstærker levering, og vælg 'S2' fra TO S dropdown boksen.
Bemærk: Den oprettede tid begivenhed kan læse ligner [Efter $ sekunder GO P = 100%, FOR S2]. State 'S4 - Timeout «ikke kan kræves for alle designs.
Bemærk: Denne protokol er nu klar til at køre.
Representative Results
Her illustrerer vi eksempler på resultater, der kan opnås med den ovenstående procedure. Vist første er en typisk område, der er transficeret med virale vektorer (figur 3). Generelt er en transficeret volumen på ~ 1 mm 3 opnået i striatum. Mængden af det transficerede regionen kan kvantificeres på tværs serielle sektioner ved hjælp Cavalieris metode 32 er vigtigt, at transficerede volumen afhænger af mange faktorer såsom typen af væv, der transficeres.; viral serotype; promotor; sats og volumen injiceres; antal partikler injiceret; injektat pH; og om hyperosmolær reagenser, såsom mannitol, blev anvendt. 33,34 Typisk vi microinject 10 12 partikler / ml, 1 pl / side løbet af 10 minutter, og tillade yderligere 7 minutter før udskiftning obturatorer. Derudover injektionsmidlet er generelt omkring pH 8. Dernæst viser vi, at motivation kan manipuleres ved enten transgenekspression (figur 4)eller farmakologisk reagens mikroinjektion (figur 5).
I figur 4, udtrykte vi en Designer Receptor Udelukkende Aktiveres af Designer Drugs (DREADDs). Den DREADD receptor-kodende region blev efterfulgt af en internt ribosomindtrængningssite og en mCitrine kassette. Den mCitrine tillader bekvem visualisering af transficerede celler. Den DREADD blev koblet til heterotrimere G-protein Gαq. Aktivering af Gαq-koblede DREADD kan stimulere astrocytter, 28,35 og DREADD selv kan aktiveres ved systemisk administration af clozapin-N-oxid (CNO, 3 mg / kg, ip). 14,22,36 Rotter blev trænet til at løftestang reagere for ethanol forstærkning, hvor 3 løftestang presser gav 1 chance for at drikke under daglige 1 time sessioner over 60 sammenhængende dage. Dernæst blev rotter tvunget til afholdenhed, og Gαq-koblede DREADDs blev udtrykt i nucleus accumbens centrale astrocytter. Efter tre uger afholdenhed, motivationen til selv-ADMI Nister ethanol blev målt ved breakpoint. 21,27-30 Aktivering af nucleus accumbens centrale astrocytter via systemisk CNO administration faldt motivation rotter til at genoptage ethanol selvadministration efter afholdenhed i forhold til køretøjet. Det er vigtigt, CNO havde ingen virkning på en lige så uddannet kohorte hvor der blev udtrykt grønt fluorescerende protein i stedet for DREADD.
Figur 3. repræsentant ventrale striatum region transficeret ved mikroinjicerede virus. Dette billede illustrerer området af nucleus accumbens astrocytter, som blev transfekteret ved at følge den ovennævnte fremgangsmåde. Data er genoptrykt fra Bull et al. 13 med tilladelse fra indehaveren af ophavsretten. Nærmere oplysninger kan findes i denne publikation og den ledsagende supplerende materiale.blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Motivation af rotter til selv administrere ethanol blev reduceret ved at aktivere et transgen, der var over-udtrykt i nucleus accumbens centrale astrocytter. Virus blev mikroinjiceret og motivation målt via breakpoint efter at der en uge for virussen at udtrykke. Transgenet udtrykte blev en Designer Receptor Udelukkende Aktiveres af Designer Drugs (DREADDs). En envejs ANOVA (F (2,30) = 3,29, p = 0,04) efterfulgt af en Scheffé post-hoc viste, at aktivering af DREADD ved systemisk administration af clozapin-N-oxid (CNO, 3 mg / kg, ip ) reducerede signifikant motivation rotter til selv administrere ethanol efter afholdenhed i forhold til køretøjet CNO havde ingen virkning på en lige så uddannet kohorte, der var udtryk for grønt fluorescerende protein (GFP) i stedet for DREADD. Data er genoptrykt fra Bull et al. 13 med tilladelse fra indehaveren af ophavsretten. Nærmere oplysninger kan findes i denne publikation og den ledsagende supplerende materiale.
