Protocol
Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Virginia Commonwealth University en zich houden aan de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren.
1. Voorbereiding van Werktuigen voorafgaand aan de operatie en Microinjection
- Opgezet voor materiële voorbereiding:
- Verkrijgen 26 G canule tubing, 33 G afsluiter draad, 33 G micro-injectie naald buizen, microinjector plastic buis (PE20 of gelijkwaardig), twee middelzware straight hemostats, laboratorium tape, liniaal, permanent marker, 70% ethanol (v / v), opslag flesjes (bv 20 ml glas scintillatie), superlijm, kleine wegen boten, en roterende gereedschap uitgerust met een niet-zware cut-off disc.
Opmerking: Het beveiligen van de roterende gereedschap om een pipetpunt doos met banden of tape is nuttig, omdat het verheft het gereedschap. Het dragen van oogbescherming is belangrijk voor het voorkomen van letsel bij het gebruik van een roterende tool. - Bevestig een stuklab of autoclaaf tape naar de bank.
- Verkrijgen 26 G canule tubing, 33 G afsluiter draad, 33 G micro-injectie naald buizen, microinjector plastic buis (PE20 of gelijkwaardig), twee middelzware straight hemostats, laboratorium tape, liniaal, permanent marker, 70% ethanol (v / v), opslag flesjes (bv 20 ml glas scintillatie), superlijm, kleine wegen boten, en roterende gereedschap uitgerust met een niet-zware cut-off disc.
- Bereiding van canules:
Opmerking: Ten minste twee canules zijn nodig per rat voor een bilaterale injectie. Een extra canule wordt gebruikt in een latere stap.- Verwerven van een deel van canule buis van voldoende lengte om buiging tijdens het proces van het merken en snijden voorkomen.
- Teken een 15 mm referentie lijn op de tape van stap 1.1.2 met behulp van een fijne punt pen. Dit zal dienen als leidraad voor het markeren van sequentiële 15 mm hoofdstukken over de slang met een scherp permanent marker.
- Raak de canuleslang op gemarkeerde punten het langzame draaiende afgesneden schijf van het roterend gereedschap om de buis inkeping. Draai de canule 180˚ en Notch de tegenoverliggende zijde van de buis. Knip niet door de slang helemaal, omdat het kan leiden tot occlusie.
- Scherp buigen de buis om het breken in ~ 15 mm secties.
- Houd elke gesneden einde van de canule loodrecht op de cut-offdisc tussen de duim en wijsvinger. Draai de canule tubing terwijl het aanraken van de tip om de grote voorwaartse oppervlak van de cut-off schijf (dat wil zeggen, niet de rand). Dit zal een stomp uiteinde te genereren. Opmerking: Buig de canule, want dat zou een off-site injectie opleveren.
- Ream beide uiteinden van de canule met een 26 G naald afgeschuind (brown hub) zodat alle bramen zijn verwijderd en dat de canule vrij.
- Passeren van een monster van afsluiter draad gesneden ~ 35 mm door de snede canule om te controleren of er geen interne obstakels.
- Pick-up elke canule individueel gebruik ongeklemde hemostats en meet elke voltooide canule met een liniaal om ervoor te zorgen dat het is precies 14 mm in lengte.
- Bereiding van obturatoren:
- Klem een canule op ongeveer halve lengte met een gemiddelde gewicht, rechte hemostats. Leg de vergrendelde hemostaat op de bank. De canule moet loodrecht op de werkbank.
Opmerking: Dit canulemag niet worden gebruikt bij chirurgische ingrepen na gehouden door vergrendeld hemostaten, daar zij waarschijnlijk verbogen. - Feed ene uiteinde van obturator draad in de canule totdat de bank bereikt. Stuiteren de draad in de canule zodat een braam het niet verhinderen het bereiken van de bank,. Dwz het bereiken van de bodem van de canule. Goede afsluiter lengte zal verstopping en aanvullende weefsel littekens te voorkomen.
- Buig de draad door te knijpen met de vingers tot een ~ 30˚ hoek wordt gerealiseerd met behoud van het contact tussen de afsluiter en de bank. Zorg ervoor dat de hoek van de bocht is zodanig dat het legt gelijk met de hoofdkap en de overtollige gezichten naar voren, waardoor het moeilijker voor de rat te verwijderen.
- Verwijder de draad van de canules en snijd het overtollige gedeelte bij ~ 2,5 mm van de bocht met kleine diagonale messen (wire cutters).
Opmerking: Minstens zal twee obturators per rat vereist voor een bilaterale injectie, aangezien elke geïmplanteerde canule vereist een afsluiter. Creërenextra ~ 35˚ bocht halverwege de obturator ook helpen bij het voorkomen van verwijdering door het dier. Bewaar beide canules en obturators in afzonderlijke flesjes (bv., 20 ml glazen scintillatie) met 70% ethanol (v / v) tot gebruik, maar tenminste O / N.
