Protocol
Procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) presso la Virginia Commonwealth University e di aderire alla guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione di Utensili Prima di Chirurgia e Microiniezione
- Istituito per la preparazione del materiale:
- Ottenere 26 G tubo della cannula, 33 G filo otturatore, 33 G tubi microiniezione ago, tubi microinjector plastica (PE20 o equivalente), due di peso medio emostatiche rette, nastro laboratorio, righello, pennarello indelebile, il 70% di etanolo (v / v), stoccaggio flaconi (ad esempio, 20 ml in vetro a scintillazione), colla super, piccole pesano imbarcazioni, e utensile rotante dotati di un dovere non-pesante disco di taglio.
Nota: Garantire l'utensile rotante a una casella di punta della pipetta con cinghie o nastro è utile, in quanto eleva lo strumento. Indossare la protezione degli occhi è importante per evitare lesioni durante l'utilizzo di un utensile rotante. - Ponete un pezzodi laboratorio o nastro autoclave in panchina.
- Ottenere 26 G tubo della cannula, 33 G filo otturatore, 33 G tubi microiniezione ago, tubi microinjector plastica (PE20 o equivalente), due di peso medio emostatiche rette, nastro laboratorio, righello, pennarello indelebile, il 70% di etanolo (v / v), stoccaggio flaconi (ad esempio, 20 ml in vetro a scintillazione), colla super, piccole pesano imbarcazioni, e utensile rotante dotati di un dovere non-pesante disco di taglio.
- Preparazione di cannule:
Nota: Almeno due cannule sono necessari per ratto per una iniezione bilaterale. Una cannula supplementare sarà utilizzato in un passaggio successivo.- Acquisire una sezione di tubo della cannula di lunghezza sufficiente per evitare torsioni durante il processo di marcatura e taglio.
- Tracciare una linea di riferimento 15 millimetri sul nastro dal punto 1.1.2 utilizzando una penna a punta fine. Questo servirà come guida per la marcatura di sezioni sequenziali 15 mm sul tubo utilizzando un pennarello indelebile tagliente.
- Premere il tubo della cannula, nei punti contrassegnati, al lento disco rotante di taglio dell'utensile rotativo per intaccare il tubo. Ruotare la cannula 180˚ e intaccare il lato opposto del tubo. Non tagliare il tubo completamente, perché può portare a occlusione.
- Acutamente piegare il tubo in modo da rompere in ~ 15 sezioni mm.
- Tenere ogni estremità tagliate della cannula perpendicolare al cut-offdisco tra il pollice e l'indice. Ruotare il tubo della cannula mentre toccando la punta alla grande superficie anteriore del disco di taglio (cioè, non il bordo). Questo genererà un suggerimento smussati. Nota: Non piegare la cannula, per che potrebbe dare una iniezione fuori sede.
- Ream entrambe le estremità della cannula con un ago 26 G smussato (hub marrone) per garantire che tutte le bave sono stati rimossi e che la cannula sia ostruito.
- Passare un campione di taglio filo dell'otturatore per ~ 35 mm attraverso la cannula taglio per verificare che non vi siano ostacoli interni.
- Pick up ogni cannula utilizzando singolarmente hemostats sbloccata e misurare ogni cannula completato con un righello per assicurarsi che sia esattamente 14 millimetri di lunghezza.
- Preparazione di otturatori:
- Fissare una cannula a circa mezzo busto con peso medio, hemostats diritte. Posare il hemostat bloccato in panchina. La cannula deve essere perpendicolare al banco.
Nota: Questo cannulanon deve essere utilizzato in chirurgia dopo essere stato tenuto per emostasi bloccati, in quanto è probabile piegata. - Introdurre una estremità di filo otturatore nella cannula fino al raggiungimento del banco. Rimbalzo il filo nella cannula per assicurare che una fresa non impedisca il raggiungimento della panchina,. Cioè, raggiungere il fondo della cannula. Lunghezza otturatore corretta impedisce l'intasamento e cicatrici di tessuto aggiuntivo.
- Piegare il filo da pizzicare con le dita fino a un angolo di ~ 30˚ si ottiene mantenendo il contatto tra l'otturatore e la panchina. Assicurarsi che l'angolo della curva è tale che esso definisce filo con il cappuccio della testina, e l'eccesso rivolto in avanti, rendendo più difficile per il ratto da rimuovere.
- Rimuovere il filo dalla cannule e tagliare la parte in eccesso a ~ 2,5 mm dalla curva con piccole frese diagonali (frese metalliche).