Figur 5. Mikroinjektion af gap junction-blokkere øget motivation rotter til ethanol selv administrere efter afholdenhed To gap junction blokkere blev evalueret for deres virkning på motivationen (målt via breakpoint) af rotter til selv at administrere ethanol:. Mefloquin og 18- a-glycyrrhetinsyre (18-α). En to-vejs ANOVA viste, at mikroinjektion af gap junction-blokkere i nucleus accumbens kerne øget motivation rotter til selv at administrere ethanol efter afholdenhed (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Data er genoptrykt fra Bull et al. 13 med tilladelse fra indehaveren af ophavsretten. Nærmere oplysninger kan findes i denne publikation ogden medfølgende supplerende materiale.
Discussion
Proceduren præsenteres her er en effektiv måde at fremstille mikroinjektion kanyler og microinjectors, der vil støtte i at belyse de molekylære substrater af motiveret adfærd. Denne metode har flere fordele. Først ved at fremstille egne implantater og microinjectors, nye eksperimentelle parametre kan hurtigt optimeres, dvs, man ikke behøver at vente på specialfremstillede komponenter at ankomme. For det andet, på grund af den lille diameter af kanylen, flere kanyler kan samtidig implanteret. Dette forkorter den nødvendige kirurgiske tid, som kan forbedre overlevelsesevne, og også tillader flere implantater pr dyr. For det tredje, den anvendte software til at styre de operantkamre let rumme progressive forholdet tidsplaner idet et fast forhold paradigme kan hurtigt omdannes til et progressivt forhold paradigme ved blot at anvende en begivenhed overgangen parameterliste, der indeholder den ønskede forstærkning tidsplan.
At værebredt anvendelig, blev en generisk mikroinjektion procedure præsenteret, der bør være bredt anvendelig til mikroinjektion af næsten enhver reagens i øjeblikket. Derfor forventer vi, at denne teknik fortsat vil være af tilsvarende høj nytteværdi i fremtiden med mindre modifikation. Ved kun at ændre nogle få variabler, kan denne fremgangsmåde anvendes til en lang række reagenser. Parametre, som hyppigst manipuleres omfatter længden at mikroinjektor rager ud fra kanylen, volumen injektion og på injektion. For eksempel kan man ønske injektoren at rage længere væk fra kanylespidsen for at undgå glial ar, der typisk danner omkring kroniske implantater. Derudover kan man ønske at indsprøjte en større volumen. For striatale virus mikroinjektioner, er et volumen på 1 pi typisk anvendes, og denne mængde indsprøjtes typisk over en længere periode (ofte 7 - 10 min plus 3 - 10 min yderligere diffusionstid) sammenlignet med denne brugd for farmakologiske reagenser (typisk 0,3 - 0,5 pi over 2 - 3 min plus 1 - 3 min ekstra diffusion tid). Brugeren bør konsultere litteraturen og / eller empirisk bestemme parametrene bedst passer til deres behov. Uanset, succesen af denne procedure er kritisk afhængig af 4 variabler: 1) kanyle længde, 2) mikroinjektor længde, 3) kvaliteten af mikroinjektor sprøjtemønster, og 4) systemets integritet før injektion. Fordi mikroinjektion placering er afhængig af den dybde, at mikroinjektor rager ud fra kanylen, er det bydende nødvendigt, at både kanyler (trin 1.2.8) og mikroinjektor længde (post-bøjning, trin 2.2.1) er begge nøjagtigt kendt og ensartet mellem alle emner . Dette kan let kontrolleres ved hjælp af let at afvise enhver gennemføre det er ikke den ønskede længde på det endelige re-måling. Desuden kan injektionen placering kun forudsiges, hvis den forekommer umiddelbart under ledekanylen. Således enhver mikroinjektor der does ikke sprøjte en lang, fin strøm efter test (Trin 2.4.6) bør afvises. En kvalitet injektion er også relateret til systemets integritet før injektion. Hvis der efter dispensering alt vand fra injektoren (før påfyldning af reagens) flere pletter observeres på professionel tørre, derefter en lækage skal afhjælpes (Bemærk på trin 2.4.8). Yderligere, hvis boblen (trin 2.4.9), der adskiller medikamentet fra vandet i PE20 slange er ikke en enkelt boble (efter fyldning af mikroinjektor med reagens), derefter injektoren er delvist tilstoppet. Denne træsko kunne enten forhindre eller aflede injektionen. Også dette kan let afhjælpes (Bemærk på trin 2.4.8).