- Klem een canule op ongeveer halve lengte met een gemiddelde gewicht, rechte hemostats. Leg de vergrendelde hemostaat op de bank. De canule moet loodrecht op de werkbank.
- Opstellen en testen van microinjectors:
- Het verkrijgen van een stuk microinjector naald buizenstelsel dat is ~ 1 m lang.
- Houd een uiteinde van de microinjector buis loodrecht vergrendeld rechte hemostats.
- Draai de hemostaat terwijl spanning op de slang aan het strak wikkelen rond de hemostaat minstens één keer.
- Meet 32 mm uit de tegenovergestelde, losse uiteinde van de microinjector buizen en op dit punt loodrecht vatten met een tweede rechte, middelzware hemostaat en sluit ze. Pak de microinjector buis met hemostats aan de kant van het 32 mm markeren dichtst bij het losse einde in plaats van aan de zijde het dichtst bij de hemostaat met gewikkelde draad.
- Bend de buis heen en weer terwijl spanning op de slang tot het breekt.
Opmerking: Een enkele, scherpe opwaartse en neerwaartse buiging een stompe breuk, hetgeen wenselijk is dat de micro-injectie optreedt in gewenste hersengebied produceren. - Inspecteer microinjector buis zodat beide uiteinden recht zijn en dat de binnendiameter is geblokkeerd.
- Verwerven canuleslang die wordt gebruikt om een microinjector kraag vervaardigen.
- Meet en markeer sequentiële 5 mm delen van canule buizen met behulp van een permanent marker en een 5 mm referentie lijn op tape (stap 1.1.2).
Opmerking: Elke microinjector vereist een kraag. Kragen zijn gewoon korte canules gehouden aan de microinjector draad. - Raak canuleslang op gemarkeerde punten het langzame draaiende cut-off disc roterend gereedschap om de buis inkeping. Draai de canule 180˚ en Notch de tegenoverliggende zijde van de buis. Volledig snijden kan de slang af te sluiten.
- Scherpbend microinjector kraag buis om het breken in ~ 5 mm secties.
- Ream de binnendiameter van beide uiteinden van de kraag met een 26 G naald afgeschuind (brown hub) ervoor zorgen dat de meeste bramen zijn verwijderd. Sommige kleine bramen zal de microinjector draad te grijpen en daarmee helpen bij het lijmen.
- Schuif een kraag op elk microinjectie buis ~ 2 cm van het uiteinde.
- Maak een klein zwembad van superlijm in de hoek van een kleine wegen boot.
- Gebruik schroot canuleslang gesneden tot ~ 25 mm een kleine hoeveelheid super lijm op de microinjector buis ~ 5 mm vanaf een einde. Schuif de kraag over deze super lijmrups zodat het ~ 1 mm van het uiteinde van de micro-injectie buis. Bedek beide uiteinden van de kraag met lijm.
Opmerking: Vermijd een grote ophoping van superlijm op de kraag, want het zal voorkomen dat de plastic slang van het afdichten rond de microinjector. Hoewel het belangrijk te voorkomen dat superlijm op het open uiteinde van de buis microinjectie, aangezien dit zalde microinjector onbruikbaar is ook belangrijk om de kraag zo dicht mogelijk bij het einde schuiven mogelijk void (niet-gespoten) volume te minimaliseren. - Hel het voltooide microinjector aan de buitenkant van een kleine gewichtboot met de kraag naar boven en laten drogen gedurende 24 uur.
- Het verkrijgen van een ~ 8 cm stuk microinjector plastic buis (PE20 of gelijkwaardig), 1 ml injectiespuit gevuld met steriel water en 26 G afgeschuinde naald (bruin hub).
- Bevestig een 26 G (bruin hub) naald spuit en schuif de cut slang op de naald, zodat de buis niet te doorboren.
- Schuif de plastic buis over de kraag uiteinde van gedroogde volledige microinjector.
- Knijp het met water gevulde zuiger te testen op doorgankelijkheid.
Opmerking: Water moet heel ver en recht uit de microinjector tip spuiten. Als de stroom niet recht is, zal de injectie locatie niet correct. De bron van een zijwaartse of diffuse spray is een slechte break (stap 1.4.5). Een microinjector mag geent worden gebruikt indien de spray zijwaarts of diffuus. Zoutoplossing mag niet worden gebruikt, omdat dit de microinjector of naald kon verstoppen. - Trek de spuit weer om water uit microinjector verwijderen. Bewaren in een droge, afgesloten flesje, bijvoorbeeld, een 20 ml glazen scintillatieflesje.
Opmerking: Microinjectors kunnen worden geautoclaveerd na de fabricage met de meeste super lijm, 31 maar dit moet empirisch worden bepaald. Alternatieve sterilisatietechnieken omvatten ethyleenoxide en gammastraling.