Nota: Almeno due otturatori saranno necessari per ratto per un'iniezione bilaterale e ciascuna cannula impiantato richiede un otturatore. Creazioneun ulteriore metà ~ 35˚ piegato attraverso l'otturatore anche aiutare a prevenire la rimozione dall'animale. Conservare sia cannule e otturatori in fiale separate (ad es., 20 ml di vetro scintillazione) contenente 70% di etanolo (v / v) fino al momento dell'uso, ma almeno O / N.
- Fissare una cannula a circa mezzo busto con peso medio, hemostats diritte. Posare il hemostat bloccato in panchina. La cannula deve essere perpendicolare al banco.
- Preparazione e test di microiniettori:
- Ottenere un pezzo di tubo dell'ago microinjector che è ~ 1 m di lunghezza.
- Tenere una estremità del tubo microinjector perpendicolarmente emostatiche rette bloccate.
- Twist all'emostato mantenendo la tensione sul tubo per avvolgerlo strettamente attorno al hemostat almeno una volta.
- Misurare 32 mm dalla opposta estremità libera del tubo microinjector e afferrare questo punto perpendicolarmente con una seconda lisci, emostatico peso e bloccarli. Afferrare il tubo microinjector con hemostats sul lato dei 32 mm segnare più vicina alla estremità libera piuttosto che sul lato più vicino al hemostat con filo avvolto.
- Bend il tubo avanti e indietro, mantenendo la tensione sul tubo fino a rompersi.
Nota: Un singolo, curva a gomito verso l'alto e verso il basso produrrà una pausa smussato, che è opportuno garantire che la microiniezione si verifica nella regione del cervello desiderato. - Controllare tubi microinjector per assicurare che entrambe le estremità siano diritti e che il diametro interno è ostruita.
- Acquisire tubo della cannula che verrà utilizzata per produrre un collare microinjector.
- Misurare e segnare sequenziali sezioni 5 mm di tubo cannula utilizzando un pennarello indelebile e una linea di riferimento 5 millimetri disegnato su nastro (fase 1.1.2).
Nota: Ogni microinjector richiede un collare. Collari sono semplicemente breve cannule aderito al filo microinjector. - Premere tubo della cannula, nei punti contrassegnati, al lento disco rotante di taglio dell'utensile rotante per intaccare il tubo. Ruotare la cannula 180˚ e intaccare il lato opposto del tubo. Taglio completamente può occludere il tubo.
- Acutamentecurvatura tubi collare microinjector al fine di rompere in ~ 5 sezioni mm.
- Alesare il diametro interno di entrambe le estremità del collare con un ago 26 G smussato (hub marrone) per assicurare che la maggior parte delle bave sono stati rimossi. Alcune piccole sbavature afferreranno il filo microinjector e quindi aiutare nella incollaggio.
- Far scorrere un collare su ogni tubo microinjector ~ 2 cm dalla fine.
- Creare una piccola piscina di super colla in un angolo di una piccola barca pesare.
- Utilizzare tubo della cannula scarto tagliare a ~ 25 mm per applicare una piccola quantità di colla super al tubo microinjector ~ 5 millimetri da un capo all'altro. Poi, far scivolare il collare su questo branello colla eccellente in modo che sia ~ 1 mm dall'estremità del tubo microiniezione. Coprire entrambe le estremità del collare con la colla.
Nota: evitare un grande accumulo di super colla sul colletto, in quanto impedisce il tubo di plastica da sigillare tutto il microinjector. Mentre è importante evitare che la colla eccellente sull'estremità aperta del tubo microinjector, come questo faràmicroinjector inutilizzabile, è anche importante per far scorrere il collare come vicino alla fine possibile per minimizzare il volume vuoto (non per iniezione). - Appoggiarsi microinjector completato all'esterno di un'altra piccola barca pesare con il lato collare e lasciare asciugare per 24 ore.
- Ottenere un ~ 8 centimetri pezzo di tubo di plastica microinjector (PE20 o equivalente), 1 siringa ml riempita con acqua sterile, e il 26 ago G smussato (hub marrone).
- Collegare un 26 G (hub marrone) ago per siringa e far scorrere il tubo tagliato l'ago, assicurando di non forare il tubo.
- Far scorrere il tubo di plastica sopra l'estremità del collare, secchi, microinjector completo.
- Spremere il stantuffo della siringa piena d'acqua per verificare la pervietà.
Nota: L'acqua deve spruzzare molto lontano e non appena estratto dalla punta microinjector. Se il flusso non è diritta, la posizione di iniezione non sarà valido. La fonte di uno spray lateralmente o diffusa è un povero pausa (fase 1.4.5). Un microinjector dovrebbe not essere utilizzato se lo spray è lateralmente o diffusa. Saline non deve essere utilizzato, in quanto potrebbe intasare la microinjector o un ago. - Estrarre la siringa indietro per rimuovere l'acqua dal microinjector. Conservare in luogo asciutto, fiala chiusa, ad esempio, a 20 ml di scintillazione flaconcino di vetro.