Skulle man ønske at microinject mens dyret er i stereotaktisk ramme er der tre alternativer. For det første kan man forøge længden af mikroinjektor kraven, således at den kan holdes fast ved stereotaktisk manipulator og også strække sig langt nok til at tillade forbindelse til PE20 rør. For det andet, påe kunne timeligt implantere en kanyle og bruge standard mikroinjektor præsenteres her. For det tredje, man kunne bruge tegnet og poleret glas pipetter. 16,17
En væsentlig begrænsning af den procedure, der præsenteres her, er, at det er bedst udføres i godt håndteres rotter, der er fortrolig med proceduren. Rotter, der anvendes til de data, der er beskrevet i resultatafsnittet krævede ingen særlige håndteringsprocedurer fordi den samme investigator håndteres rotterne dagligt i over 2 måneder. Dette omfattede daglige observation og manipulation af kirurgiske implantat i mindst 2 uger. Dog kan rotter hurtigt vænnes af en række teknikker, der anvendes til før præ-puls inhiberingsassay, som kan blive påvirket af stress. Disse særlige tilvænnings- teknikker er blevet pænt detaljeret tidligere. 43 Ud over disse procedurer, er det tilrådeligt, at rotter skal vænnes til mikroinjektion procedure, hvor forkortede microinjectors benyttes during 'sham "injektioner. Under disse simuleret injektioner, er det afgørende, at mikroinjektor ikke rage ind i væv med henblik på at begrænse vævsskader. Med andre ord bør mikroinjektor bøjes ikke længere end 14 mm. Således kunne den grundige tilvænning er nødvendig for en optimal gennemførelse af denne teknik ses som en begrænsning.
Mens flere adfærdsmæssige paradigmer eksisterer for at måle motivation, er den progressive forholdet almindeligt anvendt til at kvantificere den indsats, at motivet er villig til at øve at få en forstærker. Den progressive forhold paradigme producerer en foranstaltning kendt som breakpoint, som ofte defineres som det maksimale antal ringpresser i det sidst afsluttede forhold;.. Dvs maksimal reagere der genererede en forstærker 21 Den progressive forhold er følsomt over for forstærkningsmiddel størrelsesorden. For eksempel højere kokain (eller saccharose) doser giver en højere breakpoint og nedre kokain (eller saccharose) doser gav en lavere breakpFælles. 21,22 Følgelig breakpoint er et rutinemæssigt anvendes proxy for motivation og / eller forstærkende effekt. 21,23-26 Da hensigten med breakpoint er at bestemme, når dyret ikke reagerer, en vigtig parameter for den progressive forholdet paradigme er sessionslængde. Finite session længder kan sætte en falsk loft over breakpoint værdier, og dette kan forværres af forbehandlinger som unormalt nedsætter hastigheden af selv-administration eller at stigningen efter forstærkning pause. Denne forvirre kan overvindes ved et vilkårligt antal tilgange.. F.eks sessioner, der ophører, når dyret har tilbageholdt reagerer nogle multiplum af den gennemsnitlige inter-infusion intervallet 44 En mere almindeligt anvendt variant af denne fremgangsmåde er at afslutte sessioner gang reagere har blevet tilbageholdt af nogle empirisk bestemt værdi, der holdes konstant på tværs af fag. Vi har givet den metode til at anvende denne fremgangsmåde i trin 4.4.9.11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
References
- Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
- Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
- Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
- Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
- Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
- Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
- Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
- Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
- Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
- McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
- Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
- Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
- Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
- Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
- Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
- Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
- Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
- Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
- Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
- Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
- Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
- Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
- Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
- Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
- Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
- Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
- Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
- Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
- Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
- Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).