2. Voorbereiden voor en uitvoeren van micro-injecties
- Verkrijgen voltooid microinjectors, microinjectie plastic buis (PE20 of gelijkwaardig), micro-injectie pomp, twee kleine wegen boten, steriel water, 70% ethanol (v / v), aceton, twee gasdicht 1 ul glazen spuiten met een stompe naald (25 G), katoen getipte houten applicators, reserveonderdelen obturators, 1 ml spuit, 26 G (bruin hub) naald, kleine gebogen pincet (stijl # 7 wordt aanbevolen), en lab wipes.
- Het voorbereiden microinjectors voor injectie:
- Bend voltooid microinjectie 15 mm vanaf het uiteinde tegenover de kraag zodat de hoek tussen de twee is ~ 95˚.
Opmerking: Een nauwkeurige bocht locatie is absoluut noodzakelijk voor een nauwkeurige injectie locatie. Met behulp # 7 tang (of vergelijkbaar) met de microinjector grijpen en omhoog buigende nuttig. Altijd opnieuw meten de lengte voor het uitvoeren van micro-injecties. - Snij de kunststof buis (PE20) tot ~ 70 cm en schuif dan microinjector kraag.
Opmerking: Het toevoegen van tape tabs om een plastic buis in de buurt van zowel de microinjector en losse einde is handig bij het invullen van injecties, vooral bij het injecteren van twee verschillende oplossingen. Tabbladen worden niet aanbevolen voor beide buizen als ze lastig tijdens de injectie.
- Bend voltooid microinjectie 15 mm vanaf het uiteinde tegenover de kraag zodat de hoek tussen de twee is ~ 95˚.
- Het voorbereiden pomp voor micro-injecties:
- Voeding aan de pomp.
- Set diameter van micro-injectie naald, de gewenste infusiesnelheid en richten injectie volume.
Opmerking: De infusie rate en injectievolume is afhankelijk experimenteel eisen. Dit wordt uitgewerkt in de discussie. Sommige pompen hebben spuit tafels vooraf geladen. Zo niet, dan kan een tafel spuit te vinden op de productie website (s). - Stel mode pomp 'Volume', zodat een nauwkeurig volume automatisch wordt geleverd. Als 'Pump' mode in plaats daarvan is gekozen, moet de onderzoeker handmatig de pomp te stoppen.
- Stel de pomp backstop om de spuit te vullen met de injectie volume plus een extra 0,2 pi.
- Het voorbereiden van micro-injectie spuit en microinjector voor injectie:
- Lock elke gasdichte micro-injectie spuit in het rek van de micro-injectie pomp.
- Plaats het uiteinde van de gasdichte injectiespuit in het steriele water in een kleine gewichtboot en voorzichtig fladderen de zuiger om de interne draad smeren. Gelijkmatig trek de zuiger naar de backstop op de pomp te vullen met water.
- Schuif de PE20 slang die is cowo rden aangesloten de microinjector (stap 2,2) op een 26 G (brown hub) naald bevestigd aan een 1 ml spuit die is gevuld met steriel water. Spuiten steriel water door de microinjector en inspecteer spuitpatroon en afstand.
Opmerking: Water moet heel ver en recht uit de microinjector tip spuiten. Als de stroom niet recht is, zal de injectie locatie niet correct. - Plaats de gesteriliseerde microinjector op een steriel veld.
- Schuif de slang af van de naald, het bijhouden van de microinjector slang rechtop om te voorkomen dat water droop uit, terwijl ook het snijden van de buis onder het gebied beschadigd door de naald.
- Duw de micro-injectie zuiger enigszins uit naar een druppel aan het uiteinde van de naald te creëren en schuif de met water gevulde PE20 buis (die is aangesloten op de microinjector) op de naald.
Opmerking: Dit zal een vloeistof-to-liquid-verbinding die geschikt tegendruk zal toestaan dat een klomp die op zou kunnen vormen kon verjagen creërenhet topje van de microinjector. - Duw de zuiger helemaal naar voren voor te bereiden voor het monster het laden en ervoor te zorgen dat geen spoor ethanol blijft in het microinjector.
- Controleer de installatie op lekkage door het aanraken van het water druppel die zich heeft gevormd op het puntje van microinjector om een schone lab te vegen meerdere malen.
- Opmerking: Bij het aanraken van het lab te vegen, moet slechts een natte plek te vormen. Als er meer daalt, er een lek in het systeem.
- Vermijd lekken door het beheersen van superlijm applicatie (stap 1.4.14) en door het trimmen van de PE20 buis met een scherpe schaar of een scheermesje elke keer dat de PE20 slang wordt verwijderd van elke verbinding. Bovendien, herhaalt u de stappen 2.4.3 tot 2.4.8 om het lek te verhelpen.