Nota: microiniettori possono essere sterilizzati in autoclave dopo la fabbricazione con la maggior parte colle super, 31 ma questo devono essere determinati empiricamente. Tecniche di sterilizzazione alternativi comprendono ossido di etilene e raggi gamma.
2. Preparazione e fase di microiniezioni
- Ottenere microiniettori completati, tubi microinjector plastica (PE20 o equivalente), pompa microiniezione, due piccole pesano barche, acqua sterile, etanolo al 70% (v / v), acetone, due siringhe a tenuta di gas 1 ml di vetro con un ago smussato (25 G), cotone punta applicatori di legno, otturatori di ricambio, siringa da 1 ml, 26 G (hub marrone) ago, piccole pinze curve (stile # 7 è raccomandato), e laboratorio wIPES.
- Preparazione microiniettori per l'iniezione:
- Bend completato microinjector 15 mm dall'estremità opposta al collare in modo che l'angolo tra i due è ~ 95˚.
Nota: Una precisa posizione curva è fondamentale per la posizione iniezione preciso. Utilizzando # 7 pinze (o simile) per afferrare la microinjector e piegando verso l'alto è utile. Sempre ri-misurare la lunghezza prima di eseguire microiniezioni. - Tagliare il tubo di plastica (PE20) a ~ 70 cm e scivolare sopra collare microinjector.
Nota: L'aggiunta di schede di nastro per un tubo di plastica vicino sia microinjector ed estremità libera è utile al momento di compilare le iniezioni, soprattutto quando si somministra due diverse soluzioni. Le schede non sono raccomandati per entrambi i tubi mentre diventano ingombranti durante l'iniezione.
- Bend completato microinjector 15 mm dall'estremità opposta al collare in modo che l'angolo tra i due è ~ 95˚.
- Preparazione della pompa per microiniezioni:
- Accendere la pompa.
- Set diametro di microiniezione ago, velocità di infusione desiderato, e di destinazione volume di iniezione.
Nota: Il ratto infusoe e volume di iniezione dipende da esigenze sperimentali. Questo è elaborato in discussione. Alcune pompe hanno tavoli siringa pre-caricati. In caso contrario, una tabella siringa può essere trovato sul sito web fabbricazione (s). - Impostare la modalità pompa di 'volume' in modo che un volume preciso viene consegnato automaticamente. Se la modalità 'pompa' viene invece selezionata, lo sperimentatore deve fermare manualmente la pompa.
- Regolare l'arresto della pompa per permettere la siringa per riempire il volume di iniezione più un ulteriore 0,2 ml.
- Preparazione siringa microiniezione e microinjector per l'iniezione:
- Bloccare ogni siringa microiniezione a tenuta di gas nel rack della pompa microiniezione.
- Posizionare la punta della siringa a tenuta di gas in acqua sterile contenuta in una piccola barca pesare e flutter delicatamente lo stantuffo per lubrificare il cavo interno. Uniformemente tirare lo stantuffo per l'arresto della pompa a riempirsi d'acqua.
- Far scorrere il tubo PE20 che è connected al microinjector (al punto 2.2) su un 26 G (hub marrone) ago attaccato ad una siringa da 1 ml che viene riempito con acqua sterile. Spruzzare acqua sterile attraverso microinjector, e ispezionare modello di spruzzo e la distanza.
Nota: L'acqua deve spruzzare molto lontano e non appena estratto dalla punta microinjector. Se il flusso non è diritta, la posizione di iniezione non sarà valido. - Posizionare il microinjector sterilizzato su un campo sterile.
- Far scorrere il tubo fuori dell'ago, mantenendo il tubo microinjector verticale per evitare che l'acqua gocciolante mentre anche il taglio del tubo sotto l'area danneggiata dall'ago.
- Spingere il pistone della siringa microiniezione leggermente in avanti per creare una goccia sulla punta dell'ago e far scorrere il tubo PE20 pieno d'acqua (che è collegato al microinjector) sull'ago.
Nota: Questo creerà una connessione liquido-liquido che permetterà appropriata contropressione che potrebbe sloggiare uno zoccolo che potrebbe formarsila punta del microinjector. - Spingere lo stantuffo completamente in avanti per preparare il caricamento del campione e garantire che nessun etanolo rimane traccia nel microinjector.
- Controllare l'impostazione di perdite toccando la goccia d'acqua che si è formata sulla punta di microinjector ad un laboratorio pulito pulire più volte.
- Nota: Se si tocca al laboratorio pulire, solo una macchia di bagnato dovrebbe costituire. Se ci sono più gocce, vi è una perdita nel sistema.