- Pull zuiger terug 0,2 pl; creëren van een luchtbel tussen het steriele water in de slang PE20 / microinjector en de oplossing te injecteren.
- Opmerking: Deze bubbel voorkomt verdunning van het injectaat, besmetting van het water, en maaktvoor het bewaken van het injectieproces aangezien het bewegen tijdens de injectie. Een enkele, vaste bel worden geproduceerd. Als het gebroken is, een lek aanwezig is of de microinjector tip is afgesloten; aangeeft dat stap 2.4.8 (en de bijbehorende noot) worden herhaald.
- Plaats de microinjector in het reagens te worden geïnjecteerd en trek de zuiger naar de backstop.
- Het voorbereiden van dieren voor injectie:
- Houd de borst van de rat tegen de borst van de experimentator. Reinig het gebied rond canules met een katoenen applicator gedrenkt in 70% ethanol (v / v).
- Opmerking: Met de juiste behandeling, kunnen muizen voorzichtig worden tegengehouden in een cupped hand. Anders kan scruffing nodig.
- Verwijder obturators gebruik van kleine pincet en plaats in wegen boot met 70% ethanol (v / v).
- Het uitvoeren van injecties:
- Plaats gevuld microinjector (stap 2.4.10) in de canule. Druk op start op de micro-injectie pomp en de monitor bubble beweging.
- Opmerking: may nodig om lichte druk zodat microinjectors til toepassing. De bubble (gevormd in stap 2.4.9) moet uniform te bevorderen en volledig te voeren in de microinjector.
- Verwijder de microinjectors uit de canule en vervang obturators, wanneer de injectie is voltooid en de post-injectie diffusie periode voorbij is.
- Opmerking: Typische na injectie diffusie tijden zijn 2-4 min voor farmacologische reagentia en 2-10 min op virussen. Het verlaten van de microinjector in tijdens de post infusieperiode voorkomt dat de injectaat refluxen van een back-up van de canules in plaats van het verspreiden in het weefsel. Plaats afsluiters aan de zijkant van het ethanol gevulde gewichtboot om het ethanol af te voeren alvorens deze opnieuw in canule.
3. Post-Injectie Clean Up
- Verkrijgen een klein flesje van elk: steriel water, 70% EtOH, en aceton.
- Reinigen microinjector en micro-injectie spuit:
- Verwijder glasspuits van injectiepomp rek en micro-injectie slang van glas spuit.
- Koppel microinjector slang uit glazen spuit en bevestig een 1 ml injectiespuit gevuld met steriel water om de microinjector slang via een 26 G naald (bruin hub). Duw de 1 ml zuiger naar voren te verdrijven ~ 0,3 ml. Vervolgens raakt het topje van de microinjector naar een lab-wipe en trek de lucht terug door de microinjector.
Opmerking: De microinjectie leidingen kan worden hergebruikt voor soortgelijke experimenten als voorzichtig geacht. - Plaats glas naald in steriel water en trek de plunjer volledig terug. Vervolgens duw de zuiger helemaal naar voren te spoelen. Raak de glazen spuit tip om een lab te vegen om ervoor te zorgen dat er geen vloeistof blijft.
- Herhaal stap 3.2.3 met steriel water, lucht, 70% EtOH, aceton en in de volgende volgorde: steriel water, steriel water, lucht, lucht, 70% EtOH, 70% EtOH, lucht, lucht, aceton, aceton, lucht, lucht. Het uitvoeren van al deze schoonmaken stappen zullen bijdragen aan het behoud van de micro-injectie spuit.
- Plaats de microinjector injectiespuit (s) in de verpakking en trek de zuiger terug tot 0,05 ui.
Opmerking: Dit is belangrijk, omdat zij de zuiger worden geduwd of getrokken om een vast plunjer die kan optreden zou elk zout afzettingen na opslag verwijderen.
4. Programmering van Motivation Assay
- Log in op Grafische Staat met beheerdersreferenties.
- Selecteer of maak relevante database.
- Het creëren van progressieve verhouding versterking schema:
- Selecteer Lijsten> Database Level Lijsten> Evenement Transition Parameter lijsten.
- Selecteer 'Toevoegen'. Voer de juiste lijstnummer (L #) en de beschrijving.
- Selecteer 'Events toevoegen'.
- Voer de eerste versterking schema waarde en selecteer 'Toevoegen'. Herhaal.
Opmerking: De waarden kunnen worden bepaald door een formule waarin de geleidelijke verhouding schema = 5e (j * (bekrachtiger verdiend + 1)) -5 7.Om deze vergelijking te passen aan de hypothese goed te testen, moet de waarde j empirisch worden bepaald of uit de literatuur. - Selecteer 'In Order' binnen de 'Selection Order' doos.
- Selecteer 'Hold Waarde = naar: ____ "in de" als u klaar bent' doos. Voer de wapening schema waarde in het tekstvak dat veel groter is dan verwacht reageert. Dit zal de benodigde inspanning voor alle volgende data zijn zodra de lijst is uitgeput.
- Het creëren van een experimenteel protocol:
Opmerking: Graphic State beweegt het onderwerp door een reeks van staten die zijn afgesloten op basis van tijd of prestatiecriteria. Zet alle discrete en contextuele signalen en parameters hieronder gemarkeerd als '$' op passende wijze test de hypothese te onderzoeken.- Selecteer Bestand> Experiment Protocol.
- Voer het gewenste protocol en de omschrijving in de juiste tekstvak. Selecteer 'State Creation'.
- Zet alle prikkels voor zowel de 'RDY - Klaar Staat' en 'FIN - afgewerkte staat ".
- Selecteer 'Nieuwe Staat' en noemt het 'S2 - PR inspelen.
- Selecteer 'Nieuwe Staat' en noemt het 'S3 -. PR Reinforcer en Cue'
- Selecteer 'Nieuwe Staat' en noemt het 'S4 - Time-out'.
- Hoogtepunt 'S1' en noem het 'S1 -. Gewenning'
- Selecteer Toevoegen 'Time To Go. "
- Voer de juiste tijd ($) en eenheden ($), bijv., Minuten en selecteer 'S2' van AAN S keuzelijst. De tijdseenheid 'units' werd bepaald wanneer de database oorspronkelijk is gemaakt.
Opmerking: De gecreëerde tijd overgang moet vergelijkbaar zijn met [Na $ minuten GO P = 100%, tot S2] lezen Figuur 1 is een voorbeeld van dit evenement een keer gemaakt.
</ ol>
Figuur 1. Vertegenwoordiger programmering bijvoorbeeld # 1. In dit geval een keer gescheiden toestand wordt geïllustreerd, waarin een door de gebruiker gedefinieerde waarde van $, hier afgebeeld in minuten, geeft aan wanneer de huidige staat, nemen de afslag aan te geven 2 (S2).
- Hoogtepunt 'S2 - PR inspelen.
- Selecteer Add 'Event Ga naar.'
- Voer naam van de lijst met de progressieve verhouding schema dat is gemaakt in stap 4.3 in het eerste tekstvak als L $ (bijvoorbeeld L1), selecteert u de juiste operandum (bijv., Hendel of neus poke) van de eerste keuzelijst, en selecteer ' S3 'van AAN S keuzelijst.
Opmerking: De gemaakte gebeurtenis kan vergelijkbaar met lezen [IF L $ 1 - Actief GO P = 100%, tot S3]. De identifier 1 - Actieve werd aangewezen tijdens de database creatie. Hier, 1 - Actiefverwijst naar de operandum aangesloten op één schakelaar. - Selecteer 'Add Time Ga naar.'
- Controleer de 'R' Typ de juiste tijd en eenheden ($), en selecteer 'FIN' van AAN S keuzelijst.
Opmerking: De gemaakte time event kan vergelijkbaar zijn om te lezen [R (gecontroleerd) IF $ minuten GO P = 100%, tot FIN]. Dit zal ervoor zorgen dat de sessie eindigt als er geen activiteit op die operandum na de ingestelde drempel;. Dat wil zeggen, zal de sessie time-out nadat het dier weigert te reageren op de bekrachtiger gepaarde operandum voor de ingestelde tijd. - Selecteer Add 'Event Ga naar.'
- Vink het vakje 'R', voer 1 in het eerste tekstvak, selecteer de release van passende operandum van de eerste keuzelijst, en selecteer 'S2' van AAN S keuzelijst.
Opmerking: De gemaakte gebeurtenis kan vergelijkbaar te lezen [R (gecontroleerd) Na $ [1] Actief GO P = 100%, tot S2]. Deze stap verzekert dat na loslaten van de operandum(aangegeven door haakjes hierboven), dat de staat opnieuw geprogrammeerd, waardoor de sessie time-out drempel (4.4.9.4) resetten. Op dit punt, zal de staat te verlaten wanneer de progressieve verhouding in de lijst is voltooid (Stap 4.4.9.2) of de sessie time-out (Stap 4.4.9.4). Dus, elke keer dat de operandum wordt geactiveerd, telt mee voor de progressieve ratio. . En elke keer dat de operandum wordt geïnactiveerd, bijvoorbeeld, de hendel wordt losgelaten of de neus poke wordt verlaten, de Session time-out drempel (Stap 4.4.9.4) gereset Figuur 2 geeft alle overgangen geprogrammeerd voor 'S2 - PR Inspelen.. '
Figuur 2. Vertegenwoordiger programmering voorbeeld # 2. Hier, de staat wordt verlaten op een van de twee criteria. L $ is de progressieve verhouding schema gemaakt in stap 4.3. Bij schema completion, de staat uitgevoerd naar toestand 3 (S3). Merk op dat dit criterium niet over een R, die het mogelijk maakt de planning om in plaats van vooruit dan opnieuw beginnen bij elke terugkeer in deze staat. De staat kan ook afslag na '$' minuten te vermelden FIN. Dit is de vooraf bepaalde timeout drempel waarna de sessie zal worden beëindigd als binnen dit venster niet reageert optreedt. Dit wordt verder toegelicht in de discussie. Ten slotte wordt de sessie time-out drempel gereset op elke operandum release. Aldus [1] 'geeft vrijgave van operandum "1".