- Evitare perdite controllando applicazione colla super (Step 1.4.14) e da taglio il tubo PE20 con le forbici taglienti o una lama di rasoio in qualsiasi momento che il tubo PE20 viene rimosso da qualsiasi connessione. Inoltre, ripetere i punti 2.4.3 tramite 2.4.8 per porre rimedio alla perdita.
- Tirare indietro lo stantuffo della siringa 0,2 ml; creando una bolla tra l'acqua sterile nel tubo PE20 / microinjector e la soluzione da iniettare.
- Nota: Questa bolla impedisce diluizione l'iniettato, contaminazione delle acque, e permetteper il controllo del processo di iniezione poiché si muoverà durante l'iniezione. Un unico, bolla solido dovrebbe essere prodotto. Se è rotto, è presente una perdita o la punta microinjector è occluso; indicando che passo 2.4.8 (e la nota di accompagnamento) deve essere ripetuto.
- Posizionare il microinjector nel reagente da iniettare e tirare lentamente lo stantuffo della siringa per l'arresto.
- Preparazione degli animali per l'iniezione:
- Tenere torace del topo contro il petto dello sperimentatore. Pulire l'area intorno cannule con un applicatore di cotone imbevuto di etanolo al 70% (v / v).
- Nota: Con una corretta manipolazione, i topi possono essere trattenuti delicatamente in una mano a coppa. In caso contrario, Scruffing può essere richiesto.
- Rimuovere otturatori con piccoli pinze e posto in pesare barca con il 70% di etanolo (v / v).
- Esecuzione di iniezioni:
- Posizionare microinjector riempita (passo 2.4.10) nella cannula. Premere start della pompa microiniezione e movimento bolla monitor.
- Nota: E 'MAy essere necessario applicare una leggera pressione per garantire che microiniettori non sollevano. La bolla (formata in fase 2.4.9) deve avanzare in modo uniforme e pienamente entrare nel microinjector.
- Rimuovere le microiniettori dalla cannula e sostituire otturatori, una volta che l'iniezione è completa e il periodo di diffusione post-iniezione è passato.
- Nota: i tempi di diffusione dopo l'iniezione tipici sono 2-4 minuti per reagenti farmacologiche, e 2-10 minuti per i virus. Lasciando microinjector durante il periodo post di infusione impedisce l'iniettato da riflusso backup cannule, piuttosto che diffondere nel tessuto. Posizionare otturatori sul lato della barca etanolo-riempita pesare per consentire l'etanolo di drenare prima di reinserire nella cannula.
3. post-iniezione Clean Up
- Ottenere una piccola fiala di ciascuno: acqua sterile, 70% EtOH, e acetone.
- Pulizia microinjector e microiniezione siringa:
- Rimuovere siringa di vetros dalla siringa pompa rack e tubi microiniezione da siringa di vetro.
- Staccare il tubo microinjector da siringa di vetro e allegare una siringa da 1 ml riempita con acqua sterile per il tubo microinjector tramite un 26 ago G (hub marrone). Spingere il 1 ml stantuffo della siringa in avanti per espellere ~ 0,3 ml. Avanti, toccare la punta del microinjector ad un laboratorio-wipe e tirare l'aria indietro attraverso la microinjector.
Nota: Il microinjector e il tubo possono essere riutilizzati per esperimenti simili, se ritenuto prudente. - Posizionare vetro siringa in acqua sterile e disegnare stantuffo completamente indietro. Avanti, spingere lo stantuffo completamente in avanti per irrigare. Toccare la punta della siringa di vetro di un laboratorio di pulire per garantire che rimanga liquido.
- Ripetere passaggio 3.2.3 con acqua sterile, aria, 70% EtOH, e acetone nel seguente ordine: acqua sterile, acqua sterile, aria, aria, 70% EtOH, 70% EtOH, aria, aria, acetone, acetone, aria, l'aria. Esecuzione di tutti questi passaggi di pulizia contribuirà a preservare la siringa microiniezione.
- Posizionare la siringa microinjector (s) nel packaging e tirare stantuffo a 0,05 ml.
Nota: Questo è importante, in quanto consente lo stantuffo di essere spinto o tirato per sloggiare un pistone bloccato che può verificarsi dovrebbe eventuali depositi salini formare dopo la conservazione.
4. Programmazione della motivazione Assay
- Entra nel grafico di Stato con credenziali di amministratore.
- Selezionare o creare database in questione.
- Creazione di progressivo programma rapporto di armatura:
- Elenchi di selezione> Liste a livello di database> Evento Liste Transizione parametri.
- Seleziona 'Aggiungi'. Inserire adeguato numero della lista (L #) e la descrizione.
- Seleziona 'Aggiungi Eventi'.
- Immettere il primo valore programma di rinforzo e selezionare 'Aggiungi'. Ripetere.
Nota: I valori possono essere determinate utilizzando una formula in cui la pianificazione rapporto progressivo = 5e (j * (rinforzo guadagnato + 1)) -5 7.Al fine di adattare questa equazione per testare adeguatamente tale ipotesi, il valore j deve essere determinata empiricamente o ottenute dalla letteratura. - Seleziona 'in ordine' all'interno del 'Selection Order' scatola.
- Seleziona 'Hold Value = a: ____' nella casella 'Quando finito'. Immettere il valore programma di rinforzo nella casella di testo che di gran lunga supera previsto rispondere. Questo sarà lo sforzo necessario per tutte le voci successive una volta che l'elenco è stato esaurito.
- Creazione di un protocollo sperimentale:
Nota: Graphic Stato sposta il soggetto attraverso una serie di stati che sono usciti basata sul tempo o criteri di prestazione. Impostare tutti i segnali ei parametri discreti e contestuali marcati qui di seguito come '$' per testare adeguatamente l'ipotesi in esame.- Selezionare File> Crea Esperimento protocollo.
- Inserire il numero di protocollo desiderato e descrizione in casella di testo appropriata. Seleziona 'Creazione di Stato'.
- Impostare tutti gli stimoli sia per il 'RDY - Stato Ready' e 'FIN - Stato finito'.
- Seleziona 'Nuovo Stato' e il nome 'S2 - PR risponde.
- Seleziona 'Nuovo Stato' e il nome 'S3 - PR Rafforzatore e Cue.'
- Seleziona 'Nuovo Stato' e il nome 'S4 - Timeout'.
- Evidenziare 'S1' e il nome 'S1 - assuefazione.'
- Seleziona Aggiungi 'Time Go To.'
- Inserire momento opportuno ($) e le unità ($), ad es., I minuti e selezionare 'S2' da S casella a discesa TO. L'unità «unità» di tempo è stato determinato quando il database è stato inizialmente creato.
Nota: Il tempo di transizione creata dovrebbe contenere simile a [Dopo $ minuti GO P = 100%, TO S2] Figura 1 è un esempio di questo evento una volta creato.
</ ol>
Figura 1. programmazione rappresentativa esempio # 1. In questo caso uno stato delimitato tempo è illustrato in cui un valore definito dall'utente di $, mostrata qui in minuti, indica quando lo stato corrente dovrebbe uscire allo stato 2 (S2).
- Evidenziare 'S2 - PR risponde.
- Seleziona Aggiungi 'evento Vai a.'
- Inserisci il nome della lista che contiene la pianificazione rapporto progressista che è stato creato nel passaggio 4.3 nella prima casella di testo come L $ (ad esempio, L1), selezionare il operandum appropriata (ad es., La leva o il naso Poke) dal primo menu a cascata, e seleziona ' S3 'da TO S casella a discesa.
Nota: L'evento creato può leggere simile a [SE L $ 1 - Attivo GO P = 100%, a S3]. L'identificativo 1 - Attivo è stato designato durante la creazione del database. Qui, 1 - attivosi riferisce al operandum inserito un interruttore. - Seleziona 'Aggiungi Tempo Vai a.'
- Casella 'R', immettere l'ora e di unità ($), e selezionare 'FIN' da TO S casella a discesa.
Nota: L'evento tempo creato può leggere simile a [R (selezionato) se $ minuti GO P = 100%, AL FIN]. Questo farà sì che la sessione finirà se non c'è attività sul operandum che dopo la soglia impostata,. Ad esempio, la sessione timeout dopo che l'animale trattiene di rispondere sul operandum rinforzo-accoppiato per il periodo di tempo. - Seleziona Aggiungi 'evento Vai a.'
- Selezionare la casella 'R', immettere 1 nella prima casella di testo, selezionare il rilascio di adeguate operandum da prima casella a discesa, quindi selezionare 'S2' da S casella a discesa TO.
Nota: L'evento creato può leggere simile a [R (selezionata) Dopo $ [1] Attivo GO P = 100%, AL S2]. Questo passaggio garantisce che al rilascio del operandum(indicato dalla parentesi di cui sopra), che lo Stato sta rientrò, ripristinando così la soglia di timeout di sessione (4.4.9.4). A questo punto, lo Stato esce quando il rapporto progressivo contenuto nella lista è completata (Punto 4.4.9.2) o la sessione scade (Fase 4.4.9.4). Pertanto, ogni volta che viene attivato il operandum, conta verso il rapporto progressivo. . E, ogni volta che il operandum è inattivato, ad esempio, la leva viene rilasciata o poke naso si esce, la soglia di timeout di sessione (Step 4.4.9.4) viene resettato figura 2 rappresenta tutte le transizioni programmate per 'S2 - PR risponde.. '
Figura 2. Programmazione Rappresentante esempio # 2. Qui, lo stato si esce su uno dei due criteri. L $ è il programma rapporto progressivo creato nel passaggio 4.3. Al programma completion, lo stato uscite di stato 3 (S3). Si noti che questo criterio non ha un R, che permette la programmazione di avanzare piuttosto che ricominciare ad ogni rientro in questo stato. Lo Stato può anche uscire dopo minuti '$' affermare FIN. Questa è la soglia prefissata timeout dopo che la sessione termina se nessuna risposta avviene all'interno di questa finestra. Questo è spiegato ulteriormente nella discussione. Infine, la soglia di timeout di sessione viene reimpostato ad ogni rilascio operandum. Così, '[1]' indica rilascio del operandum '1'.