- Hoogtepunt 'S3 - PR Reinforcer en Cue.'
- Selecteer 'Add Time To Go'
- Voer de juiste tijd en eenheden van de bekrachtiger ($) te leveren, en selecteer 'S4' van AAN S keuzelijst.
Opmerking: De gemaakte time event kan vergelijkbaar zijn om te lezen [Na $ seconden GO P = 100%, tot S4].
- Hoogtepunt 'S4 - Time-out.'
- Voer de juiste tijd en eenheden te blijven in een inactieve toestand ($) volgende bekrachtiger levering, en selecteer 'S2' van AAN S keuzelijst.
Opmerking: De gemaakte time event kan vergelijkbaar zijn om te lezen [Na $ seconden GO P = 100%, tot S2]. State 'S4 - Timeout' kan niet worden verplicht voor alle modellen.
Opmerking: Dit protocol is nu klaar voor gebruik.
Representative Results
Hier illustreren we voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met de bovenstaande procedure. Getoond eerste is een typisch gebied dat is getransfecteerd met virale vectoren (Figuur 3). In het algemeen wordt een getransfecteerde volume van ~ 1 mm 3 verkregen striatale weefsels. Het volume van de getransfecteerde gebied kan worden gekwantificeerd over seriecoupes volgens methode Cavalieri 32 Belangrijk is dat de getransfecteerde volume hangt af van vele factoren zoals het soort weefsel dat wordt getransfecteerd.; virale serotype; promotor; snelheid en volume geïnjecteerd; aantal deeltjes geïnjecteerd; injectaat pH; en of hyperosmolaire reagentia, zoals mannitol, werden gebruikt. 33,34 Typisch, microinject we 10 12 deeltjes / ml, 1 pl / kant over 10 min, en laat 7 extra minuten voorafgaand aan het vervangen obturators. Bovendien, het injectaat in het algemeen ongeveer pH 8. Vervolgens laten we zien dat motivatie kunnen worden gemanipuleerd door hetzij transgenexpressie (figuur 4)of farmacologische reagens micro-injectie (Figuur 5).
In figuur 4, hebben wij op een Designer Receptor Exclusief geactiveerd door Designer Drugs (DREADDs). De DREADD-receptor coderende gebied werd gevolgd door een interne Ribosoom Entry Site en een mCitrine cassette. De mCitrine maakt gemakkelijke visualisatie van getransfecteerde cellen. De DREADD werd gekoppeld aan de heterotrimere G-eiwit Gaq. Activering van de Gaq gekoppelde DREADD kan astrocyten, 28,35 en DREADD zelf gestimuleerd kan worden geactiveerd door systemische toediening van clozapine-N-oxide (CNO, 3 mg / kg, ip). 14,22,36 Ratten werden getraind om hefboom reageren voor ethanol versterking, waarbij 3 hefboompersen leverde 1 kans om te drinken tijdens dagelijks 1 uur sessies meer dan 60 aaneengesloten dagen. Vervolgens werden ratten gedwongen onthouding en Gaq gekoppelde DREADDs werden uitgedrukt in nucleus accumbens kern astrocyten. Na 3 weken onthouding, de motivatie om zelf-admi Nister ethanol werd gemeten door breekpunt. 21,27-30 Activering van nucleus accumbens kern astrocyten, via systemische toediening CNO, daalde de motivatie van ratten ethanol zelftoediening hervatten na onthouding ten opzichte van het voertuig. Belangrijk CNO had geen effect op gelijkwaardige getrainde cohort dat uitte Green Fluorescent Protein plaats van de DREADD.