- Evidenziare 'S3 - PR Rafforzatore e Cue.'
- Seleziona 'Aggiungi Tempo Go To'
- Inserire l'ora e le unità adeguata per stabilire il rinforzo ($), e selezionare 'S4' da TO casella a discesa S.
Nota: L'evento tempo creato può leggere simile a [Dopo $ secondi GO P = 100%, a S4].
- Evidenziare 'S4 - Timeout.'
- Inserire l'ora e le unità opportuno rimanere in uno stato inattivo ($) dopo la consegna rinforzo, e selezionare 'S2' da TO casella a discesa S.
Nota: L'evento tempo creato può leggere simile a [Dopo $ secondi GO P = 100%, AL S2]. Stato 'S4 - Timeout' potrebbe non essere necessaria per tutti i disegni.
Nota: Questo protocollo è ora pronto per essere eseguito.
Representative Results
Qui illustriamo esempi di risultati ottenibili con il procedimento sopra descritto. Indicato prima è una zona tipica che è trasfettata da vettori virali (Figura 3). In generale, un volume di transfettate ~ 1 mm 3 è ottenuta nel tessuto striatale. Il volume della regione trasfettate può essere quantificata attraverso le sezioni seriali utilizzando il metodo di Cavalieri 32 Soprattutto, il volume transfettate dipende da molti fattori quali il tipo di tessuto che viene trasfettato.; sierotipo virale; promotore; frequenza e il volume iniettato; numero di particelle iniettate; iniettato pH; e se reagenti iperosmolari, come mannitolo, sono stati utilizzati. 33,34 Tipicamente, microinject 10 12 particelle / ml, 1 ml / laterali su 10 min, e consentire ulteriori 7 min prima di sostituire otturatori. Inoltre, l'iniettato è generalmente intorno a pH 8. Successivamente, dimostriamo che la motivazione può essere manipolato da una espressione del transgene (Figura 4)o farmacologica microiniezione reagente (Figura 5).
Nella Figura 4, abbiamo espresso un recettore Designer Esclusivamente Attivato da Designer Drugs (DREADDs). La regione del recettore codificante DREADD è stata seguita da una voce sito ribosoma interno e una cassetta mCitrine. Il mCitrine permette comoda visualizzazione delle cellule trasfettate. Il DREADD è stato accoppiato a G proteine eterotrimerica Gαq. Attivazione del DREADD Gαq accoppiamento può stimolare astrociti, 28,35 e il DREADD stesso può essere attivato mediante somministrazione sistemica di clozapina-N-ossido (CNO, 3 mg / kg, ip). 14,22,36 ratti sono stati formati per Leva risponde per l'etanolo rinforzo, dove 3 presse a leva ceduto 1 possibilità di bere durante le sessioni quotidiane 1 hr oltre 60 giorni contigui. Successivamente, i ratti sono stati costretti in astinenza, e DREADDs Gαq accoppiati sono stati espressi in nucleo accumbens astrociti core. Dopo tre settimane di astinenza, la motivazione di auto-ADMI Nister etanolo è stata misurata mediante punto di interruzione. 21,27-30 attivazione del nucleo accumbens astrociti di base, tramite somministrazione sistemica CNO, è diminuita la motivazione di ratti di riprendere etanolo autosomministrazione dopo astinenza rispetto al veicolo. È importante sottolineare che CNO ha avuto alcun effetto in una coorte altrettanto qualificato che esprimeva proteina fluorescente verde al posto del DREADD.
Figura 3. Rappresentante regione striatale ventrale trasfettate da virus microiniezione. Questa immagine illustra la regione di nucleo accumbens astrociti che sono state trasfettate seguendo il metodo di cui sopra. I dati sono ristampati da Bull et al., 13 con l'autorizzazione del titolare del copyright. Dettagli possono essere trovati in tale pubblicazione e il materiale supplementare di accompagnamento.blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Motivazione dei ratti ad auto-somministrarsi l'etanolo è stato ridotto attivando un transgene che era over-espresso in nucleo accumbens astrociti fondamentali. Virus è stato microiniettato e motivazione misurata tramite punto di interruzione dopo aver lasciato una settimana per il virus di esprimere. Il transgene espresso è stato un designer recettore Esclusivamente Attivato da Designer Drugs (DREADDs). Un ANOVA (F (2,30) = 3,29, p = 0,04) seguita da una post-hoc Scheffé rivelato che l'attivazione del DREADD dalla somministrazione sistemica di clozapina-N-ossido (CNO, 3 mg / kg, ip ) ha ridotto significativamente la motivazione di ratti ad auto-somministrarsi etanolo dopo astinenza rispetto al veicolo CNO ha avuto alcun effetto in una coorte altrettanto qualificato che esprimeva Green Fluorescent Protein (GFP) al posto del DREADD. I dati sono ristampati da Bull et al., 13 con l'autorizzazione del titolare del copyright. Dettagli possono essere trovati in tale pubblicazione e il materiale supplementare di accompagnamento.
Figura 5. microiniezione di gap bloccanti giunzione aumentato la motivazione dei ratti di auto-amministrare etanolo dopo astinenza Due bloccanti divario di giunzione sono stati valutati per il loro effetto sulla motivazione (misurata tramite punto di interruzione) di ratti di auto-amministrare etanolo:. Meflochina e 18- alfa-glicirretico acida (18-α). Una ANOVA a due vie ha rivelato che la microiniezione di bloccanti gap-junction nel nucleo accumbens nucleo ha aumentato la motivazione dei ratti di auto-amministrare etanolo dopo l'astinenza (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). I dati sono ristampati da Bull et al., 13 con l'autorizzazione del titolare del copyright. Dettagli possono essere trovati nella suddetta pubblicazione eil materiale supplementare di accompagnamento.
Discussion
La procedura qui presentata è un mezzo efficace per la fabbricazione di microiniezione cannule e microiniettori che aiuteranno a chiarire i substrati molecolari del comportamento motivato. Questo metodo offre diversi vantaggi. In primo luogo, con la produzione di propri impianti e microiniettori, nuovi parametri sperimentali possono essere rapidamente ottimizzati, cioè, non c'è bisogno di aspettare per i componenti su misura per arrivare. In secondo luogo, a causa del piccolo diametro della cannula, più cannule possono essere impiantati simultaneamente. Questo riduce il tempo chirurgico necessario, che può migliorare la sopravvivenza, e permette anche impianti multipli per animale. In terzo luogo, il software utilizzato per controllare le camere operante accomoda prontamente orari rapporto progressive da un paradigma rapporto fisso può essere rapidamente convertito in un rapporto di paradigma progressista semplicemente applicando un elenco di parametri di transizione evento che contiene la pianificazione di rinforzo desiderato.
Essereampiamente utile, una procedura di microiniezione generico è stato presentato che dovrebbe essere ampiamente applicabile per la microiniezione di quasi qualsiasi reagente attualmente disponibili. Di conseguenza, prevediamo che questa tecnica continuerà ad essere di grande utilità simile in futuro con lievi modifiche. Cambiando solo poche variabili, questo approccio può essere applicato a una vasta serie di reagenti. Parametri che più comunemente manipolabili includono la lunghezza che microinjector sporge dalla cannula, volume di iniezione, e la velocità di iniezione. Ad esempio, si può desiderare l'iniettore di sporgere più lontano dalla punta della cannula per evitare la cicatrice gliale che si forma tipicamente intorno agli impianti croniche. Inoltre, si può desiderare di iniettare un volume maggiore. Per microiniezioni virus striatali, un volume di 1 ml è tipicamente usato e questo volume è tipicamente iniettato in un periodo di tempo più lungo (spesso 7 - 10 min più 3 - 10 min tempo di diffusione supplementare) rispetto a tale usod per i reagenti farmacologiche (in genere 0,3 - 0,5 microlitri oltre 2-3 minuti più 1 - 3 min tempo di diffusione aggiuntivo). L'utente deve consultare la letteratura e / o empiricamente determinare i parametri più adatti per le loro esigenze. Indipendentemente, il successo di questa procedura è criticamente dipendente da 4 variabili: 1) la lunghezza della cannula, 2) Lunghezza microinjector, 3) qualità del modello microinjector spruzzo, e 4) l'integrità del sistema prima dell'iniezione. Poiché posizione microiniezione dipende dalla profondità che microinjector sporge dalla cannula, è imperativo che entrambe le cannule (Fase 1.2.8) e lunghezza microinjector (post-piegatura, Step 2.2.1) sono entrambi noti ed uniforme precisamente tra tutti i soggetti . Questo può essere facilmente controllato da prontamente rifiutando qualsiasi attrezzo che non è la lunghezza desiderata al ri-misurazione finale. Inoltre, la posizione di iniezione può essere previsto solo se si verifica immediatamente sotto la cannula guida. Pertanto, qualsiasi microinjector che does Non spruzzare un lungo, ruscello un'ammenda di prova (punti 2.4.6) devono essere respinti. Un'iniezione qualità è anche legato alla integrità del sistema prima dell'iniezione. Se dopo l'erogazione tutta l'acqua dall'iniettore (prima del riempimento con reagente) punti multipli sono notati in laboratorio pulire, quindi una perdita necessario porre rimedio (Nota sul punto 2.4.8). Inoltre, se la bolla (Fase 2.4.9) che separa il farmaco dall'acqua nel tubo PE20 è non uno, singola bolla (dopo il riempimento della microinjector con il reagente), allora l'iniettore è parzialmente ostruito. Questo zoccolo potrebbe o impedire o deviare l'iniezione. Anche questo può essere facilmente rimediato (nota nel passaggio 2.4.8).