Figuur 3. Vertegenwoordiger ventrale striatum regio getransfecteerd door gemicroinjecteerd virus. Deze afbeelding toont de regio nucleus accumbens astrocyten die werden getransfecteerd door het volgen van de bovenstaande methode. De gegevens worden overgenomen uit Bull et al. 13 met toestemming van de copyrighthouder. Details zijn te vinden in deze publicatie en de bijbehorende aanvullend materiaal.blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Motivatie van de ratten zichzelf toedienen ethanol werd gereduceerd door het activeren van een transgen dat was over-uitgedrukt in de nucleus accumbens kern astrocyten. Virus werd gemicroinjecteerd en motivatie gemeten via breekpunt na aftrek één week voor het virus uit te drukken. De transgene uitgedrukt werd een Designer Receptor Exclusief geactiveerd door Designer Drugs (DREADDs). Een eenzijdige ANOVA (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), gevolgd door Scheffe post-hoc gebleken dat de activering van de DREADD door systemische toediening van clozapine-N-oxide (CNO, 3 mg / kg, ip ) verminderde significant de motivatie van ratten zichzelf toedienen ethanol na onthouding opzichte voertuig CNO geen effect op gelijkwaardige getrainde cohort dat uitte Green Fluorescent Protein (GFP hadden) in plaats van de DREADD. De gegevens worden overgenomen uit Bull et al. 13 met toestemming van de copyrighthouder. Details zijn te vinden in deze publicatie en de bijbehorende aanvullend materiaal.
Figuur 5. Micro-injectie van gap junction blokkers vergroot de motivatie van ratten zelftoediening ethanol na onthouding twee gap junction blockers werden geëvalueerd op hun effect op de motivatie (gemeten via breekpunt) van ratten zelftoediening ethanol. Mefloquine en 18- a-glycyrrhetinezuur (18-α). Een twee-weg ANOVA toonde dat micro-injectie van gap-junction blockers in de nucleus accumbens kern vergroot de motivatie van ratten zelftoediening ethanol na onthouding (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). De gegevens worden overgenomen uit Bull et al. 13 met toestemming van de copyrighthouder. Details zijn te vinden in deze publicatie ende bijbehorende aanvullende materiaal.
Discussion
De hier voorgestelde werkwijze is een efficiënt middel om microinjectie canules en microinjectors die zullen helpen bij het ophelderen van de moleculaire substraten gemotiveerd gedrag produceren. Deze methode biedt verschillende voordelen. Ten eerste, door de productie van het eigen implantaten en microinjectors, nieuwe experimentele parameters kan snel worden geoptimaliseerd, dat wil zeggen, hoeft men niet te wachten op maat gemaakte onderdelen te komen. Ten tweede, als gevolg van de kleine diameter van de canule, meer canules gelijktijdig worden geïmplanteerd. Dit verkort de vereiste chirurgische tijd, die overlevingskansen kan verbeteren, en maakt ook meerdere implantaten per dier. Ten derde, de software waarmee de operante kamers besturen gemakkelijk geschikt progressieve verhouding schema aangezien een vaste verhouding paradigma snel worden omgezet in een progressieve verhouding paradigma door eenvoudig aanbrengen van een gebeurtenis overgang parameter lijst die de gewenste versterking schema bevat.
Zijnalgemeen nuttig, micro-injectie werd een algemene procedure voorgesteld die in het algemeen toepasbaar voor de micro-injectie van vrijwel elk reagens momenteel beschikbaar moeten zijn. Daarom verwachten we dat deze techniek blijft vergelijkbare hoge gebruikswaarde in de toekomst met kleine wijziging worden. Door het veranderen van slechts enkele variabelen, kan deze benadering worden toegepast op een groot aantal reagentia. Parameters die het vaakst worden gemanipuleerd omvatten de lengte die de microinjector uitsteekt uit de canule, injectievolume en injectiesnelheid. Zo kan men wil dat de injector verder uitsteken van de canule-uiteinde naar het gliale litteken gewoonlijk vormt rond chronische implantaten te voorkomen. Bovendien kan men wensen om een groter volume te injecteren. Voor striatale virus micro-injecties, wordt een volume van 1 ui kenmerkend gebruikt en deze hoeveelheid wordt gewoonlijk geïnjecteerd over een langere periode (vaak 7-10 min plus 3 - 10 min aanvullende diffusie tijd) in vergelijking met die gebruikd voor farmacologische reagentia (typisch 0,3-0,5 ul meer dan 2 - 3 min plus 1-3 min extra diffusie tijd). De gebruiker moet de literatuur raadplegen en / of empirisch bepalen van de parameters die het meest geschikt voor hun behoeften. Ondanks het succes van deze procedure is kritisch afhankelijk van variabelen 4: 1) canule lengte, 2) microinjectie length, 3) de kwaliteit van microinjectie spuitpatroon, en 4) de integriteit van het systeem voorafgaand aan injectie. Omdat microinjectie locatie afhankelijk van de diepte die de microinjector uitsteekt uit de canule, is het noodzakelijk dat beide canules (stap 1.2.8) en microinjectie lengte (na buiging, stap 2.2.1) beide nauwkeurig bekend en uniform tussen alle vakken . Dit kan gemakkelijk worden geregeld door eenvoudig verwerpen elk werktuig dat niet de vereiste lengte van het uiteindelijke opnieuw meten. Bovendien kan de injectie locatie alleen voorspeld als het direct onder de geleidingscanule optreedt. Dus elke microinjector dat does niet spuit een lange, fijne stroom na het testen (stap 2.4.6) moet worden afgewezen. Een kwaliteit injectie is ook gerelateerd aan de integriteit van het systeem voorafgaand aan injectie. Als u na het afgeven van al het water uit de injector (voorafgaand aan het vullen met reagens) meerdere plekken worden waargenomen op de lab-vegen, dan moet een lek te worden verholpen (Let op stap 2.4.8). Indien verder de bel (stap 2.4.9) dat het medicijn scheidt van het water in de PE20 slang niet één enkele bel (na het vullen van de microinjector met reagens), dan is de injector is gedeeltelijk verstopt. Deze klomp kan zowel voorkomen of af te leiden van de injectie. Ook dit kan gemakkelijk worden verholpen (Let op stap 2.4.8).