Qualora si volesse microinject mentre l'animale è nel telaio stereotassico ci sono tre alternative. In primo luogo, si potrebbe aumentare la lunghezza del collare microinjector tale da poter essere bloccata dal manipolatore stereotassico e anche estendere quanto basta per consentire il collegamento di tubi PE20. In secondo luogo, ile potrebbe temporalmente impiantare una cannula e utilizzare il microinjector serie qui presentata. In terzo luogo, si potrebbe usare disegnato e pipette di vetro lucido. 16,17
Una limitazione significativa della procedura qui presentata è che è meglio condotta in ratti ben trattati, che hanno familiarità con la procedura. Ratti utilizzati per i dati descritti nella sezione dei risultati richiesta alcuna speciali procedure di manipolazione, perché lo stesso investigatore ratti trattati quotidianamente per più di 2 mesi. Questo comprendeva osservazione quotidiana e manipolazione della protesi chirurgica per almeno 2 settimane. Tuttavia, ratti possono essere rapidamente abituati da una serie di tecniche che vengono utilizzati per prima il test di inibizione pre-impulso, che può essere influenzata da stress. Queste tecniche speciali assuefazione sono state ben descritto in precedenza. 43 Oltre a queste procedure, è opportuno che i ratti sono abituati alla procedura di microiniezione in cui vengono utilizzati microiniettori accorciati duanello iniezioni "sham". Durante queste finte iniezioni, è fondamentale che il microinjector non sporga nel tessuto al fine di limitare i danni ai tessuti. In altre parole, il microinjector dovrebbe essere non più di 14 mm piegato. Così, l'assuefazione approfondita necessaria all'attuazione ottimale di questa tecnica potrebbe essere considerata come una limitazione.
Mentre diversi paradigmi comportamentali esistono per misurare la motivazione, il rapporto progressivo è comunemente utilizzato per quantificare lo sforzo che il soggetto è disposto a esercitare per ottenere un rinforzo. Il rapporto paradigma progressivo produce misura nota come punto di interruzione, che è spesso definito come il numero massimo di presse a leva nell'ultimo rapporto completato;.. Per esempio, la massima risposta che ha generato un rinforzo 21 Il rapporto progressivo è sensibile al rinforzo grandezza. Ad esempio superiore cocaina (o saccarosio) dosi producono un elevato punto di interruzione e cocaina inferiore (o saccarosio) dosi producono una bassa breakpmisto. 21,22 conseguenza, punto di interruzione è un proxy utilizzato di routine per la motivazione e / o rafforzare l'efficacia. 21,23-26 Perché l'intenzione del punto di interruzione è quello di determinare quando l'animale si blocca, un parametro importante del paradigma progressista rapporto è la durata della sessione. Lunghezze sessione finiti può mettere un tappo di falso su valori di breakpoint e questo può essere aggravato da pretrattamenti che anormalmente diminuire il tasso di auto-somministrazione o che post aumento rinforzo pausa. Questo confound può essere superato da qualsiasi numero di approcci,.. Es sessioni che terminano quando l'animale è trattenuto rispondenti, per un multiplo dell'intervallo media inter-infusione 44 Una variante più comunemente applicato di questo approccio è quello di terminare le sessioni volta rispondere ha stato trattenuto da qualche valore empiricamente determinato che si tiene costante tra i soggetti. Abbiamo fornito il metodo per applicare questo approccio nella Fase 4.4.9.11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
References
- Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
- Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
- Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
- Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
- Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
- Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
- Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
- Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
- Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
- McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
- Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
- Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
- Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
- Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
- Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
- Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
- Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
- Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
- Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
- Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
- Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
- Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
- Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
- Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
- Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
- Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
- Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
- Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
- Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
- Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).