Indien men wenst microinject terwijl het dier in de stereotaxische kader zijn er drie mogelijkheden. Ten eerste kan men de lengte van de microinjector kraag zodat deze stevig kan worden vastgehouden door de stereotaxische manipulator en ook tot ver genoeg om verbinding met PE20 buismateriaal laten toenemen. Anderzijds ope kon tijdelijk implanteren van een canule en gebruik de standaard microinjector hier gepresenteerd. Ten derde, men kon gebruiken getrokken en gepolijst glas pipetten. 16,17
Een belangrijke beperking van de hier gepresenteerde methode is dat het best uitgevoerd in goed behandelde ratten die bekend zijn met de procedure zijn. Ratten die voor het bij de Resultaten genoemde gegevens vereist geen speciale behandelingsprocedures omdat dezelfde onderzoeker behandelde ratten dagelijks gedurende meer dan 2 maanden. Dit omvatte dagelijkse waarneming en manipulatie van het chirurgisch implantaat minstens 2 weken. Echter, ratten snel worden gewend door een aantal technieken die gebruikt worden om voor de pre-puls inhibitie assay, die kan worden beïnvloed door stress. Deze speciale gewenning technieken zijn goed eerder beschreven. 43 Naast deze procedures, is het raadzaam dat ratten worden gewend aan de micro-injectie procedure waarbij verkort microinjectors gebruik during 'schijnvertoning' injecties. Tijdens deze sham-injecties, is het essentieel dat de microinjector niet uitsteekt in het weefsel teneinde weefselbeschadiging te beperken. Met andere woorden, de microinjector niet meer dan 14 mm worden gebogen. Zo zou de grondige gewenning vereist voor optimale toepassing van deze techniek worden beschouwd als een beperking.
Terwijl verschillende behavioral paradigma's bestaan om de motivatie te meten, is de progressieve verhouding vaak gebruikt om de inspanning die het onderwerp bereid is om te oefenen om een reinforcer verkrijgen kwantificeren. De progressieve verhouding paradigma vormt een maatregel bekend als breekpunt, dat vaak wordt gedefinieerd als het maximale aantal hefboompersen tijdens het laatste volledige verhouding;.. Dat wil zeggen, maximale reactie die opgewekt bekrachtiger 21 De progressieve verhouding is gevoelig voor magnitude bekrachtiger. Bijvoorbeeld hogere cocaïne (of sacharose) doses produceren een hogere breekpunt en lagere cocaïne (of sacharose) doses leveren een lagere breakpoint. 21,22 Dienovereenkomstig breekpunt is een routinematig gebruikte proxy motivatie en / of versterkende werking. 21,23-26 Door de bedoeling van het breekpunt te bepalen wanneer het dier reageert, een belangrijke parameter van de progressieve verhouding paradigma sessielengte. Eindige sessie lengtes kan een vals pet op breekpunt waarden te zetten en dit kan worden verergerd door pre-behandelingen die abnormaal verminderen de snelheid van zelf-toediening of die stijging na versterking pauzeren. Deze verwarren kan worden overwonnen door een aantal benaderingen,.. Bijvoorbeeld sessies opgeheven wanneer het dier is ingehouden reageert op een meervoud van de gemiddelde inter-infusie interval 44 Een algemeen toegepaste variant van deze benadering is om sessies te beëindigen zodra reageren heeft ingehouden door een empirisch bepaalde waarde die constant over onderwerpen wordt gehouden. We hebben de methode om deze aanpak toe te passen in stap 4.4.9.11 verstrekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
References
- Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
- Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
- Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
- Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
- Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
- Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
- Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
- Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
- Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
- McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
- Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
- Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
- Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
- Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
- Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
- Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
- Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
- Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
- Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
- Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
- Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
- Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
- Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
- Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
- Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
- Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
- Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
- Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
- Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
- Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).
